CN102636590A

CN102636590A - 一种检测鸡组织中脱氢乙酸残留量的方法

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Publication number: CN102636590A
Application number: CN2012101372746A
Authority: CN
Inventors: 张雨梅; 杜玉峰; 殷俊; 胡成云; 崔卫波; 刘学
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2012-05-06
Filing date: 2012-05-06
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种检测鸡组织（肌肉、肝脏和肾脏）中脱氢乙酸残留量的方法。该方法是将鸡组织样品经过提取、净化后，以甲醇-0.02%乙酸铵溶液为流动相,高效液相色谱-紫外检测法检测；液相色谱条件为：色谱柱，EclipsePlusC₁₈，5μm，250mm×4.6mmi.d.；流动相为体积比20/80的甲醇-0.02%乙酸铵溶液；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：290nm；柱温：30℃；进样体积：20mL。本发明方法所测得鸡组织中脱氢乙酸的LOD为0.05mg·kg^-1；LOQ为0.2mg·kg^-1，能够满足关于动物性食品中脱氢乙酸药物残留分析的要求。

Description

一种检测鸡组织中脱氢乙酸残留量的方法

技术领域

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种检测鸡组织（肌肉、肝脏和肾脏）中脱氢乙酸残留量的方法。

背景技术

脱氢乙酸作为一种防腐剂，在食品行业中应用较广，现也作为饲料添加剂用于防霉。目前国内外关于脱氢乙酸含量检测的报道，多是针对饮料、烘焙糕点及淹菜等食品，检测方法主要有紫外分光光度度法、气相色谱－氢火焰离子化检测法、高效液相色谱－紫外检测法。但有关动物性组织中脱氢乙酸测定的方法未见报道。

发明内容

为了能检测鸡组织中脱氢乙酸残留量，本发明提供了一种检测鸡组织（肌肉、肝脏和肾脏）中脱氢乙酸残留量的方法，能检测鸡组织中脱氢乙酸的残留量。

本发明所采用的技术方案是：一种检测鸡组织中脱氢乙酸残留量的方法，是将鸡组织样品经过提取、净化后，以甲醇-0.02%乙酸铵溶液为流动相,高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UVD）检测；液相色谱条件为：色谱柱，Eclipse Plus C₁₈，5μm，250mm×4.6mm i.d.；流动相，甲醇-0.02%乙酸铵溶液（20/80,V/V）；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：290nm；柱温：30℃；进样体积：20μL。

本发明中鸡组织样品中脱氢乙酸的提取和净化推荐使用乙腈超声波提取，正己烷及PAX固相萃取柱净化。具体操作是：将鸡组织绞碎后称量，加乙腈10mL匀浆并用乙腈洗涤匀浆机刀片。乙腈匀浆液超声波提取10min后4000rpm离心10min，收集上清液，残渣用乙腈10mL重复提取，合并上清液并加入正丙醇3mL后于40℃旋转蒸发至近干，加入乙腈2.0mL漩涡振荡溶解残渣。若为肌肉样品，残渣溶解的乙腈液置-20℃冰冻15min，4000rpm离心10min，上清液过0.22μm有机滤膜，供HPLC检测用。若为肾脏样品，则加入正己烷4mL涡旋混合5min，4000rpm离心10min，弃去正己烷，并用正己烷重复净化三次后，乙腈相过0.22μm有机滤膜，供HPLC检测用。若为肝脏样品，加入正己烷4mL涡旋混合5min，4000rpm离心10min，弃去正己烷，乙腈相加至已分别经甲醇5mL和1%氨水溶液5mL活化、平衡后的PAX小柱，自然流出。依次用3%氨水溶液5mL和甲醇5mL淋洗小柱，然后用5%乙酸甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液并用氮气吹干。残渣用乙腈2.0mL溶解后，过0.22μm有机滤膜，供HPLC检测用。

