CN111879862B - 一种gc-ms-ssdmc法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法 - Google Patents
一种gc-ms-ssdmc法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种GC‑MS‑SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，包括，样品的提取、净化、衍生化、过滤及转换因子的计算。本发明实现了油料作物及食用油中菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝烯醇，24‑亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷的同时定性定量分析，检测步骤简单，准确性高，灵敏度高，重复性好，适合批量检测，提高了检测效率，对指导食用油加工及其合理膳食利用提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于油料作物及食用油活性成分的提取及测定技术领域，具体涉及到一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法。
背景技术
游离态植物甾醇作为一种天然活性物质，因有与胆固醇非常相似的结构，在体内可替代胆固醇分子在胆汁酸胶束中的位置，从而发挥良好的降胆固醇功效。除了降胆固醇作用，游离态植物甾醇还具备抗炎，抗氧化，调节身体糖脂代谢，改善神经退行性疾病症状等生理活性。植物甾醇糖苷是游离态植物甾醇的一种衍生物，研究发现其具备一定的降胆固醇及抗炎作用，但近年来的研究发现，植物甾醇糖苷也具备一定的神经毒性，可引起神经元变性、死亡及运动行为缺陷等症状。
食用油作为人类日常饮食不可缺少的一部分，是人类膳食植物甾醇的重要来源，各类油料作物作为食用油的主要来源，需经历不同的制油工艺方可达到可食用标准，不同制油工艺亦会对其内植物甾醇等活性物质含量及比例等造成一定影响，因此准确便捷地测定各类油料作物及食用油中游离态植物甾醇及甾醇糖苷的含量对更加合理加工各类油料作物及更加合理摄入食用油具有重要意义。
目前，国内外针对油料作物及食用油中植物甾醇的检测大多都需经历碱水解步骤，利用GC或GC-MS等分析设备，采用内标法用于计算总植物甾醇含量，这种方法通常未计入植物甾醇糖苷，且水解这一处理步骤会使大量植物甾醇酯水解成游离态植物甾醇，导致无法得知具体游离态植物甾醇的含量。也有研究通过预先利用柱色谱或平板分离的方式将各类植物甾醇预先分离，在各自进行水解，最后利用GC或GC-MS进行检测，该类方法由于需要预先将各目标物分离，因此在该过程中选取合适的洗脱剂或展开剂非常重要，但也非常繁琐及耗时，此外由于同样经历酸/碱水解步骤，无法得知甾醇复合物如甾醇糖苷的原本信息，只能得到其甾醇部分的信息。故现有方法由于需要经历水解步骤，不但繁琐且会使各物质原本信息丢失，某些成分结构发生改变，且不同形态植物甾醇的测定均需要独立进行的。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，包括，称取磨粉后的油料作物，加入内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入氯仿与甲醇混合溶剂，超声提取2次，过滤，将滤液保留，滤渣再用正己烷进行同样的超声提取处理1次，合并提取液，并用旋蒸结合氮吹以除去其内有机溶剂，得提取目标物；
将提取目标物依次进行净化、衍生化和过滤后，注入进样瓶中待测；
将待测样品注入GC-MS中进行分析，对总离子流色谱图TIC中各目标物的特征离子进行提取，得到目标物的提取离子色谱图EIC，对EIC中各目标物的峰面积进行积分，并按以下公式计算各目标物的浓度：
其中，F：转换系数；RS:5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；CS:5α-胆甾烷醇浓度；RX:目标物在EIC中的峰面积；CX：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度；
其中，所述转换系数，其计算方法为：用氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂分别配置5α-胆甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行稀释，用氮气吹干溶剂，进行衍生化处理，吹干衍生化试剂后重新溶于色谱级正己烷中，待测，按以下公式计算游离态甾醇及甾醇糖苷相对5α-胆甾烷醇转换系数的平均值：
