CN114894951B - 一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法与应用 - Google Patents

一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机污染物分析技术领域，公开了一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法与应用，该方法是在头发或指甲中加入同位素内标后再加入氢氧化钠，在恒温水浴进行消解，消解后加入混合有机溶剂对所得消解液进行两次萃取，合并上层上清液，然后使用酸溶液中和下层分离物，同样重复进行两次萃取，合并所有上清液并浓缩，用甲醇定容。通过自动阀切换进行在线固相萃取，然后经液相色谱三重四级杆质谱进行定量测定。经过数据处理和定量计算，得到头发和指甲中邻苯二甲酸酯代谢物的含量。本发明对人体头发和指甲中邻苯二甲酸酯代谢物的快速(20～28min)准确检测，为邻苯二甲酸酯的人体暴露健康风险评估提供有效的方法手段。

Description

一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法 与应用
技术领域
本发明属于有机污染物分析技术领域，更具体地，涉及一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法与应用。
背景技术
邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类内分泌干扰化学品(EDC)。这些化合物被广泛用作塑料产品中的增塑剂，以提高产品的柔韧性和弹性。由于邻苯二甲酸酯的疏水性和不与塑料化学结合的特性，在环境中无处不在，人类不可避免地会通过摄入、吸入和皮肤吸收等途径接触到邻苯二甲酸酯混合物。
而人体吸收的PAEs可经过肝脏等器官代谢解毒，形成邻苯二甲酸酯代谢物(mPAEs)通过血液分布于肝脏、肾脏、胃肠道及脂肪组织。为了评估人体对PAEs的暴露，有必要确定人体吸收的剂量。通常，通过外部和内部途径评估暴露。然而，由于PAEs用途广泛，很难采用PAEs环境水平(例如食物、空气和水)来估算人体综合剂量。头发和指甲样本相比于其他常用的生物样本(血液、尿液等)，具有易采集、易储存、分析成本低等优势，并且可以反应人体的长期暴露水平。目前头发和指甲样品的分析方法往往需要经过较长的前处理流程，以达到净化和富集的目的，溶剂用量较大，方法流程较为繁琐，样本分析所需时间较长，不利于大规模人体样品分析的开展。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明目的在于提供一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物(mPAEs)含量的方法，该方法采用固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法，可快速(20～28min)检测头发和指甲中的mPAEs水平。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，包括如下具体步骤：
S1.取头发或指甲样品加入同位素内标物，加入碱溶液后在25～45℃恒温水浴消解，所得消解液A加入有机溶剂萃取两次，离心分离并收集上清液；随后在下层分离产物中加入酸溶液中和得消解液B，加入有机溶剂萃取两次，再次离心分离并收集上清液，将四次得到的上清液合并，用干燥剂除水，浓缩后定容体积500μL，即为样品溶液；
S2.采用自动阀切换进行在线固相萃取步骤S1所得样品溶液，在线固相萃取富集柱为十八烷基硅烷化固定相色谱柱；流动相A为含有0.01～0.2％甲酸的超纯水，流动相B为甲醇；流速为0.2～1.0mL/min；柱温为20～50℃；梯度洗脱程序从5～50％的甲醇开始，然后在5～6min上升到90～100％的甲醇，最后下降到5～50％的甲醇，保留15～25min，制得富集的待测目标化合物；
S3.采用液相色谱对富集的待测目标化合物进行色谱分离，色谱柱为十八烷基硅烷化固定相；流动相A为含有0.01～0.2％甲酸的超纯水；流动相B为乙腈；柱温为20～30℃；流速为0.2～1.0mL/min；梯度洗脱程序开始为5～50％乙腈，然后升至10～90％乙腈，再升至50～100％乙腈，最后降至45％乙腈，分离后得到富集目标化合物邻苯二甲酸酯代谢物；
S4.采用三重四级杆质谱对富集目标化合物邻苯二甲酸酯代谢物进行检测，以含有相应同位素内标物的不同浓度目标化合物标准品制得工作曲线，根据得到的各目标化合物的面积和浓度进行计算，得到待测各化合物的相对响应因子RRF；然后通过计算得到的RRF以及样品中邻苯二甲酸酯代谢物的峰面积和内标含量，计算得出头发或指甲样品中邻苯二甲酸酯代谢物的含量。
