CN109001335B

CN109001335B - 用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法

Info

Publication number: CN109001335B
Application number: CN201811067576.4A
Authority: CN
Inventors: 韩香凝; 刘代成
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2038-09-13
Also published as: CN109001335A

Abstract

本公开涉及一种用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法，该方法包括：(1)对南极磷虾进行预处理：将南极磷虾进行冷冻干燥处理，然后研磨粉碎，再采用甲醇、乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂进行提取，提取后，采用酶和碱进行水解，水解后，采用HLB固相萃取柱‑NH₂柱和QuEChERS萃取柱对水解液进行净化，得到待检测液；(2)采用超高液相色谱‑质谱方法对待检测液进行检测。本公开检测时间短，检测效率高，检出限低，可以达到高效、简便的检测基质中激素的含量。

Description

用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法

技术领域

本公开属于食品分析和化学分析领域，具体涉及一种用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

类固醇激素的种类包括雌激素、雄激素、孕激素、糖皮质激素、盐皮质激素等。目前，对于激素的分析主要是色谱分析，由于激素的性质差异较大，而且多数极性大，不易挥发，用气相色谱分析目标物需要柱前衍生而使前处理的步骤过于繁琐，液相色谱能够有效的分离各个组分，更适合对极性差别大的组分进行分析，灵敏度高，选择性好，适合于检测低浓度的样本。但由于很多激素的化学结构十分相近，利用高效液相色谱-质谱难于短时间内将它们完全分离。

性激素被广泛的应用于动物养殖业，其在促进畜禽生长和提高饲料转化率的同时也带来了动物源性食品中残留兽药的风险。在人类的医疗和生活中，也存在性激素和糖皮质激素的滥用问题，其中糖皮质激素的临床应用最广范。在自然界激素无处不在，又威胁着动物的生存和人类的健康。南极磷虾是重要的饲料以及开发保健品的原料，南极磷虾中激素的残留问题将是一个重要的食品安全的考察方面,而南极磷虾中尚未有激素残留检测的一套系统的方法，而且南极磷虾中脂类尤其是虾青素的含量十分高，对于痕量激素的检测带来了很大的问题，因此，建立一种能够同时检测南极磷虾中性激素、糖皮质激素、盐皮质激素等的类固醇激素检测方法十分重要，对于对南极磷虾食品、保健品以及南极磷虾饲料的安全性评估等都有重要意义。

发明内容

针对上述技术存在的问题，本公开提供一种操作简便、可靠、快速、准确的用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法。

本公开是通过以下技术方案实现的：

一种用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法，该方法包括：

(1)对南极磷虾进行预处理：将南极磷虾进行冷冻干燥处理，然后研磨粉碎，再采用甲醇、乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂进行提取，提取后，采用酶和碱进行水解，水解后，采用HLB固相萃取柱-NH₂柱和QuEChERS萃取柱对水解液进行净化，得到待检测液；

(2)采用超高液相色谱-质谱方法对待检测液进行检测。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

本公开探索了17种类固醇激素的超高效液相色谱-质谱扫描检测方法，17种激素中包含雌激素、雄激素、孕激素、糖皮质激素、盐皮质激素，涉及到了性质不同的各种类固醇激素。以往的检测技术或者只检测性激素，或者只检测糖皮质激素，没有涉及到这么多种类和不同结构的激素的同时检测。此发明对于性质差别很大的类固醇激素进行一次上样检测，避免了需要分开检测，且此方法检测效果好，检测时间短，检出限低，对于食品安全中激素的控制具有重要的意义。

本公开检测时间短，检测效率高，可以达到高效、简便的检测基质中激素的含量。

本公开对于南极磷虾中的类固醇激素的检测效果进行了验证，南极磷虾是一种富含脂的海洋生物，且虾青素含量十分丰富，该方法有效的检测了南极磷虾中的17种类固醇激素，对于南极磷虾产品以及饲料的食品安全的控制具有重要的意义。是一种有效的检测南极磷虾中性质不同的类固醇激素的有效方法。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为17种激素上样检测得到的超高效液相色谱-质谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，南极磷虾中尚未有激素残留检测的一套系统的方法，而且南极磷虾中脂类尤其是虾青素的含量十分高，对于痕量激素的检测带来了很大的问题，为了解决如上的技术问题，本公开提出了一种用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法，该方法包括：