本发明方法所测得鸡组织中脱氢乙酸的LOD为0.05mg·kg^-1；LOQ为0.2mg·kg^-1，能够满足关于动物性食品中脱氢乙酸药物残留分析的要求。

附图说明

图1是1mg·L^-1脱氢乙酸标准溶液色谱图。

图2是肌肉组织添加脱氢乙酸标准溶液色谱图；A：空白肌肉;B：空白肌肉＋0.5mg·kg^-1脱氢乙酸。

图3是肾脏添加脱氢乙酸标准溶液色谱图；C：空白肾脏;D：空白肾脏＋1mg·kg^-1脱氢乙酸。图4是肝脏添加脱氢乙酸标准溶液色谱图；E：空白肝脏;F：空白肝脏＋1mg·kg^-1脱氢乙酸。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为体积百分浓度。

1.实验鸡的饲养和样品采集

随机选取30日龄黄羽肉鸡6只，体重1.25±0.40kg，连续7d饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。鸡于第8d处死，分别采集肌肉、肝脏和肾脏组织作为空白对照样品，-20℃保存。

2.样品处理

本发明提取、萃取、净化步骤：

⑴鸡组织（肌肉、肝脏和肾脏）自然解冻后绞碎，准确称取2.0g于50mL离心管中，加乙腈10mL匀浆，并用乙腈5mL洗涤刀片，超声波提取10min后4000rpm离心10min，收集上清液，残渣用乙腈10mL重复提取，合并上清液并加入正丙醇3mL后于40℃旋转蒸发至近干，加入乙腈2.0mL涡旋振荡溶解残渣；

⑵肌肉样品，则残渣溶解的乙腈液转移至10mL离心管中，置-20℃冰冻15min，4000rpm离心10min，上清液过0.22μm有机滤膜，供HPLC检测用；

⑶肾脏样品，则残渣溶解的乙腈液转移至10mL离心管中，加入正己烷4mL涡旋混合5min，4000rpm离心10min，弃去正己烷，并用正己烷重复净提三次后，乙腈相过0.22μm有机滤膜，供HPLC检测用；

⑷肝脏样品，则残渣溶解的乙腈液转移至10mL离心管中，加入正己烷4mL旋涡混合5min，4000rpm离心10min，弃去正己烷，乙腈相加至已分别经甲醇5mL和1%氨水溶液5mL活化、平衡后的PAX小柱，自然流出。依次用3%氨水溶液5mL和甲醇5mL淋洗小柱，然后用5%乙酸甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液于10mL试管，氮气吹干。

残渣用乙腈2.0mL溶解后，过0.22μm有机滤膜，供HPLC检测用。

3.色谱条件及色谱分离行为

色谱柱：Eclipse Plus C₁₈，5μm，250mm×4.6mm i.d.；流动相：甲醇-0.02%乙酸铵溶液（20/80,V/V）；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：290nm；柱温：30℃；进样体积：20μL。

在本发明条件下，鸡组织中脱氢乙酸与共存物质能够完全分离，空白样品及空白添加样品色谱分离图见图1和图2－4。

4.标准曲线的绘制

准确称取空白样品2.0g，置50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的脱氢乙酸标准工作液各100μL，使在空白鸡组织样品中添加浓度分别为10.0，5.0，2.0，1.0，0.5和0.2mg·kg^-1，经上述样品提取与净化后，取20μL进行HPLC检测。每个浓度5次重复。以脱氢乙酸添加浓度为自变量，脱氢乙酸平均峰面积为因变量，绘制标准曲线。线性回归方程为y=21251x+177.9、相关系数0.9998、线性范围为0.2～10.0mg·kg^-1。

在本发明条件下，在标准品浓度为0.2～10.0mg·kg^-1范围内脱氢乙酸峰面积（y）与其浓度（x）呈线性相关，且线性关系良好，相关系数达0.9998。

5.回收率及精密度的测定

准确称取2.0g样品置50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液各100μL，使在空白鸡组织样品中添加浓度分别为5.0，1.0，0.5和0.2mg·kg^-1，每个浓度设置6个平行。经上述样品提取与净化后，取20μL进行检测。根据脱氢乙酸实际测定量与理论添加量的比值计算添加回收率。在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台HPLC分析，重复6次测定，求得日内（批内）精密度。在一周内不同日以不同的标准曲线及同一台HPLC分析，重复6次测定，求得日间（批间）精密度。