优选地，步骤S1和步骤S4中所述的同位素内标物为13C4-邻苯二甲酸单苄酯、13C4-邻苯二甲酸单甲酯、13C4-邻苯二甲酸单辛酯、13C4-邻苯二甲酸单乙酯、13C4-邻苯二甲酸单乙基己酯、13C4-邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯、13C4-邻苯二甲酸单正丁酯、13C4-邻苯二甲酸(乙基羟基己基)单酯或d4-邻苯二甲酸单异丁酯中的一种以上。
优选地，步骤S1中所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱溶液的浓度为1～5mol/L，所述头发和指甲样品与碱溶液中碱的质量比为(0.5～5)：1。
优选地，步骤S1中所述有机溶剂均为正己烷和叔丁基甲醚的混合溶剂，二者的体积比为1：1；所述有机溶剂的每次萃取加入量与消解液A或消解液B的体积比均为(0.1～10)：1；所述消解的时间为1～24h；所述酸溶液为盐酸或硫酸；所述干燥剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁或无水氯化钙。
优选地，步骤S1中所述离心的速率为2000～4000rpm，所述离心的温度为4～40℃，所述离心的时间为5～30min。
优选地，步骤S3中所述梯度洗脱程序具体为：开始为5～50％乙腈，保留2～15min；升至10～90％乙腈，保留2～10min；接着升至50～100％乙腈，保留3～7min后降至45％乙腈；保留2～10min。
优选地，步骤S4中所述的邻苯二甲酸酯代谢物为邻苯二甲酸单苄酯、邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸单辛酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单乙基己酯、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯、邻苯二甲酸单正丁酯、邻苯二甲酸(乙基羟基己基)单酯或邻苯二甲酸单异丁酯中的一种以上。
优选地，步骤S4中所述邻苯二甲酸酯代谢物的检测浓度为0.002～0.769ng/g。
所述的方法在人体暴露健康风险评估领域中的应用。
本发明步骤S2中流动相A为0.01～0.2％甲酸的超纯水，流动相B为甲醇，流速为0.2～1.0mL/min，柱温为20～50℃；梯度洗脱程序从5～50％的甲醇开始，确保目标化合物全部富集在富集柱上，然后六通阀自动切换，保留5min直至目标化合物被洗脱至分析色谱柱，然后从5～50％的甲醇开始，然后在5～6min上升到90～100％的甲醇，最后下降到5～50％的甲醇，保留19min，只有在此时间阶段和比例的流动相才可测试出目标化合物，这是由于当目标化合物富集时，甲醇比例太高，目标物富集不上；而甲醇的比例太低，目标化合物洗脱不出且基质干扰较严重。
本发明步骤S3中所述梯度洗脱程序具体为：开始为5～50％乙腈，保留2～15min；升至10～90％乙腈，保留2～10min；接着升至50～100％乙腈，保留3～7min后降至45％乙腈；保留2～10min。只有在此时间阶段和比例的流动相才可测试出目标化合物，这是由于当目标化合物富集时，乙腈比例太高，目标物富集不上；而当洗脱时，乙腈的比例太低，目标化合物洗脱不下来。
本发明采用人体体液和组织中的mPAEs浓度评估内部暴露的方法，通过检测人体头发和指甲中的mPAEs的含量来评估人体PAEs的暴露水平和负荷。头发和指甲样本相比于其他常用的生物样本(血液、尿液等)，具有易采集、易储存、分析成本低等优势；另外，头发样本可以表征机体的长期暴露水平，相比仅能表征短、中期的生物样本，头发样本的长期暴露表征能力可以更加稳定地反映机体一段时间内的暴露水平。一般头发样品的前处理方法分为四类：酸性消解、碱性消解、酶消解和有机溶剂提取。酸性消解不会破坏头发结构，但过程比较缓慢；有机溶剂可以从样本中提取目标化合物，而由于样本未消解可能导致提取过程有残留；而碱性消解比酶消解和酸性消解需要更少的时间，同时可测量多种所需目标化合物。
本发明所针对的头发和指甲样品基质相对复杂，上仪器检测前需要进行一定的前处理，从而有效降低基质效应带来的干扰，提高方法的稳定性和可靠性；通过针对性富集和分离条件的优化，实现了对头发和指甲中的mPAEs进行直接的测定。在线富集的方法减少了前处理带来的分析误差，减少溶剂用量和前处理时间，更大的进样量也可以有效提升仪器灵敏度。对复杂的头发和指甲基质中低浓度目标物进行分析。
