CN108072704B - 基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法 - Google Patents

基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法，涉及分析化学在临床医学研究中的应用。具体步骤为，取已冻干粪便，研磨破碎后加入乙醇，研磨后超声，经离心后，取上清液移入收集管，然后用乙醇超声提取一遍，再用异丙醇提取残留的胆汁酸，合并三次提取的上清液于收集管中冷冻干燥。冻干后用乙腈水溶液复溶，经过滤后进行液相色谱质谱联用仪器分析。本发明的检测方法利用高分辨率仪器排除干扰，准确定量，对粪便中胆汁酸进行分析，为胆汁酸与疾病发生发展的关系研究提供依据。

Description

基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于液相色谱高分辨质谱联用对大鼠粪便中各胆汁酸进行检测的方法。
背景技术
胆汁酸在肝细胞内由胆固醇转化合成为初级胆汁酸：包括胆酸和鹅脱氧胆酸；初级胆汁酸可与牛磺酸或甘氨酸结合，生成结合型胆汁酸。然后随胆汁进入肠道，在细菌的作用下，形成次级胆汁酸(脱氧胆酸和少量石胆酸)。胆汁酸在肠道中被重吸收，经肝细胞所摄取，再形成胆汁分泌。此过程每天重复多次，称为肝肠循环。肝肠循环中胆汁酸有95％被重吸收,5％由粪便排出丢失。经粪便排泄的胆汁酸能够为人体的胆汁酸代谢提供丰富的信息。建立一种检测粪便中胆汁酸的检测方法以期为胆汁酸的代谢异常类疾病的研究提供帮助。
早在1975年就有人利用3α-羟基类固醇脱氢酶检测粪便中的胆汁酸，而该方法只能检测总胆汁酸，不能区分各种胆汁酸的差异性变化。色谱技术由于能将不同物质分离进行检测，自20世纪中期开始得到了迅猛发展，被应用于多个领域。开始时研究人员主要利用气相色谱研究粪便中的胆汁酸，但是气相色谱法需要繁杂的衍生化过程，逐渐被液相色谱法取代。在普通的高效液相色谱方法中，结合型胆汁酸含有酰胺键在205nm下有吸收可以被检测到，而游离型胆汁酸需要键合发色团，这样检测游离型胆汁酸步骤也十分繁琐。液相色谱-质谱在追求分辨率高的同时，线性范围逐渐扩大，定量准确性也得到提高，因此液相色谱-质谱方法得到了广泛应用。但是目前报道的仅有Genta等人利用液相色谱-质谱技术对粪便中的胆汁酸进行了检测鉴定，其研究中只涉及到了非结合型胆汁酸。对粪便中各胆汁酸进行较为全面的分离检测，尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有检测方法步骤复杂，对粪便中各种胆汁酸检测不全面等问题，提出了提取、过滤，结合液相色谱-质谱技术，较为全面的检测粪便中的胆汁酸。该方法将先进的色谱分离及质谱分辨技术结合，同时检测26种胆汁酸，其中，从粪便提取液中能够检测到22种胆汁酸，不需要复杂的前处理技术，具有重复性好，稳定性高，定量准确等特点，适用于粪便中胆汁酸的分析研究。
本发明的技术方案如下：
(1)将粪便样品冷冻干燥20小时至完全干燥，将其用研钵碾成粉末。称量样品约10mg，放入研磨球，加入1mL含内标提取剂，研磨(研磨频率20次每秒，每次研磨时间1min)两次，超声后离心，取上清液移入收集管；向残留物中加入1mL纯乙醇，涡旋超声，取上清；再用1mL异丙醇重复提取一遍，合并三次提取的上清液于收集管中冷冻干燥。内标提取剂乙醇中约含有CDCA-d4 2.3μmol/L，CA-d5、TCA-d5、TCDCA-d5、TDCA-d5、TβMCA-d4 0.6μmol/L，GCA-d4、GCDCS-d5、GCDCA-d4 1.2μmol/L，各胆汁酸由与其对应的或结构类似的内标校正，以确保定量准确性。
