CN110487940A - 尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法 - Google Patents

尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法，包括以下步骤：酶解；活化固相萃取柱；上样；淋洗杂质；洗脱目标物；浓缩并储存。该方法分析获取的PAEs代谢单酯种类更全面(共9种)，主要针对年龄为0‑8岁儿童的尿液分析，适用于型号为Waters系列的高效液相色谱仪。本发明采用简单易行，回收率好，可重现性高，具有很好的应用前景。

Description

尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法
技术领域
本发明涉及尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法。
背景技术
邻苯二甲酸酯(Phthalate Esters，简称PAEs)是常见的半挥发性有机物(Semi-volatile Organic Compounds,SVOC)，难溶于水，易溶于有机溶剂，在常温下为粘稠液体，不易挥发。PAEs早在20世纪20年代就开始被使用，且在过去几十年中的用量显著增加，在工业品和日常消费品中均被广泛使用。其中，高分子量的PAEs，包括DiDP、DiNP、DEHP、BBzP，主要作为增塑剂被用于各种塑料制品，如儿童玩具、PVC地板、食品包装和容器、塑料管道、电缆、医疗设备等中，用以增加材料的塑性和持久性；低分子量的PAEs，包括DMP、DEP、DnBP、DnBP主要作为有机溶剂被用在化妆品、香水、个人护理品、油漆、抛光剂等中。
一般情况下，PAEs的暴露途径主要包括口入、皮肤和呼吸暴露途径。PAEs进入人体后，由于其生物半衰期较短，会迅速代谢并随尿液和粪便排出体外。PAEs在人体中的代谢分为2个阶段：首先相对极性和分子量较低的PAEs(DEP)主要通过水解一个酯基代谢为对应的水解单酯(MEP)，而高分子量的PAEs(如DEHP)则进一步代谢生成对应的氧化单酯，部分水解单酯和氧化单酯随尿液和粪便排出，另一部分单酯则通过进一步的生物转化形成水溶性更强的葡糖苷酸结合物。
国内外大量流行病学研究表明，PAEs暴露与多种健康危害相关。主要体现为：(1)生殖毒性。PAEs暴露与精子质量下降、儿童肛殖距缩短及不完全睾丸下降有关。(2)呼吸系统疾病。Bornehag等于2004年首次报导了瑞典室内环境介质(灰尘)中DEHP浓度与儿童哮喘的相关性。Whyatt等在美国纽约开展的一项队列研究表明产前PAEs暴露与5-11岁儿童哮喘显著相关。(3)内分泌系统紊乱。PAEs是一类内分泌干扰物。研究表明，DEHP暴露显著影响男性甲状腺激素水平，PAEs暴露与婴幼儿性荷尔蒙素水平显著相关。(4)神经系统损害。Whyatt等发现DnBP、DiBP和BBzP暴露可影响心智发育和增加内化行为。另外，PAEs暴露与儿童自闭症和学龄前儿童低词汇量显著相关。
研究表明，尿液中PAEs代谢单酯的检测结果，可表征人体内PAEs总暴露水平，故尿液中PAEs代谢单酯检测方法尤为重要。近年来，固相萃取(Solid-Phase Extraction,SPE)作为样品的前处理技术，在实验室得到了越来越广泛的应用。该技术就是利用固体吸附剂将样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。然而，目前国内相应的尿液前处理技术针对的PAEs代谢单酯种类较少，检测的样品大多为成人的尿样，且前处理方法大多应用于对应的高效液相色谱仪，因此，发明一种检测目标物种类多，适应于儿童尿液中PAEs代谢单酯检测的前处理方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于，基于固相萃取装置和氮吹装置，建立一种覆盖目标化合物广(9种)，操作简单、回收率好、重现性较高的儿童尿液中PAEs代谢单酯检测的前处理方法。本方法适用于型号为Waters系列的高效液相色谱仪。
本发明的技术方案为：尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法，包括以下步骤：
1)于恒温水浴锅内酶解；
2)活化固相萃取柱；
3)上样；
4)淋洗杂质；
5)洗脱目标物；
6)水浴浓缩并加入混合液储存。
所述步骤(1)的酶解试剂为200ul醋酸铵缓冲溶液、75ulβ-葡萄糖醛酸酶(250unit/ml)及0.5ml超纯水，水浴温度为37℃，水浴时间为12小时。
所述步骤(1)的醋酸铵缓冲液为7.7g醋酸铵溶解于100mL超纯水中，加入6mL乙酸调节pH值至4.5。
所述步骤(2)的固相萃取柱的型号为CNW Poly-Sery MAX SPE(60mg/3mL,CNWTechnologies GmbH,Germany)
所述步骤(2)的活化固相萃取柱的试剂为3ml甲醇和3ml超纯水。
所述步骤(3)的尿液上样速度为1ml/min。
所述步骤(4)中淋洗杂质的试剂为3ml超纯水、3ml碳酸氢钠缓冲液及3ml甲醇。
所述步骤(4)的碳酸氢钠缓冲液为1.05g碳酸氢钠溶解于250ml超纯水。
所述步骤(5)的洗脱尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯的试剂为5ml含2％甲酸(v:v)的甲醇。
所述步骤(5)中，尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯洗脱液的洗脱速度为1ml/min。