(1)对南极磷虾进行预处理：采用甲醇、乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂，提取后，采用酶和碱进行水解，水解后，再采用HLB固相萃取柱-NH₂柱和QuEChERS萃取柱对水解液进行净化，得到待检测液；

(2)采用超高液相色谱-质谱方法对待检测液进行检测。

在本公开的一个或一些实施方式中，所述17种类固醇激素为雌三醇、可的松、丙酸睾酮、醋酸甲地孕酮、己酸孕酮、醋酸可的松、地塞米松、诺龙、泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇、孕酮、氢化可的松、己烯雌酚和炔诺酮。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(1)中，南极磷虾进行冷冻干燥处理的温度为-10℃至-50℃。

本公开采用冷冻干燥进行处理能够有效避免南极磷虾中活性成分的损失，可以去除水分会对提取有影响，进一步的，所述冷冻干燥的温度为-40℃。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(1)中，将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎，是为了增大南极磷虾与提取溶剂及水解剂的接触面积，使水解充分，使提取充分，本公开进行的粉碎处理，可以显著增加提取效率。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(1)中，提取溶剂提取的具体方法为：

首先将粉碎后南极磷虾采用甲醇进行提取，提取后获得甲醇上清液和甲醇沉淀物；然后将甲醇沉淀物采用乙酸乙酯进行提取，提取后获得乙酸乙酯上清液和乙酸乙酯沉淀物；再将乙酸乙酯沉淀物采用乙腈进行提取，提取后获得乙腈上清液和乙腈沉淀物，最后合并甲醇上清液、乙酸乙酯上清液和乙腈上清液获得提取液。

进一步的，采用甲醇涡旋提取，重复提取一～三次。甲醇能够提取出雌三醇、孕酮和氢化可的松，又不会提取出其他的杂质，采用涡旋提取，提取方式简单，提取效率高，每次涡旋提取1-3min，进一步的，涡旋提取时间为每次涡旋2min，重复提取一次。

采用乙酸乙酯涡旋提取，重复提取一～三次。乙酸乙酯能够提取出可的松、丙酸睾酮、醋酸甲地孕酮、己酸孕酮、醋酸可的松、地塞米松、诺龙、醛固酮、睾酮和雌二醇，又不会提取出其他的杂质，采用涡旋提取，提取方式简单，提取效率高，每次涡旋提取1-3min，更进一步的，涡旋提取时间为每次涡旋2min，重复提取一次。

采用乙腈涡旋提取，重复提取一～三次。乙腈能够提取出泼尼松龙，又不会提取出其他的杂质，采用涡旋提取，提取方式简单，提取效率高，每次涡旋提取1-3min，优选的时间为每次涡旋2min，重复提取一次。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(1)中，提取后，首先采用酶解方式进行水解，获得酶解液，然后将酶解液再采用NaOH缓冲液进行水解，获得水解液。

进一步的，采用β-葡糖苷酸酶进行酶解，酶解条件：35～40℃酶解10～14h；更进一步的，37℃恒温振荡器中酶解12h。酶水解能够水解结合态的泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇。

进一步的，所述氢氧化钠缓冲液为pH＝11.5～12.5的氢氧化钠溶液；更进一步的，所述pH＝12。采用pH＝12的氢氧化钠缓冲液水解结合态的雌三醇、可的松、丙酸睾酮、醋酸甲地孕酮、己酸孕酮、醋酸可的松、地塞米松、诺龙、孕酮、氢化可的松，水解时间短，且能够完全水解结合态的雌三醇。

更进一步的，采用氢氧化钠缓冲液涡旋提取，涡旋后进行离心，涡旋时间1-4min，进一步的，时间为2min；离心转数为4000～5000r/min，离心时间为5～10min，进一步的，离心转数为4000r/min，离心时间为5min。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(1)中，水解液首先采用HLB固相萃取柱-NH₂柱进行净化，再采用QuEChERS萃取柱进行净化。