其中，所述目标物包括游离态甾醇和甾醇糖苷，所述游离态甾醇为：菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇，所述甾醇糖苷为：菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述称取磨粉后的油料作物，所述油料作物为先经真空冷冻干燥48h，再用磨粉机磨成细粉。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述加入内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入氯仿与甲醇混合溶剂，超声提取2次；其中，内标物5α-胆甾烷醇溶液配制方法为将5α-胆甾烷醇粉末用甲基叔丁基醚配制成1mg/mL溶液；氯仿与甲醇混合溶剂体积比例为2:1；超声提取条件为，在100W超声功率下37℃恒温提取30min。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述获得提取目标物过程中，油料作物与提取溶剂按照g/mL的料液比比值为1:5。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述提取目标物依次进行净化，其步骤为：将提取目标物溶于氯仿甲醇混合溶剂中，取重新溶解后的溶液置于完成活化的硅胶固相萃取小柱SPE顶端，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，并用氮气除去其中的有机溶剂，得净化后产物；其中，氯仿甲醇混合溶剂中氯仿甲醇体积比为2:1，提取物重新溶解后浓度为10mg/mL。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述用洗脱液进行洗脱，洗脱方法为，取1mL溶液用2mL氯仿甲醇2:1，v/v，进行洗脱；所述SPE柱规格为500mg/mL，SPE活化方法为，用10mL氯仿甲醇2:1，v/v，分2次淋洗小柱。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述用氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂配置5α-胆甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行稀释，得到稀释后的5α-胆甾烷醇浓度为3.05-780μg/mL，菜油甾醇浓度为1.04-266.42μg/mL，豆甾醇浓度为1.02-260.88μg/mL，谷甾醇浓度为1.22-312.36μg/mL，环木菠萝稀醇浓度为1.71-438.83μg/mL，24-亚甲基环木菠萝烷醇浓度为2.02-516.60μg/mL，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为0.75-95.64μg/mL，豆甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为0.57-73.52μg/mL，谷甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为1.27-162.15μg/mL。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述衍生化，取净化后所得产物置于小玻璃瓶中用衍生化试剂BSTFA-TMCS 99:1，v/v，进行70℃水浴1h，衍生化结束后将衍生化试剂用氮吹除去。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述GC-MS法，其中，
气相色谱GC条件：采用DB-5HT，30m×0.25mm×0.1μm，毛细管柱；进样量：1μL；分流比：1：10；载气：He；流速：1.0mL/min；进样口温度：310℃；程序升温条件：200℃保持1min，以10℃/min升至340℃，保持3min，再以2℃/min升至370℃，保持12min；
质谱MS条件：EI离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围：50-900m/z；扫描模式：全扫描；EIC提取离子色谱图下提取的定量离子质荷比：5α-胆甾烷醇：370，菜油甾醇：382，豆甾醇：394，谷甾醇：396，环木菠萝稀醇：408，24-亚甲基环木菠萝烷醇：422，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷：383，豆甾醇吡喃葡萄糖苷：395，谷甾醇吡喃葡萄糖苷：397。
作为本发明所述所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法的一种优选方案，其中：所述油料包括米糠。
本发明有益效果：
(1)本发明提供一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，实现了油料作物及食用油中菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝烯醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷、谷甾醇吡喃葡萄糖苷的同时定性定量检测，检测步骤简单，准确性高，灵敏度高，重复性好，适合批量检测，提高了检测效率。