(2)冻干后用1mL 25％乙腈水溶液复溶，经0.22μm滤膜过滤后进行液相色谱质谱联用仪分析
液相色谱的条件为：C8色谱柱，柱长100mm，直径2.1mm，粒径1.7μm，流速0.2mL/min，柱温35℃，进样体积为5μL；液相色谱流动相A相为10mmol/L NH4HCO3水溶液，B相纯乙腈，采用梯度洗脱，初始25％B，保持0.5min后，随后在12分钟内线性升高到40％B。在1min内继续升高到90％B，维持3分钟，在0.5分钟恢复到25％B，平衡2.5分钟。
质谱检测的条件为：采用ESI源负离子模式，喷雾电压3kV，毛细管温度设置为300℃。鞘气和辅助气同为氮气，流速分别为45and 10(arbitrary units)，辅助气加热温度为350℃。方法采用全扫描模式，分辨率设置为120000，扫描范围设置为m/z 73.4到1100。
(3)对含内标和βMCA、TαMCA、GCDCS、UDCA、GUDCA、CA、GCA、TUDCA、TCA、CDCA、GCDCA、DCA、GDCA、TCDCA、TDCA、LCA、GLCA、TLC标准样品溶液按上述相同的操作条件进行液相色谱质谱联用仪分析，对照获得的质量数和保留时间对粪便样品中是否含有上述标准样品中的物质进行定性；通过一级、二级质谱质量数对粪便样品中是否含有ωMCA、αMCA、DHCA、TβMCA、HCA、HDCA、MCA、THDCA中的一种或二种以上胆汁酸成份进行定性；对2个以上不同浓度的标准样品进行液相色谱质谱联用仪分析，建立线性曲线，根据与各胆汁酸相应的或结构相近的标准样品对应的线性曲线定量粪便样品中各种胆汁酸成份。
本方法利用了分析化学的提取、净化技术，结合高效液相色谱-高分辨质谱分离检测技术，对大鼠粪便中含有的主要胆汁酸进行检测、定量。对市售的18种胆汁酸的检测限在0.1-1.2nmol/L，线性范围能达到3-4个数量级，线性相关系数R2>0.99；对没有标样的胆汁酸采用一级精确质量数、二级MS/MS碎片等信息辅助定性，并采用与各胆汁酸相应的或结构相近的标准样品标准曲线进行定量。与现有文献报道方法相比，本方法快速、简单、高效，可对粪便中22种胆汁酸同时进行定量检测，为肝肠系统疾病相关的胆汁酸代谢研究提供帮助。
附图说明
图1胆汁酸标准样品的提取离子谱图,色谱峰:1.βMCA，2.TαMCA，3.GCDCS，4.UDCA，5.GUDCA，6.CA，7.GCA，8.TUDCA，9.TCA，10.CDCA，11.GCDCA，12.DCA，13GDCA，14.TCDCA，15.TDCA，16.LCA，17.GLCA，18.TLCA；
图2粪便样品中胆汁酸的提取离子谱图,色谱峰:1.ωMCA，2.βMCA，3.3DHCA，4.TαMCA，5.TβMCA，6.UDCA，7.HCA，8.GUDCA，9.HDCA，10.CA，11.GCA，12.TUDCA，13.TCA，14.THDCA，15.CDCA，16.GCDCA，17.DCA，18.GDCA，19.TCDCA，20.TDCA，21.LCA，22.TLCA。
具体实施方式
实施例一清除肠道菌群的转基因小鼠粪便中胆汁酸检测
将6只小鼠粪便样品入冷冻干燥机冻干20小时。待粪便完全干燥后，用研钵研磨碎，取约10mg加入研磨球及含内标乙醇1mL，研磨1次，超声10分钟，再研磨1次，离心14000rpm，10min。取上清移入收集管，向残留物中加入1mL纯乙醇，超声提取10min，取上清，再用1mL异丙醇重复提取残留物一遍，合并三次提取的上清液于收集管中冷冻干燥。冻干后用1mL含25％乙腈水溶液复溶，涡旋混匀后，经0.22μm滤膜过滤后等待进样。