本发明方法是在头发或指甲中加入同位素内标后再加入氢氧化钠，在恒温水浴进行消解，消解后加入混合有机溶剂对所得消解液进行两次萃取，合并上层上清液，然后使用酸溶液中和下层分离物，同样重复进行两次萃取，合并所有上清液并浓缩，用甲醇定容。通过自动阀切换进行在线固相萃取，然后经液相色谱三重四级杆质谱进行定量测定。经过数据处理和定量计算，得到头发和指甲中邻苯二甲酸酯代谢物的含量。本发明对人体头发和指甲中邻苯二甲酸酯代谢物的快速(20～28min)准确检测，为邻苯二甲酸酯的人体暴露健康风险评估提供有效的方法手段。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过在线固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法对头发和指甲中的mPAEs进行分析，优化了头发和指甲样品的前处理步骤，缩短了样品分析所需时间，可快速(20～28min)检测头发和指甲中的mPAEs水平。
2.本发明采用固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法大幅度减少了常规的头发和指甲前处理所需的溶剂用量，有效降低实验室操作人员的暴露风险。
3.本发明通过同位素稀释法进行定量，有效降低了可能的基质干扰，提高了定量的准确性，降低了成本，同时显著提高了样品的分析效率，便于在不同实验室开展大量头发和指甲样本的分析。
附图说明
图1为本发明在线固相萃取-高效液相色谱质谱检测系统配置图。
图2为实施例1中mPAEs及其相应的同位素内标物的液相色谱三重四级杆质谱出峰时间和提取离子色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
本发明实施例中头发和指甲样品采自普通群众。所用到9种mPAEs标准品，包括邻苯二甲酸单甲酯(mono-methyl phthalate，mMP)、邻苯二甲酸单乙酯(mono-ethylphthalate，mEP)、邻苯二甲酸单正丁酯(mono-n-butyl phthalate，mnBP)、邻苯二甲酸单异丁酯(mono-isobutyl phthalate，miBP)、邻苯二甲酸单苄酯(mono-benzyl phthalate，mBzP)、邻苯二甲酸单辛酯(mono-n-octyl phthalate，mOP)、邻苯二甲酸单乙基己酯(mono-(2-ethylhexyl)phthalate，mEHP)、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯(mono-(2-ethyl-5-oxo-hexyl)phthalate，mEOHP)和邻苯二甲酸(乙基羟基己基)单酯(mono-(2-ethyl-5-hydroxy-hexyl)phthalate，mEHHP)，均购自Cambridge Isotope Laboratories(Andover,MA,USA)。9种同位素内标，即13C4-邻苯二甲酸单苄酯(13C4-mono-benzyl phthalate，13C4-mBzP)、13C4-邻苯二甲酸单甲酯(13C4-mono-methyl phthalate，13C4-mMP)、13C4-邻苯二甲酸单辛酯(13C4-mono-n-octyl phthalate，13C4-mOP)、13C4-邻苯二甲酸单乙酯(13C4-mono-ethyl phthalate，13C4-mEP)、13C4-邻苯二甲酸单乙基己酯(13C4-mono-(2-ethylhexyl)phthalate，13C4-mEHP)、13C4-邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯(13C4-mono-(2-ethyl-5-oxo-hexyl)phthalate，13C4-mEOHP)、13C4-邻苯二甲酸单正丁酯(13C4-mono-n-butylphthalate，13C4-mnBP)、13C4-邻苯二甲酸(乙基羟基己基)单酯(13C4-mono-(2-ethyl-5-hydroxy-hexyl)phthalate，13C4-mEHHP)和d4-邻苯二甲酸单异丁酯(d4-mono-isobutylphthalate，d4-miBP)，其中均购自Cambridge Isotope Laboratories(Andover,MA,USA)。
图1为本发明在线固相萃取-高效液相色谱质谱检测系统配置图。其中，1-6为六通阀，(a)为六通阀位置在1时的富集状态，1和6连通；(b)为六通阀位置在2时的分析状态，1和2连通。从图1中可知，六通阀在1(富集)位置时，待测样品经过进样阀上样，在上样泵流动相的淋洗下进入富集柱进行富集，而此时分析泵的流动相淋洗分析柱；待测样品完成富集之后，切换六通阀2(分析)位置，此时，富集在富集柱上的待测目标化合物经过上样泵的流动相的洗脱，进入第二根分析柱进行下一步分离，然后进入质谱进行检测。
