CN102590427A - 抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法 - Google Patents
抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗毒素/抗血清中TritonX-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗毒素、抗血清中TritonX-100的残留量。该法能有效除去大分子物质及杂质，并且在测定过程中有效防止被测定物TritonX-100的损失，确保测定结果的准确性，同时本发明提供的方法快速、简便，能客观地评价制品质量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法。
背景技术
抗毒素、抗血清（Antitoxin/Antiserum）是指采用特定的抗原免疫动物后，再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体（IgG）或抗体片段[F(ab’)2]的免疫球蛋白制品。以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。
由于抗毒素、抗血清原料来源于马匹血浆，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除了要控制免疫马匹的饲养环境和马匹血浆质量外，在抗毒素、抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的关键问题。
目前国内外较为成熟的病毒灭活、去除方法有：巴氏消毒法、干热法、有机溶剂及去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产抗毒素、抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。
有机溶剂及去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。参照欧洲药品管理局（EMEA）和我国国家食品药品监督管理局发布的，针对人血液制品的相关技术法规，需要在抗毒素、抗血清生产工艺中增加有机溶剂及去污剂处理灭活病毒的步骤，其中有机溶剂选用磷酸三丁酯，去污剂选用Triton X-100。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微。但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。因此，经有机溶剂及去污剂（磷酸三丁酯/ Triton X-100）灭活的抗毒素、抗血清制品中Triton X-100的残留量测定，是涉及其质量控制的关键指标之一。
由于目前在抗毒素、抗血清制品中并无Triton X-100残留测定的通用方法，因而难于有效控制经有机溶剂及去污剂灭活病毒的抗毒素、抗血清制品的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种经有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，该方法能准确地测定抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量，并且方法准简便、快速。
本发明通过下列技术方案实现：一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液、供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗毒素/抗血清中Triton X-100的残留量，其特征在于所述对照品溶液与供试品溶液的制备经过下列各步骤：
（1）将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每1mL溶液中含有5～20μg的Triton X-100的对照品溶液；
（2）取供试品抗毒素、抗血清0.5～1mL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，后用体积浓度为5～10%的甲醇溶液清洗，再用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液。
所述采用高效液相色谱法进行测定的色谱条件为：反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水溶液为流动相，并采用紫外检测器，其检测波长为220～240nm。
所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为9︰1～7︰3。
所述步骤（2）中固相萃取柱的活化是：先用1mL的甲醇通过固相萃取柱，再用1mL水通过固相萃取柱，即得活化的固相萃取柱。
所述甲醇为市购的分析纯产品。
所述步骤（2）中的固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱，为ProElut PLS、Oasis HLB、BOND ELUT PLEXA中的一种。
所述步骤（2）中的供试品抗毒素/抗血清是指经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清。
本发明能对破伤风抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等抗毒素/抗血清制品中的Triton X-100残留量进行测定。
本发明采用高效液相色谱法对Triton X-100残留量进行测定，在免疫球蛋白制品中，含有大量的大分子物质，对高效液相色谱系统尤其是色谱柱的损害较大，因此需在预处理中进行提纯，除去大分子物质，而Triton X-100在免疫球蛋白制品中的残留量极低，处于ppm极，在预处理的过程中容易损失，影响测定的准确性，所以抗毒素、抗血清中Triton X-100的残留量测定是一个技术难点。为了避免Triton X-100在处理过程中的损失，用水和甲醇清洗预活化的固液萃取柱，且用量不可过大，以1mL为宜。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，从根本上解决了现有技术因免疫球蛋白制品中，含有大量的大分子物质，以及Triton X-100在检测过程中损失大，难于检测出Triton X-100残留量的准确值等问题，有效地除去供试品中的大分子物质及杂质，最大限度地降低被测物Triton X-100的损失，确保测定结果的准确性，同时本发明提供的方法准确、快速、简便。
具体实施方式
通过以下的实施例对本发明做进一步阐述，但本发明的保护范围并不限于下列实施例所述内容。
实施例1
破伤风抗毒素中Triton X-100残留量的测定：
仪器：1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240电子天平
试剂与试药：Triton X-100对照品（购自Sigma公司，批号：118K0095）；甲醇为色谱纯（美国Fisher化学试剂公司）；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