所述HLB固相萃取柱的填料为亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。

所述QuEChERS固相萃取柱的填料可以是由50mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、50mgC₁₈和150mg MgSO₄组成。

本发明人知晓，南极磷虾体内脂含量及虾青素(即3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素)含量十分高，提取物呈鲜艳红色，易溶于有机溶剂，而南极磷虾中的类固醇激素类物质与脂和虾青素同样是脂溶性物质，南极磷虾中高含量的脂肪和虾青素极大的影响了类固醇激素类物质的提取富集，本发明人为降低脂含量及虾青素的影响，经过试验验证，本发明人首先排除了对南极磷虾脂肪和虾青素有较好提取效果以及同时对目标物造成较大损失的有机溶剂，比如乙醚、石油醚、丙酮、氯仿、环己烷、正己烷等等，其次排出了提取后杂质太多、进而影响目标物提取富集效果的有机溶剂，比如乙醇、苯甲醇等，而发现甲醇、乙腈和乙酸乙酯对南极磷虾脂肪、虾青素的提取效果相对较差(根据提取物颜色可快速判断)，同时对类固醇激素类物质具有良好的提取效果，所以为高效提取类固醇激素类物质本发明人选取甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为候选提取溶剂。以甲醇、乙腈和乙酸乙酯分别作为提取溶剂对南极磷虾进行提取，发明人发现每种有机溶剂对特定的某些类固醇激素类物物质的提取效果非常明显。之后研究了溶剂的提取顺序对提取效果的影响，发现不同提取顺序对提取效果具有较大的影响，经试验验证，本公开按照甲醇、乙酸乙酯和乙腈依次提取，提取效果最好。经溶剂提取后，本发明人还发现溶剂提取后的沉淀物中含有大量的与蛋白质呈结合态的类固醇激素物质，所以发明人采用酶解和碱解的方式进行水解结合态的类固醇激素物质，首先选择酸性水解酶β-葡糖苷酸酶酶解出大量结合态泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇、在孕酮、氢化可的松和雌三醇等，然后采用碱水解的方式，水解出大量剩余的其他类固醇激素物质，以进一步提高类固醇激素物质含量。然后发明人进一步研究，发现采用上述溶剂提取和水解后，提取液中还含有大量的有机酸和色素等杂质，为进一步提高检测的准确性，发明人采用HLB固相萃取柱-NH₂柱和QuEChERS萃取柱进行净化和除杂，除去影响检测准确性和稳定性的杂质。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(2)中，通过对甲醇、乙腈、水、甲酸水等作为流动相进行超高效液相条件的摸索，首先采用甲醇和乙腈作为流动相，之后采用甲醇水，最后采用甲醇，甲酸水作为流动相，得到的较优的超高效液相色谱的条件如下：流动相条件为：A相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，B相为甲醇，进一步的，A相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3mL/min，进一步的，流速为0.2mL/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相A 20％→30％，流动相B80％→70％；8～10min，流动相A 30％→35％，流动相B70％→65％。

色谱柱：Acchrom Unitary C₁₈柱，2.1mm×150mm，粒径5μm。柱温：30～35℃，进一步的，柱温为30℃，样品温度10～15℃，进一步的，样品温度为10℃，进样体积10μL。

在本公开的一个或一些具体实施方式中，步骤(2)中，通过对标准品进行进样，确定每个激素的质谱条件。采用响应信号最大的离子作为之后的定量离子，得到了每个激素标准品的定性、定量离子，确定了检测的质谱条件。

最终的质谱条件确定如下：电喷雾离子源，多反应离子检测模式(MRM)，电离电压3.5kV(ESI+)，电离电压3.0kV(ESI-)，毛细管温度350℃，蒸汽温度300℃，脱溶剂气(N₂)，脱溶剂气流量800L/h；其它参数见表1。

表1 ESI+离子模式和ESI-离子模式下的质谱参数.