液相色谱分离采用C8色谱柱，柱参数为100mm×2.1mm×1.7μm，流速0.2mL/min，柱温35℃，进样体积为5μL；液相色谱流动相A相为10mmol/L NH4HCO3水溶液，B相纯乙腈，采用梯度程序，初始25％B，保持0.5min后，在12分钟内线性升高到40％B。随后在1min内升高到90％B，维持3分钟，在0.5分钟恢复到25％B，平衡2.5分钟。采用高分辨质谱ESI源负离子模式，喷雾电压3kV，毛细管温度设置为300℃，鞘气和辅助气为氮气，鞘气流速45(arbitraryunits)，辅助气流速为10(arbitrary units)，辅助气加热温度为350℃。采用全扫描模式，扫描范围设置为m/z 73.4到1100，分辨率为120000。
将仪器检测得到的峰面积经内标校正，线性曲线定量，结果发现：小鼠粪便中几乎不含有硫化型如GCDCS这类极性较强的胆汁酸；主要的牛磺酸结合型胆汁酸TCDCA，TDCA，TCA含量不超过12nmol/g，GCDCA，GDCA，GCA含量不超过1.5nmol/g，可见这类结合型胆汁酸含量较少；由粪便排出的主要是非结合型胆汁酸，次级胆汁酸DCA、LCA含量较初级胆汁酸CA、CDCA高，鼠胆酸βMCA、ωMCA的含量高，均值大于450nmol/g。这些胆汁酸的测定结果与相关文献报道结果较为吻合。
实施例二野生型小鼠粪便中胆汁酸检测
6只野生型小鼠粪便样品经冷冻干燥机冻干干燥后碾碎，称量约10mg，加入含内标乙醇1mL，研磨及超声提取后，离心、取上清液移入收集管，向残留物中加入1mL纯乙醇复提及1mL异丙醇再提一遍，合并三次提取液于收集管中冷冻干燥。最后用1mL含25％乙腈水溶液复溶，涡旋混匀后，经滤膜过滤后进行液相色谱-质谱检测。检测结果显示：野生型小鼠粪便中胆汁酸含量总体上高于转基因小鼠，主要含有的胆汁酸种类与转基因型小鼠的相同，为非结合型的DCA、LCA、βMCA、ωMCA。
实施例三分析方法的评价
准确称量并用甲醇配置胆汁酸母液，包括：GCDCS 40μmol/L，GCA 60μmol/L，TCDCA400μmol/L，TαMCA 1939μmol/L，βMCA 1220μmol/L，UDCA、GCDCA、GDCA、GUDCA、CA、TUDCA、TCA、CDCA、DCA、TDCA、GLCA、LCA、TLCA各200μmol/L。吸取胆汁酸母液混合，再稀释成一系列浓度。将各浓度点样品吸取200μL，加入200μL粪便提取液，混合冻干后用200μL的25％乙腈水溶液复溶。据实际样品含量及仪器灵敏度情况选择线性范围，以浓度为纵坐标，以内标校正值为横坐标制作标准曲线，方法的定量限、检测限、线性相关系数见表1，检测限在0.1-1.2nmol/L，定量限在0.3-4nmol/L，线性范围能达到3-4个数量级，线性相关系数R2>0.99，该方法可对粪便中的胆汁酸进行准确定量。
表1发明方法的的检测限，定量限，线性范围和相关系数
Figure BDA0001147633790000041
ωMCA、αMCA、βMCA、MCA、HCA、CA、LCA采用的内标是CA-d5；DHCA、HDCA、UDCA、CDCA、DCA采用的内标是CDCA-d4；TβMCA、TαMCA采用的内标是TβMCA-d4；TCDCA采用的内标是TCDCA-d5；THDCA、TDCA采用的内标是TDCA-d5；TUDCA、TCA、TLCA采用的内标是TCA-d5，GCDCS采用的内标是GCDCS-d5；GCA、GLCA采用的内标是GCA-d4；GUDCA、GCDCA、GDCA采用的内标是GCDCA-d4。

Claims (5)

1.基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：