(2)现有技术需要先进行水解，使甾醇酯、甾醇糖苷等甾醇复合物全部转化为游离态植物甾醇，再利用GC-MS检测，采用普通分离甾醇的色谱柱如DB-5MS等无法达到其分离温度，而使用液相色谱(LC)无法达到较好的分离程度。本发明利用高温色谱柱DB-5HT，其最高可分析温度为400℃，不需对目标物进行水解即可分析，避免了目标物天然信息的丢失，物质转化等问题，且可同时分析游离态甾醇及甾醇糖苷，不需分开检测。
(3)现有技术也可先通过柱色谱等分离方式预先将游离态甾醇、甾醇糖苷等分离，再分别利用GC或LC进行分析，但在预分离中，将目标物利用洗脱液从色谱柱上分离出来这一步骤中，需对不同目标物采用不同量的不同洗脱液分次洗出，使得该步骤复杂耗时，消耗较多溶剂，洗脱剂选择不恰当往往导致分离失败。本发明通过使用氯仿与甲醇2:1混合溶剂配合硅胶SPE小柱对目标物进行净化，一次洗脱即可达到分析要求，简单省时。同时，现有技术虽可以测糖苷，如使用液相色谱(LC)法，或GC-MS法，但LC分离情况较差，存在色谱峰较难分离的情况，GC-MS法需要先将糖苷通过较复杂的前处理提取出，单独进高温色谱柱如DB-5HT进行检测。本发明是同时检测游离态甾醇及糖苷，而现有技术在测糖苷时无法同时检测到游离态甾醇。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例2中米糠样品测试的总离子流色谱图(TIC)。
图2为本发明实施例2中米糠样品用于定量的提取离子色谱图(EIC)。
图3为本发明实施例2中内标物及各目标物的分子结构图。
图4为本发明实施例4中柱色谱预先分离目标物后GC-MS进行检测图。
图5为本发明实施例5中柱色谱预先分离目标物后GC-MS进行检测图。
图6为本发明实施例6中柱色谱预先分离目标物后GC-MS进行检测图。
图7为本发明实施例7中柱色谱预先分离目标物后GC-MS进行检测图。
图8为本发明实施例8中高效液相色谱(HPLC)目标物甾醇检测图。
图9为本发明实施例8中高效液相色谱(HPLC)目标物葡萄糖苷检测图。
图10为本发明实施中菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇相对5α-胆甾烷醇的转换系数图。
图11为本发明实施中环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇相对5α-胆甾烷醇的转换系数图。
图12为本发明实施中菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷相对5α-胆甾烷醇的转换系数图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
(1)样品前处理
称取磨粉后的油料作物(米糠，普通市售)，置于烧杯中，先向其内加入内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入氯仿与甲醇混合溶剂进行超声提取2次，过滤，将滤液保留，滤渣再用正己烷进行同样的超声提取处理1次，合并提取液，并用旋蒸结合氮吹以除去其内有机溶剂。注食用油不需此步骤。提取所得目标物重新溶于氯仿甲醇混合溶剂，取重新溶解后的溶液置于完成活化的硅胶固相萃取小柱(SPE)顶端，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，并用氮吹除去其中的有机溶剂。净化后所得产物置于小玻璃瓶中用衍生化试剂BSTFA-TMCS 99:1(v/v)进行衍生化处理，衍生化结束后将衍生化试剂用氮吹除去。取衍生化后的产物重新溶于色谱级正己烷中，过有机滤膜，注入进样瓶中待测。
(2)仪器条件
气相色谱(GC)条件：采用DB-5HT(30m×0.25mm×0.1μm)毛细管柱；进样量：1μL；分流比：1：10；载气：He；流速：1.0mL/min；进样口温度：310℃；程序升温条件：200℃保持1min，以10℃/min升至340℃，保持3min，再以2℃/min升至370℃，保持12min。
质谱(MS)条件：EI源离子温度：250℃；传输线温度：280℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围：50-900m/z；扫描模式：全扫描；EIC(提取离子色谱图)定量离子质荷比：5α-胆甾烷醇：370，菜油甾醇：382，豆甾醇：394，谷甾醇：396，环木菠萝稀醇：408，24-亚甲基环木菠萝烷醇：422，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷：383，豆甾醇吡喃葡萄糖苷：395，谷甾醇吡喃葡萄糖苷：397。
(3)转换因子计算
用氯仿与甲醇2:1(v/v)混合溶剂配置5α-胆甾烷醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行系列稀释，得不同浓度梯度溶液，用氮气吹干溶剂，进行衍生化处理，吹干衍生化试剂后重新溶于色谱级正己烷中，待测。