子离子：划线离子被用做定量分析。

本公开方法还包括17种类固醇激素的标准品绘制标准曲线，并由此标准曲线计算待测南极磷虾中17种类固醇激素的含量。具体方法是：

17种类固醇激素标准品储备液的制备：精确称取各个类固醇激素的标准品，用甲醇溶解，并定容，使用时用甲醇稀释上述标准储备液，配置成不同梯度浓度的标准溶液；用上述条件进行超高效液相色谱-质谱检测。得到每个激素的标准曲线，并确定线性范围。

将待测样品，进样测定；用线性方程对样品进行定量，样品中的物质的响应值应在仪器检测的线性范围内，实现定量检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1色谱质谱条件的优化

本公开中超高效液相色谱条件流动相的选择，考察了甲醇，水；甲醇，乙腈；甲醇，甲酸水作为洗脱剂的洗脱效果，甲醇，水的分离效果不好，后来采用甲醇、乙腈作为流动相，发现几乎所有激素都在3min内出峰，且都很难分开，之后采用甲醇、0.1％甲酸水作为流动相，发现采用一个梯度分离效果不好，经过不断调节流动相，发现甲醇和0.1％的甲酸水采用梯度分离的效果较好，并能在9min之内完全出峰，最后确定为检测十七种类固醇激素的流动相。

流速的选择，考虑到流速越大，离子化的效率越低，一般流量的选择会在0.1mL/min-0.3mL/min之间，灵敏度较为理想，同时，流速还应该适应所选择的色谱柱，选择适当的流量才会有较好的分离效率，为了兼顾离子化的效率和色谱柱的分离效率，流速最终设定为0.2mL/min。

质谱条件的摸索，根据激素的相对分子质量及结构式对质谱条件进行摸索和优化，利用流动注射泵连续进样，在正离子和负离子模式下进行全扫描，选择合适的分子离子峰和电离方式，探索响应信号最高的子离子，并确定定量离子。雌激素采用负离子模式，孕激素，雄激素，糖皮质激素和盐皮质激素主要采用正离子模式进行电离。并确定碰撞能，特征离子。确定最佳检测质谱条件。

综上，确定最佳的色谱条件为：

色谱柱：Acchrom Unitary C₁₈柱，2.1mm×150mm，粒径5μm。柱温：30℃，样品温度10℃，进样体积10μL。流动相条件为：A相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，B相为甲醇，进一步的，A相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3mL/min，进一步的，流速为0.2mL/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相A 20％→30％，流动相B80％→70％；8～10min，流动相A30％→35％，流动相B70％→65％。流速为0.2mL/min。

质谱条件为：

电喷雾离子源，多反应离子检测模式(MRM)，电离电压3.5kV(ESI+),电离电压3.0kV(ESI-)。毛细管温度350℃，蒸汽温度300℃，脱溶剂气(N₂)，脱溶剂气流量800L/h；其它参数见表1。

实施例2定量和定性检测样品

1、样品前处理

将500g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。

向研磨粉碎后的南极磷虾加入500ml甲醇，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得甲醇上清液和甲醇沉淀物；然后向甲醇沉淀物中加入500mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙酸乙酯上清液和乙酸乙酯沉淀物；再向乙酸乙酯沉淀物加入500mL乙腈，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙腈上清液和乙腈沉淀物，最后合并甲醇上清液、乙酸乙酯上清液和乙腈上清液获得提取液。

向上述提取液中加入2.5mLβ-葡糖苷酸酶(10000U/mL)，控制pH为5.2，于37℃恒温振荡器中酶解12h；向酶解液中加入pH＝12的氢氧化钠缓冲液250mL，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液。

将所得上清液采用50mL甲醇和水的混合溶液(甲醇和水的体积比为1：1)复溶，采用HLB固相萃取柱-NH₂柱净化，具体的净化方式为：首先采用6mL水和6mL甲醇冲柱，放入样品后，用6mL水冲柱，之后接NH₂柱，用8mL甲醇冲柱洗脱，收集洗脱液，浓缩至50mL，过0.2μm有机滤膜，得滤液。滤液采用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用50mL甲醇、乙酸乙酯和乙腈混合溶液(体积比为1：1：1)复溶，过0.2μm滤膜。