实施例1
1.取100mg头发或指甲样品放入5mL特氟龙管，加入mPAEs同位素内标(4ng 13C4-mMP、4ng 13C4-mEP、4ng 13C4-mBzP、2ng13C4-mOP、2ng 13C4-mEHP、2ng13C4-mEOHP、2ng13C4-mEHHP、2ng13C4-mnBP、4ngd4-miBP)加入5mL1M氢氧化钠溶液，在40℃的恒温水浴锅上消解12h，消解后加入5mL体积比1：1的正己烷和叔丁基甲醚，涡旋混匀5min，然后进行离心(4000rpm，5min，25℃)，离心后取上清液，上述萃取过程进行两次；在消解液中加入盐酸中和，同样萃取两次；混合上清液过无水硫酸钠除水；浓缩后重新定容，即可进样。
2.在线固相萃取-液相色谱-三重四级杆质谱(LC-MS/MS)的型号为1100型液相色谱仪(LC-1100，Agilent，USA)-API 4000三重四级杆质谱(MS/MS，AB SCIEX，USA)。采用自动阀切换进行在线固相萃取时六通阀连通1和6位(图1位置1)，进样体积为100μL；在线固相萃取富集柱
Figure BDA0003643437470000061
HLB柱(2.1×20mm×25μm)，具体富集过程如下：流动相A为0.1％甲酸的超纯水，流动相B为甲醇，流速为1mL/min，柱温为25℃；梯度洗脱程序从10％的甲醇开始，确保目标化合物全部富集在富集柱上，然后六通阀自动切换，保留3min直至目标化合物被洗脱至分析色谱柱，然后在5～10min上升到100％的甲醇，最后下降到5～50％的甲醇，保留19min。
3.液相色谱质谱检测时六通阀连通1和2位(图1中位置2)。色谱柱为Poroshell120EC-C18色谱柱(4.6×100mm×2.7μm，美国Agilent公司)，保护柱为UHPLC C18 4.6 mmID；流动相A为0.1％甲酸的超纯水；流动相B为乙腈；柱温为25℃；流速为0.4L/min；梯度洗脱程序开始为45％乙腈，保留14min；升至90％乙腈，保留2min；接着升至100％乙腈，保留5min后降至45％乙腈；保留8min。采用内标法定量，通过目标化合物(mPAEs)及其相应的同位素内标的峰面积浓度的比值来计算相对响应因子(RRF)；然后通过RRF以及样品中mPAEs的峰面积和内标含量计算得出头发和指甲样品中邻苯二甲酸酯代谢物的含量。具体计算公示如下。
以校正标准溶液(C1～C6)进样，按式(1)计算相对响应因子(RRF值)：
Figure BDA0003643437470000071
RRF——目标化合物对定量内标的相对响应因子；
An——目标化合物的峰面积；
Cs——定量同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
As——定量同位素内标的峰面积；
Cn——目标化合物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
其中，各目标化合物六个浓度水平(C1～C6)的RRF值的相对标准偏差(RSD)应小于20％。
按式(2)计算试样中mPAEs的含量：
Figure BDA0003643437470000072
式中：
Cn——目标化合物的含量，单位为纳克每毫升(ng/g)；
An——目标化合物的峰面积；
ms——试样中加入定量同位素内标的量，单位为纳克(ng)；
As——定量同位素内标的峰面积；
RRF——目标化合物对定量内标的相对响应因子；
m——取样量，单位为克(g)。
图2为实施例1中mPAEs及其相应的同位素内标物的液相色谱三重四级杆质谱出峰时间和提取离子色谱图。各目标mPAEs的化合物(mMP，mEP，mnBP，miBP，mBzP，mOP，mEHP，mEOHP，mEHHP)的检出限范围为0.002～0.769ng/g。用头发和指甲中mPAEs在1～100ng/mL的浓度梯度范围制作标准曲线，计算得到的RRF为0.42～1.4。mPAEs的回收率为80～120％，相对标准偏差(RSD)均低于10％。