所述步骤(6)中，水浴温度为45℃。
所述步骤(6)中，混合溶液为0.5ml含10％乙腈的超纯水。
所述步骤(6)中，储存温度为-20℃。
本发明有益效果：本发明建立了新型的人体内PAEs代谢单酯高效液相色谱检测的前处理方法，与传统的前处理方法相比，分析获取的PAEs代谢单酯种类更多(共9种)，适应于年龄为0-8岁儿童的尿液分析；固相萃取方法采用CNW Poly-Sery MAX混合型阴离子交换柱，MAX是反相和强阴离子交换复合模式“水可浸润型”聚合物吸附剂，其基质为N-乙烯吡咯烷酮与二乙烯基苯按特定比例聚合而成(HLB)，再将季胺基团(CH2N(CH3)2C4H9 +)键合在HLB上，具有阴离子交换和反相两种吸附模式，而且具有良好的水可浸润性，该基质洁净，在pH0-14范围内都稳定，在有机溶剂中稳定，比表面积高，交换容量大，对酸性化合物具有高度的选择性和灵敏度。
附图说明
图1为淋洗杂质时，16位固相萃取装置的结构示意图；
图2为洗脱目标物时，16位固相萃取装置的结构示意图；
图3为24位氮吹仪结构示意图；
图4样品中9种邻苯二甲酸脂代谢物LC-MS仪器分析图(以某一样品为例)；
图5 9种邻苯二甲酸脂代谢物标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
1)酶解
将冷冻的尿液解冻，涡旋震荡后，取0.5ml上清液于离心管内，依次加入200ul醋酸铵缓冲溶液，75uL浓度为250unit/mL葡萄糖醛酸酶溶液和0.5mL超纯水，混匀，置于37℃恒温水浴锅内12小时。
2)活化
如图1所示，将固相萃取柱通过流量控制阀安装在固相萃取装置上，固相萃取装置内置废液槽，用于收集废弃液；固相萃取装置外接真空泵，便于抽真空。依次加入3mL甲醇和3mL超纯水，活化固相萃取柱。
3)上样
在活化后的小柱干涸之前(保证溶剂环境)，将酶解后尿样匀速(流速控制在1ml/min以下)通过活化后的固相萃取柱。
4)淋洗杂质
依次在固相萃取柱内加入3mL的超纯水，3mL的碳酸氢钠缓冲溶液和3mL甲醇淋洗杂质，此过程结束后，抽真空5分钟，确保杂质被淋洗干净。
5)洗脱目标物
如图2所示，将废液槽取出，内置试管架，放好试管，并使PP导向针末端进入对应的试管中。加入5ml含有2％甲酸的甲醇(v:v)经行洗脱，洗脱速度为1ml/min，此过程结束后，抽真空2分钟，确保目标物完全洗脱。
6)浓缩及储存
如图3所示，将收集洗脱液的试管置于氮吹仪卡槽内，在45℃水浴条件下用高纯氮气缓慢浓缩至几乎干燥。加入0.5mL乙腈和超纯水(1:9)混合液，涡旋混合10s后，用一次性注射器及PP针式过滤器将待测液转移至2mL棕色样品瓶中，-20℃密封保存，待仪器分析。
LC-MS仪器分析结果如图4所示。
邻苯二甲酸脂代谢物标准曲线如图5所示。
根据图4样品的响应值及图5邻苯二甲酸脂代谢物的标准曲线得出9种邻苯二甲酸脂代谢物的浓度，结果如下表所示：
表1样品中9种邻苯二甲酸脂代谢物的浓度
邻苯二甲酸脂种类 关系式 Y-响应(mAU) X-浓度(ppb)
MEP Y＝569.94X+2656 7357 8.248
MiBP Y＝6093.6X+1382 14050 2.079
MnBP Y＝2833.9X+8467 30997 7.950
MBzP Y＝7732.2X+43 186 0.018
MEHP Y＝11009X+374 19891 1.773
MECPP Y＝8619.7X+6878 8647 0.205
MEHHP Y＝9233X+1457 23051 2.339
MEOHP Y＝5925.5X+1332 4321 0.504
MiNP Y＝10706X+5919 20961 1.405
尽管上面结合附图对本发明的优选实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)于恒温水浴锅内酶解；
2)活化固相萃取柱；
3)上样；
4)淋洗杂质；
5)洗脱目标物；
6)水浴浓缩并加入混合液储存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的酶解试剂为200ul醋酸铵缓冲溶液、75ulβ-葡萄糖醛酸酶(250unit/ml)及0.5ml超纯水，水浴温度为37℃，水浴时间为12小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的活化固相萃取柱为CNWPoly-Sery MAX混合型阴离子交换柱，试剂为3ml甲醇和3ml超纯水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中淋洗杂质的试剂为3ml超纯水、3ml碳酸氢钠缓冲液及3ml甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的洗脱目标物尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯的试剂为5ml含2％甲酸(v:v)的甲醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，水浴温度为45℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，混合溶液为0.5ml含10％乙腈的超纯水。
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