2、定量方法的线性关系及检出限

17种激素标准品储备液的制备：精确称取10mg各个激素的标准品，用甲醇溶解，并定容至10mL，使每个激素的初始浓度为1mg/mL，于-20℃保存,使用时用甲醇稀释上述标准储备液，配置成不同梯度浓度的标准溶液。

将所配置的激素混合标准品的储备液配置成1μg/L,10μg/L,50μg/L，100μg/L，200μg/L，250μg/L，300μg/L，500μg/L的梯度标准品溶液，用实施例1中所述条件进行超高效液相色谱-质谱检测。得到每个激素的标准曲线，并确定线性范围，见表2。图1为17种激素上样检测得到的超高效液相色谱-质谱图。

检测限和定量限的确定：根据3倍信噪比和10倍信噪比，确定检测限和定量限。见表2。

表2各个激素化合物的线性方程、线性范围，检测限和定量限。

实施例3

将10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。

向研磨粉碎后的南极磷虾加入10ml甲醇，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得甲醇上清液和甲醇沉淀物；然后向甲醇沉淀物中加入10mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙酸乙酯上清液和乙酸乙酯沉淀物；再向乙酸乙酯沉淀物加入10mL乙腈，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙腈上清液和乙腈沉淀物，最后合并甲醇上清液、乙酸乙酯上清液和乙腈上清液获得提取液。

向上述提取液中加入50μLβ-葡糖苷酸酶(10000U/mL))，控制pH为5.2，于37℃恒温振荡器中酶解12h；向酶解液中加入pH＝12的氢氧化钠缓冲液5mL，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液。

将所得上清液采用1mL甲醇和水的混合溶液(甲醇和水的体积比为1：1)复溶，采用HLB固相萃取柱-NH₂柱净化，具体的净化方式为：首先采用6mL水和6mL甲醇冲柱，放入样品后，用6mL水冲柱，之后接NH₂柱，用8mL甲醇冲柱洗脱，收集洗脱液，浓缩至1mL，过0.2μm有机滤膜，得滤液。滤液采用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用1mL甲醇、乙酸乙酯和乙腈混合溶液(体积比为1：1：1)复溶，过0.2μm滤膜。

用实施例1中的超高效液相色谱条件、质谱条件和实施2中的线性关系进行检测，检测得到了其中的14种，每种得到的南极磷虾中的含量见下表。

实施例4

将20g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。

向研磨粉碎后的南极磷虾加入20ml甲醇，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得甲醇上清液和甲醇沉淀物；然后向甲醇沉淀物中加入20mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙酸乙酯上清液和乙酸乙酯沉淀物；再向乙酸乙酯沉淀物加入20mL乙腈，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙腈上清液和乙腈沉淀物，最后合并甲醇上清液、乙酸乙酯上清液和乙腈上清液获得提取液。

向上述提取液中加入100μLβ-葡糖苷酸酶(10000U/mL)，控制pH为5.2，于37℃恒温振荡器中酶解12h；向酶解液中加入pH＝12的氢氧化钠缓冲液10mL，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液。

将所得上清液采用2mL甲醇和水的混合溶液(甲醇和水的体积比为1：1)复溶，采用HLB固相萃取柱-NH₂柱净化，具体的净化方式为：首先采用6mL水和6mL甲醇冲柱，放入样品后，用6mL水冲柱，之后接NH₂柱，用8mL甲醇冲柱洗脱，收集洗脱液，浓缩至2mL，过0.2μm有机滤膜，得滤液。滤液采用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用2mL甲醇、乙酸乙酯和乙腈混合溶液(体积比为1：1：1)复溶，过0.2μm滤膜。

实施例5

将30g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。

向研磨粉碎后的南极磷虾加入30ml甲醇，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得甲醇上清液和甲醇沉淀物；然后向甲醇沉淀物中加入30mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙酸乙酯上清液和乙酸乙酯沉淀物；再向乙酸乙酯沉淀物加入30mL乙腈，涡旋提取2min，重复提取1次，合并上清液，提取后获得乙腈上清液和乙腈沉淀物，最后合并甲醇上清液、乙酸乙酯上清液和乙腈上清液获得提取液。