本发明方法中测定鸡组织中脱氢乙酸的添加回收率及相对标准偏差的结果见表1。在0.5～5.0mg·kg^-1范围内，肌肉样品回收率在88.21%～93.87%；肝脏样品回收率在83.83%～86.64%；肾脏样品回收率在83.78%～89.84%。

表1鸡组织中脱氢乙酸的添加回收率（n=6）

本发明方法中测定鸡组织中脱氢乙酸的精密度结果见表2。

表2鸡组织中脱乙酸测定的精密度（n=6）

在本发明中脱氢乙酸在添加浓度0.2～5.0mg·kg^-1范围内，日内相对标准偏差均在5.10%～8.11%之间，日间相对标准偏差均在5.92%～11.30%之间。表明该方法稳定可靠，完全能满足鸡组织中脱氢乙酸残留分析方法的要求。

6.检测限及定量限的确定

取空白组织添加不同浓度的脱氢乙酸标准液，使添加浓度分别为0.2,0.15,0.10,0.05，0.01mg·kg^-1，按照上述样品提取与净化步骤处理后进行HPLC分析，以脱氢乙酸目标峰信噪比大于等于10（S/N≥10），所对应的最小添加浓度定为定量限（LOQ）。以信噪比大于等于3（S/N≥3）所对应的最小添加浓度定为检测限（LOD）。平行试验6次。

Claims

1.一种检测鸡组织中脱氢乙酸残留量的方法，是将鸡组织样品经过提取、净化后，以甲醇-0.02%乙酸铵溶液为流动相, 高效液相色谱-紫外检测法检测；

液相色谱条件为：色谱柱，Eclipse Plus C₁₈，5μm，250mm×4.6mm i.d.；流动相为体积比20/80的甲醇-0.02%乙酸铵溶液；流速：1.0 mL·min^-1；检测波长：290 nm；柱温：30℃；进样体积：20mL。

2.根据权利要求1所述检测鸡组织中脱氢乙酸残留量的方法，其特征在于鸡组织样品中脱氢乙酸的提取和净化使用乙腈超声波提取，正己烷及PAX固相萃取柱净化。

3.根据权利要求2所述的检测鸡组织中脱氢乙酸残留量的方法，其特征在于鸡组织样品中脱氢乙酸的提取和净化具体操作是：将鸡组织绞碎后称量，加乙腈10 mL匀浆并用乙腈洗涤匀浆机刀片；乙腈匀浆液超声波提取10 min后4000 rpm离心10 min，收集上清液，残渣用乙腈10 mL重复提取，合并上清液并加入正丙醇3 mL后于40℃旋转蒸发至近干，加入乙腈2.0 mL漩涡振荡溶解残渣；

若为肌肉样品，残渣溶解的乙腈液置-20℃冰冻15 min，4000 rpm离心10 min，上清液过0.22 μm有机滤膜，供HPLC检测用；

若为肾脏样品，则加入正己烷4 mL涡旋混合5 min，4000 rpm离心10 min，弃去正己烷，并用正己烷重复净化三次后，乙腈相过0.22 μm有机滤膜，供HPLC检测用；

若为肝脏样品，加入正己烷4 mL涡旋混合5 min，4000 rpm离心10 min，弃去正己烷，乙腈相加至已分别经甲醇5 mL和1 %氨水溶液5 mL活化、平衡后的PAX小柱，自然流出；依次用3 %氨水溶液5 mL和甲醇5 mL淋洗小柱，然后用5 %乙酸甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液并用氮气吹干，残渣用乙腈2.0 mL溶解后，过0.22 μm有机滤膜，供HPLC检测用。