根据公式：
计算各物质相对5α-胆甾烷醇转换系数的平均值，其中F：转换系数；RS:5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；CS:5α-胆甾烷醇浓度；RX:目标物在EIC中的峰面积；CX：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度。
菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷相对5α-胆甾烷醇的转换因子分别在8-130μg/mL,8-130μg/mL,8-160μg/mL,13-220μg/mL,15-260μg/mL,6-50μg/mL,1-65μg/mL,5-90μg/mL范围内保持稳定，其值分别为：0.35,0.68,0.24,0.82,0,69,0.51,0.78,0.50。
(4)将待测样品注入GC-MS中进行分析，对总离子流色谱图TIC中各目标物的特征离子进行提取，得到目标物的提取离子色谱图EIC，对EIC中各目标物的峰面积进行积分，并按以下公式计算各目标物的浓度：
其中，F：转换系数；RS:5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；CS:5α-胆甾烷醇浓度；RX:目标物在EIC中的峰面积；CX：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度。
(5)仪器的检出限(LOD)，方法的定量限(LOQ)
将5α-胆甾烷醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品混合溶液逐步稀释，衍生化后检测，以信噪比(S/N)为3计算仪器的LOD，以信噪比(S/N)为10计算方法的LOQ，见下表1。
表1目标物的LOD与LOQ
(6)回收率及精密度
通过向已知浓度的米糠提取物中加入一定量已知含量的各标准物质，计算各物质的加标回收率，及相对标准偏差(RSD)，5α-胆甾烷醇回收率为98.67％，其余如表2所示。
表2各物质加标回收率
通过在一天内测定3次标准混合液各物质浓度确定该方法日内精密度，以RSD表示。通过每天测定2次并测定连续3天标准混合液各物质浓度确定该方法日间精密度，以RSD表示。结果如表3所示。
表3各物质日间及日内精密度
实施例2
本实施例提供一种GC-MS法同时测定米糠中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，包括：
(1)将米糠原料先经真空冷冻干燥48h，再用磨粉机磨成细粉(过800目筛)，将5α-胆甾烷醇粉末用甲基叔丁基醚配制成1mg/mL溶液。
(2)称取磨粉后的米糠样品2.0000g，置于烧杯中，先向其内加入1mL的1mg/mL内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入9mL氯仿与甲醇2:1(v/v)混合溶剂在100w超声功率下37℃恒温提取30min，该步骤重复2次，过滤，将滤液保留，滤渣再用10mL正己烷进行同样的超声提取处理1次，合并提取液，并用旋蒸结合氮吹以除去其内有机溶剂，得提取目标物。
(3)将步骤(2)中制得的目标物重新溶于10mL氯仿甲醇2:1(v/v)混合溶剂中，提取物重新溶解后浓度为10mg/mL；取重新溶解后的溶液1mL置于完成活化的500mg/6mL硅胶固相萃取小柱(SPE)顶端，用2mL氯仿甲醇2:1(v/v)洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，并用氮吹除去其中的有机溶剂，得净化后产物；其中，所述SPE柱规格为500mg/mL，SPE活化方法为，用10mL氯仿甲醇2:1，v/v，分2次淋洗小柱。
(4)将步骤(3)中净化后所得产物置于小玻璃瓶中用200μL衍生化试剂BSTFA-TMCS99:1(v/v)，在70℃进行衍生化处理水浴1h，衍生化结束后将衍生化试剂用氮吹除去。
(5)取步骤(4)中衍生化后的产物重新溶于色谱级正己烷中，过有机滤膜，注入进样瓶中待测。
(6)将待测样品注入GC-MS中进行分析，气相色谱GC条件：采用DB-5HT，30m×0.25mm×0.1μm，毛细管柱；进样量：1μL；分流比：1：10；载气：He；流速：1.0mL/min；进样口温度：310℃；程序升温条件：200℃保持1min，以10℃/min升至340℃，保持3min，再以2℃/min升至370℃，保持12min；质谱MS条件：EI离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围：50-900m/z；扫描模式：全扫描；EIC提取离子色谱图下提取的定量离子质荷比：5α-胆甾烷醇：370，菜油甾醇：382，豆甾醇：394，谷甾醇：396，环木菠萝稀醇：408，24-亚甲基环木菠萝烷醇：422，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷：383，豆甾醇吡喃葡萄糖苷：395，谷甾醇吡喃葡萄糖苷：397。