向上述提取液中加入150μLβ-葡糖苷酸酶(10000U/mL)，控制pH为5.2，于37℃恒温振荡器中酶解12h；向酶解液中加入pH＝12的氢氧化钠缓冲液15mL，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液。

将所得上清液采用3mL甲醇和水的混合溶液(甲醇和水的体积比为1：1)复溶，采用HLB固相萃取柱-NH₂柱净化，具体的净化方式为：首先采用6mL水和6mL甲醇冲柱，放入样品后，用6mL水冲柱，之后接NH₂柱，用8mL甲醇冲柱洗脱，收集洗脱液，浓缩至3mL，过0.2μm有机滤膜，得滤液。滤液采用QuEChERS固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用3mL甲醇、乙酸乙酯和乙腈混合溶液(体积比为1：1：1)复溶，过0.2μm滤膜。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims

1.一种用于测定南极磷虾中17种类固醇激素的方法，其特征是，该方法包括：

（1）对南极磷虾进行预处理：将南极磷虾进行冷冻干燥处理，然后研磨粉碎，再采用甲醇、乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂进行提取，提取后，采用酶和碱进行水解，水解后，采用HLB固相萃取柱-NH₂柱和QuEChERS萃取柱对水解液进行净化，得到待检测液；

（2）采用超高效液相色谱-质谱方法对待检测液进行检测；

所述17种类固醇激素为雌三醇、可的松、丙酸睾酮、醋酸甲地孕酮、己酸孕酮、醋酸可的松、地塞米松、诺龙、泼尼松龙、醛固酮、睾酮、雌二醇、孕酮、氢化可的松、己烯雌酚、炔诺酮和雄酮；

步骤（1）中，提取溶剂提取的具体方法为：

首先将粉碎后南极磷虾采用甲醇进行提取，提取后获得甲醇上清液和甲醇沉淀物；然后将甲醇沉淀物采用乙酸乙酯进行提取，提取后获得乙酸乙酯上清液和乙酸乙酯沉淀物；再将乙酸乙酯沉淀物采用乙腈进行提取，提取后获得乙腈上清液和乙腈沉淀物，最后合并甲醇上清液、乙酸乙酯上清液和乙腈上清液获得提取液；

步骤（2）中，超高效液相色谱的条件如下：

流动相条件为：A相为0.1~0.2v/v%的甲酸水溶液，B相为甲醇；

梯度洗脱程序如下：0~8min，流动相A 20%→30%，流动相B80%→70%；8~10min，流动相A30%→35%，流动相B70%→65%；

色谱柱：C₁₈柱，2.1mm×150mm，粒径5μm；柱温：30~35℃ 。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）中，南极磷虾进行冷冻干燥处理的温度为-10℃ 至-50℃ ；

将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：采用甲醇涡旋提取，重复提取一~三次，每次涡旋提取1-3min；

采用乙酸乙酯涡旋提取，重复提取一~三次，每次涡旋提取1-3min；

采用乙腈涡旋提取，重复提取一~三次，每次涡旋提取1-3min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）中，提取后，首先采用酶解方式进行水解，获得酶解液，然后将酶解液再采用NaOH缓冲液进行水解，获得水解液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是：采用β-葡糖苷酸酶进行酶解，酶解条件： 35~40℃酶解10~14h；

氢氧化钠缓冲液为pH=11.5~12.5的氢氧化钠溶液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）中，水解液先采用HLB固相萃取柱-NH₂柱进行净化，再采用QuEChERS萃取柱进行净化。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是：A相为0.1 v/v %的甲酸水溶液；流速为0.2~0.3mL/min。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是：流速为0.2mL/min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征是：柱温为30℃ ，样品温度10~15℃ 。

10.如权利要求9所述的方法，其特征是：样品温度为10℃ ，进样体积10μL。

11.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，质谱条件如下：电喷雾离子源，多反应离子检测模式，电离电压3.5 kV，电离电压 3.0 kV ，毛细管温度350℃，蒸汽温度300℃，脱溶剂气为N₂，脱溶剂气流量800L/h。