（1）称量干燥粪便样品5-30mg，放入研磨球，每mg粪便样本中加入50-200 μL的含内标提取剂乙醇，研磨，超声后离心，取上清液移入收集管；向残留物中加入乙醇，每mg粪便样本中加入50-200 μL，涡旋超声后离心，取上清移入收集管；残留物再用异丙醇，每mg粪便样本中加入50-200 μL，重复提取一遍，离心，取上清，三次提取的上清液合并于收集管中冷冻干燥，得冻干样本；
（2）冻干样本用乙腈水溶液复溶，每mg粪便的提取冻干样本用50-200 μL的乙腈水溶液；经滤膜过滤后进行液相色谱质谱联用仪分析；
（3）对含内标标准样品溶液按上述相同的操作条件进行液相色谱质谱联用仪分析，所述标准样品为βMCA、TαMCA、GCDCS、UDCA、GUDCA、CA、GCA、TUDCA、TCA、CDCA、GCDCA、DCA、GDCA、TCDCA、TDCA、LCA、GLCA TLCA，通过标准样品获得的质量数和保留时间，对粪便样品中是否含有上述标准样品中的物质进行定性；对粪便样品中是否含有ωMCA、αMCA、DHCA、TβMCA、HCA、HDCA、MCA和THDCA通过一级、二级质谱质量数进行定性；对2个以上不同浓度的标准样品进行液相色谱质谱联用仪分析，定量时标准样品和粪便样品中各种胆汁酸成份采用内标校正，建立标准样品的线性曲线，根据与各胆汁酸相应的或结构相近的标准样品对应的线性曲线进行粪便样品中各种胆汁酸成份的定量；
粪便为大鼠粪便；
步骤（2）中采用的液相色谱条件为：C8色谱柱 规格为100 mm×2.1 mm×1.7 μm，流速0.2 mL/min，柱温35℃，进样体积为5 μL；液相色谱流动相A相为含10 mmol/L NH4HCO3水溶液，B相为纯乙腈，采用梯度程序洗脱，初始时25%B相，保持0.5分钟；随后在12分钟内线性升高到40%B；接着，在1min内升高到90%B，并冲洗系统3分钟，然后在0.5分钟内恢复到25%B，平衡2.5分钟；
步骤（2）中采用的质谱检测条件为：采用ESI源负离子模式，喷雾电压3 kV，毛细管温度设置为300 ◦C；鞘气流速和辅助气为氮气，流速分别为45 and 10 arbitrary units，辅助气加热温度为350 ◦C；方法采用全扫描模式，分辨率设置为120000，扫描范围设置为m/z73.4到1100。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中含内标提取剂乙醇中含有Chenodeoxycholic acid-d4、Cholic acid-d5、Taurocholic acid -d5、Taurochenodeoxycholic acid-d5、Taurodeoxycholic acid-d5、Tauro β-Muricholicacid-d4、Glycocholic acid-d5、Glycochenodeoxycholic acid-d5 3-Sulfate DisodiumSalt和Sodium glycochenodeoxycholate-d4，浓度均为0.5-2.5 μmol/L。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：将粪便样品冷冻干燥18-24小时至完全干燥后再进行称量。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：研磨频率15-20次/s，每次研磨时间1-3 min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：冻干样本用乙腈水溶液复溶，每mg粪便的提取冻干样本用50-200 μL的乙腈水溶液，其中乙腈-水溶液的体积比为1/3-1/5。
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