对总离子流色谱图TIC中各目标物的特征离子进行提取，得到目标物的提取离子色谱图EIC，对EIC中各目标物的峰面积进行积分，并按以下公式计算各目标物的浓度：
其中，F：转换系数；RS:5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；CS:5α-胆甾烷醇浓度；RX:目标物在EIC中的峰面积；CX：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度；
其中，所述转换系数，其计算方法为：用氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂分别配置5α-胆甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行稀释，用氮气吹干溶剂，进行衍生化处理，吹干衍生化试剂后重新溶于色谱级正己烷中，待测，按以下公式计算游离态甾醇及甾醇糖苷相对5α-胆甾烷醇转换系数的平均值：
其中，所述目标物包括游离态甾醇和甾醇糖苷，所述游离态甾醇为：菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇，所述甾醇糖苷为：菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷。
图1为米糠样品的TIC图，图中1-9标号所代表物质分别为5α-胆甾烷醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷。
图2为米糠样品用于定量的提取离子色谱图(EIC)，图中1-9标号所代表物质分别为5α-胆甾烷醇，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷。图3为本实施中内标物及各目标物的分子结构图。
具体测定结果见表4。
表4
实施例3
取0.4000g米糠油先向其内加入1mL的1mg/mL内标物5α-胆甾烷醇溶液，在用氯仿甲醇2:1(v/v)混合溶剂定容至10mL，混匀，取1mL过硅胶SPE小柱进行净化处理，以后操作步骤如实例2。
具体测定结果见表5。
表5
注：ND表示未检测到。
实施例4
(1)将米糠原料先经真空冷冻干燥48h，再用磨粉机磨成细粉(过800目筛)，将5α-胆甾烷醇粉末用甲基叔丁基醚配制成1mg/mL溶液。
(2)称取磨粉后的米糠样品2.0000g，置于烧杯中，先向其内加入1mL的1mg/mL内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入9mL氯仿与甲醇2:1(v/v)混合溶剂在100w超声功率下37℃恒温提取30min，该步骤重复2次，过滤，将滤液保留，滤渣再用10mL正己烷进行同样的超声提取处理1次，合并提取液，并用旋蒸结合氮吹以除去其内有机溶剂，得提取目标物。
(3)将步骤(2)中制得的目标物重新溶于一定量氯仿甲醇2:1(v/v)混合溶剂中，提取物重新溶解后浓度为10mg/mL；取重新溶解后的溶液1mL置于完成活化的500mg/6mL硅胶固相萃取小柱(SPE)顶端，用2×5mL正己烷：乙醚98:2(v/v)洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，并用氮吹除去其中的有机溶剂，得净化后产物；其中，所述SPE柱规格为500mg/mL，SPE活化方法为，用10mL氯仿甲醇2:1，v/v，分2次淋洗小柱。
(4)将步骤(3)中净化后所得产物置于小玻璃瓶中用200μL衍生化试剂BSTFA-TMCS99:1(v/v)，在70℃进行衍生化处理水浴1h，衍生化结束后将衍生化试剂用氮吹除去。
(5)取步骤(4)中衍生化后的产物重新溶于色谱级正己烷中，过有机滤膜，注入进样瓶中待测。
(6)将待测样品注入GC-MS中进行分析检测(条件同实施例1)，结果见图4。
从图4中可以看出，未将目标物游离态甾醇分离出来，也未见甾醇糖苷。
实施例5
重新加大洗脱剂用量，改用3×5mL 98:2＝正己烷：乙醚洗脱剂,其他步骤同实施例4，GC-MS中进行分析检测结果见图5，游离态甾醇可被预先分离出。
实施例6
在实施例5的基础上用极性较强的2×5mL 5:95＝正己烷：乙酸乙酯+5mL MTBE洗脱剂试图将甾醇糖苷分离出，其他步骤同实施例4。结果见图6，未见甾醇糖苷分离出，反而又出现谷甾醇。
实施例7
用极性较强洗脱剂2×5mL 5:95＝正己烷：乙酸乙酯洗脱，其他步骤同实施例4，如图7，可将菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇分出但无法将两类极性较弱的环木菠萝稀醇及24-亚甲基换木菠萝烷醇洗脱出，同时依旧没有甾醇糖苷被分离出。
实施例8