人体头发和指甲中mPAEs目标物(邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸单辛酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单乙基己酯、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯、邻苯二甲酸单正丁酯、邻苯二甲酸(乙基羟基己基)单酯或邻苯二甲酸单异丁酯中的一种或任意一种以上)在样品广泛检出，表明PAEs在环境中的普遍存在以及普通人群对其的广泛暴露。普通人群的头发样品中ΣmPAEs的浓度范围为21.6～1681.6ng/g。各化合物的浓度按mMP>mEHP>mEP>miBP>mnBP>mEOHP>mEHHP的顺序递减。普通人群的指甲样品中ΣmPAEs的浓度范围为9.5～240.6ng/g。各化合物的浓度按mMP>miBP>mnBP>mEHP>mEP>mEHHP>mEOHP>mnOP的顺序递减。说明人体主要暴露DMP(mMP的母体化合物)，DBP(mnBP的母体化合物)，DiBP(miBP的母体化合物)和DEHP(mEHHP，mEOHP和mEHP的母体化合物)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1. 取头发或指甲样品加入同位素内标物，加入碱溶液后在25~45 ℃恒温水浴消解，所得消解液A加入有机溶剂萃取两次，离心分离并收集上清液；随后在下层分离产物中加入酸溶液中和得消解液B，加入有机溶剂萃取两次，再次离心分离并收集上清液，将四次得到的上清液合并，用干燥剂除水，浓缩后定容体积500 μL，即为样品溶液；所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱溶液的浓度为1~5 mol/L，所述头发和指甲样品与碱溶液中碱的质量比为（0.5~5）:1；所述有机溶剂均为正己烷和叔丁基甲醚的混合溶剂，二者的体积比为1:1；所述有机溶剂的每次萃取加入量与消解液A或消解液B的体积比均为（0.1~10）:1；所述消解的时间为1~24 h；所述酸溶液为盐酸或硫酸；所述干燥剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁或无水氯化钙；
S2. 采用自动阀切换进行在线固相萃取步骤S1所得样品溶液，在线固相萃取富集柱为十八烷基硅烷化固定相色谱柱；流动相A为含有0.01~0.2%甲酸的超纯水，流动相B为甲醇；流速为0.2~1.0 mL/min；柱温为20~50 ℃；梯度洗脱程序从5~50%的甲醇开始，然后在5~6min上升到90~100%的甲醇，最后下降到5~50%的甲醇，保留15~25 min，制得富集的待测目标化合物；
S3. 采用液相色谱对富集的待测目标化合物进行色谱分离，色谱柱为十八烷基硅烷化固定相；流动相A为含有0.01~0.2%甲酸的超纯水；流动相B为乙腈；柱温为20~30℃；流速为0.2~1.0 mL/min；梯度洗脱程序开始为5~50%乙腈，保留2~15 min，然后升至10~90%乙腈，保留2~10 min，再升至50~100%乙腈，保留3~7 min后降至45%乙腈，保留2~10 min，分离后得到富集目标化合物邻苯二甲酸酯代谢物；
S4. 采用三重四级杆质谱对富集目标化合物邻苯二甲酸酯代谢物进行检测，以含有相应同位素内标物的不同浓度目标化合物标准品制得工作曲线，根据得到的各目标化合物的面积和浓度进行计算，得到待测各化合物的相对响应因子RRF；然后通过计算得到的RRF以及样品中邻苯二甲酸酯代谢物的峰面积和内标含量，计算得出头发或指甲样品中邻苯二甲酸酯代谢物的含量；所述的邻苯二甲酸酯代谢物为邻苯二甲酸单苄酯、邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸单辛酯、邻苯二甲酸单乙酯、邻苯二甲酸单乙基己酯、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯、邻苯二甲酸单正丁酯、邻苯二甲酸（乙基羟基己基）单酯或邻苯二甲酸单异丁酯中的一种以上，所述邻苯二甲酸酯代谢物的检测浓度为0.002~0.769 ng/g。
2.根据权利要求1所述的在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1和步骤S4中所述的同位素内标物为13C4-邻苯二甲酸单苄酯、13C4-邻苯二甲酸单甲酯、13C4-邻苯二甲酸单辛酯、13C4-邻苯二甲酸单乙酯、13C4-邻苯二甲酸单乙基己酯、13C4-邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯、13C4-邻苯二甲酸单正丁酯、13C4-邻苯二甲酸（乙基羟基己基）单酯或d4-邻苯二甲酸单异丁酯中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的在线测定头发或指甲中邻苯二甲酸酯代谢物含量的方法，其特征在于，步骤S1中所述离心的速率为2000~4000 rpm，所述离心的温度为4~40℃，所述离心的时间为5~30 min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法在人体暴露健康风险评估领域中的应用。
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