检验液相色谱对游离态甾醇的分离情况，称取一定量的菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇标准品用氯仿：甲醇2:1(v/v)溶解，使用配有蒸发光检测器的高效液相色谱仪进行检测，使用GP-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，在30℃柱温下检测，流动相为甲醇，流速1mL/min。三种甾醇糖苷的分析方法如游离态甾醇一样。
见图8和图9，可见菜油甾醇，豆甾醇无法成功分离，且分析时间较长，约1h分析完毕，甾醇糖苷分离度很差，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷与豆甾醇吡喃葡萄糖苷无法分开，只能检出2个峰。
用液相面临与用SPE柱预先分离一样的问题，流动相(洗脱剂)选择十分关键，不同游离态甾醇间，不同糖苷间及游离态甾醇与糖苷间具有不同的极性，想要兼顾游离态甾醇与糖苷同时分析，流动相(洗脱剂)的选择及分析时间是两个需要克服的问题，因此选用GC法，物质到达沸点即可出峰，使用高温柱，使得沸点较高的甾醇糖苷也可分析，前处理简单，使用氯仿：甲醇＝2:1洗脱剂，通过一次简单洗脱即可同时将两类目标物完全洗脱出，节省了时间，减轻工作量，适合批量检测。
实施例9
在SSDMC法中，转换系数计算方法为：用氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂配置5α-胆甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行稀释，用氮气吹干溶剂，进行衍生化处理，吹干衍生化试剂后重新溶于色谱级正己烷中，待测。
按以下公式计算游离态甾醇及甾醇糖苷相对5α-胆甾烷醇转换系数的平均值：
其中，F：转换系数；RS:5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；CS:5α-胆甾烷醇浓度；RX:目标物在EIC中的峰面积；CX：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度。
转换系数不是一直恒定的，在一定的浓度范围内可以保持恒定，如图10、图11、图12所示。可以看出，菜油甾醇，豆甾醇，谷甾醇，环木菠萝稀醇，24-亚甲基环木菠萝烷醇，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷，豆甾醇吡喃葡萄糖苷，谷甾醇吡喃葡萄糖苷相对5α-胆甾烷醇的转换因子分别在8-130μg/mL,8-130μg/mL,8-160μg/mL,13-220μg/mL,15-260μg/mL,6-50μg/mL,1-65μg/mL,5-90μg/mL范围内保持稳定，其值分别为：0.35,0.68,0.24,0.82,0,69,0.51,0.78,0.50。
本发明转换系数在一定范围内稳定，在此浓度范围精确度才较佳，所以待测物的浓度也需要调节到该稳定浓度范围内才可利用相应转换系数计算。
一种标准物同时定量多种物质(SSDMC，single standard to determine multi-components)是一种结合内标法(ISM)及外标法(ESM)的定量方式，通常情况下SSDMC以待测目标物中的某一物质为内标物，通过计算其余待测物相对该内标物的转换系数，最终确定各待测物的含量，而被选中内标物的含量需要通过外标法对比标准曲线而得到。外界环境改变对ESM定量准确度影响较大，如由于机器的不稳定造成峰面积的改变会直接影响到定量结果，而ISM恰可补足这一缺陷。本方法通过直接添加一定量的与待测物结构相近的外源内标物到样品中，不需在通过ESM确定内标含量，且该内标物在原有样品中不存在，不会干扰检测，简化操作步骤的同时保证了定量的准确性。
本发明提供一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，实现了油料作物及食用油中菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝烯醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷、谷甾醇吡喃葡萄糖苷的同时定性定量检测，检测步骤简单，准确性高，灵敏度高，重复性好，适合批量检测，提高了检测效率。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，其特征在于：包括，
称取磨粉后的油料作物，加入内标物5α-胆甾烷醇溶液，再加入氯仿与甲醇混合溶剂，超声提取2次，过滤，将滤液保留，滤渣再用正己烷进行同样的超声提取处理1次，合并提取液，并用旋蒸结合氮吹以除去其内有机溶剂，得提取目标物；其中，内标物5α-胆甾烷醇溶液配制方法为将5α-胆甾烷醇粉末用甲基叔丁基醚配制成1mg/mL溶液；氯仿与甲醇体积比例为2:1；超声提取条件为在100W超声功率下37℃恒温提取30min；
将提取目标物依次进行净化、衍生化和过滤后，注入进样瓶中待测；
其中，所述净化为将提取目标物溶于氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂中，得重新溶解后的溶液后，置于完成活化的硅胶固相萃取小柱SPE顶端，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，并用氮气除去其中的有机溶剂，得净化后产物；其中，提取物重新溶解后浓度为10mg/mL；用洗脱液进行洗脱，洗脱方法为，取1mL溶液用2mL氯仿甲醇2:1，v/v，进行洗脱；SPE柱规格为500mg/mL，SPE活化方法为，用10mL氯仿甲醇2:1，v/v，分2次淋洗小柱；
所述衍生化为取净化后所得产物置于小玻璃瓶中用衍生化试剂BSTFA-TMCS 99:1 ，v/v，进行70℃水浴1h，衍生化结束后将衍生化试剂用氮吹除去；
所述过滤为将衍生化后的产物重新溶于色谱级正己烷中，过有机滤膜，注入进样瓶中待测；
将待测样品注入GC-MS中进行分析，对总离子流色谱图TIC中各目标物的特征离子进行提取，得到目标物的提取离子色谱图EIC，对EIC中各目标物的峰面积进行积分，并按以下公式计算各目标物的浓度：
其中，F：转换系数；RS: 5α-胆甾烷醇在EIC中的峰面积；CS: 5α-胆甾烷醇浓度；RX: 目标物在EIC中的峰面积；CX：游离态甾醇及甾醇糖苷浓度；
其中，所述转换系数，其计算方法为：用氯仿和甲醇按体积比为2:1组成的混合溶剂配置5α-胆甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷标准品的混合溶液，进行稀释，得到稀释后的5α-胆甾烷醇浓度为3.05~780μg/mL，菜油甾醇浓度为1.04~266.42μg/mL，豆甾醇浓度为1.02~260.88μg/mL，谷甾醇浓度为1.22~312.36μg/mL，环木菠萝稀醇浓度为1.71~438.83μg/mL，24-亚甲基环木菠萝烷醇浓度为2.02~516.60μg/mL，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为0.75~95.64μg/mL，豆甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为0.57~73.52μg/mL，谷甾醇吡喃葡萄糖苷浓度为1.27~162.15μg/mL，用氮气吹干溶剂，进行衍生化处理，吹干衍生化试剂后重新溶于色谱级正己烷中，待测；
按以下公式计算游离态甾醇及甾醇糖苷相对5α-胆甾烷醇转换系数的平均值：
其中，所述目标物为游离态甾醇和甾醇糖苷，游离态甾醇为菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇和24-亚甲基环木菠萝烷醇，甾醇糖苷为菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷；
其中，菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、环木菠萝稀醇、24-亚甲基环木菠萝烷醇、菜油甾醇吡喃葡萄糖苷、豆甾醇吡喃葡萄糖苷和谷甾醇吡喃葡萄糖苷相对5α-胆甾烷醇的转换系数分别在8~130μg/mL、 8~130μg/mL、 8~160μg/mL、 13~220μg/mL、 15~260μg/mL、6~50μg/mL、1~65μg/mL和 5~90μg/mL范围内保持稳定，其值分别为：0.35、0.68、0.24、0.82、0.69、0.51、0.78和0.50；
GC-MS法，其中，气相色谱GC条件：采用DB-5HT，30m×0.25mm×0.1μm，毛细管柱；进样量：1μL；分流比：1：10；载气：He；流速：1.0mL/min ；进样口温度：310℃；程序升温条件：200℃保持1min，以10℃/min升至340℃，保持3min，再以2℃/min升至370℃，保持12min；质谱MS条件：EI离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；EI能量：70eV；质量数扫描范围：50-900m/z；扫描模式：全扫描；EIC提取离子色谱图下提取的定量离子质荷比：5α-胆甾烷醇：370，菜油甾醇：382，豆甾醇：394，谷甾醇：396，环木菠萝稀醇：408，24-亚甲基环木菠萝烷醇：422，菜油甾醇吡喃葡萄糖苷：383，豆甾醇吡喃葡萄糖苷：395，谷甾醇吡喃葡萄糖苷：397。
2.如权利要求1所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，其特征在于：所述称取磨粉后的油料作物，所述油料作物为先经真空冷冻干燥48h，再用磨粉机磨成细粉。
3.如权利要求1所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，其特征在于：获得提取目标物过程中，油料作物与提取溶剂按照g/mL的料液比比值为1:5。
4.如权利要求1所述GC-MS-SSDMC法同时测定油料中游离态甾醇及甾醇糖苷的方法，其特征在于：所述油料包括米糠。
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