经过下列各步骤：
（1）将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每1mL溶液中含有10μg的Triton X-100的对照品溶液；
（2）取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的供试品——破伤风抗毒素0.5mL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为5%的甲醇溶液清洗，再用1mL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液；其中，固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱Oasis HLB；固相萃取柱的预先活化是：先用1mL的甲醇溶液通过固相萃取柱，再用1mL水通过固相萃取柱；
（3）分别吸取步骤（1）所得对照品溶液与步骤（2）所得供试品溶液，按常规采用高效液相色谱法进行测定后，通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到破伤风抗毒素中Triton X-100的残留量为1.5μg/mL。其中，色谱条件为：反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇︰水＝8︰2体积比的混合溶液为流动相，并采用检测波长为230nm的紫外检测器，色谱柱的理论板数按Triton X-100计算不低于1500。
实施例2
抗狂犬病血清中Triton X-100残留量的测定：
仪器：1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240电子天平
试剂与试药：Triton X-100对照品（购自Sigma公司，批号：118K0095）；甲醇为色谱纯（美国Fisher化学试剂公司）；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
经过下列各步骤：
（1）将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每1mL含5μg的Triton X-100对照品溶液；
（2）取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的供试品——抗狂犬病血清1mL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为7%的甲醇溶液清洗，再用1mL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液；其中，固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱ProElut PLS；固相萃取柱的预先活化是：先用1mL的甲醇溶液通过固相萃取柱，再用1mL水通过固相萃取柱；
（3）分别吸取步骤（1）所得对照品溶液与步骤（2）所得供试品溶液，按常规采用高效液相色谱法进行测定后，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗狂犬病血清中Triton X-100的残留量0.9μg/mL。其中，色谱条件为：反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇︰水＝9︰1体积比的混合溶液为流动相，并采用检测波长为220nm的紫外检测器，色谱柱的理论板数按Triton X-100计算不低于1500。
实施例3
抗蛇毒血清中Triton X-100残留量的测定：
仪器：1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240电子天平
试剂与试药：Triton X-100对照品（购自Sigma公司，批号：118K0095）；甲醇为色谱纯（美国Fisher化学试剂公司）；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
经过下列各步骤：
（1）将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每1mL含20μg的Triton X-100对照品溶液；
（2）取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的供试品——抗蛇毒血清0.5mL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为10%的甲醇溶液清洗，再用1mL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液；其中，固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱BOND ELUT PLEXA；固相萃取柱的预先活化是：先用1mL的甲醇溶液通过固相萃取柱，再用1mL水通过固相萃取柱；
（3）分别吸取步骤（1）所得对照品溶液与步骤（2）所得供试品溶液，按常规采用高效液相色谱法进行测定后，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗蛇毒血清中Triton X-100的残留量为2.1μg/mL。其中色谱条件为：反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇︰水＝7︰3体积比的混合溶液为流动相，并采用检测波长为240nm的紫外检测器，色谱柱的理论板数按Triton X-100计算不低于1500。
Claims (6)
1.一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行计算，得到抗毒素、抗血清中Triton X-100的残留量，其特征在于所述对照品溶液与供试品溶液的制备经过下列各步骤：
（1）将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每1mL溶液含有5～20μg的Triton X-100的对照品溶液；
（2）取供试品抗毒素/抗血清0.5～1mL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为5%～10%的甲醇溶液清洗，再用1mL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱法测定的色谱条件为：反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水溶液为流动相，并采用紫外检测器，其检测波长为220～240nm。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于：所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为9︰1～7︰3。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）中的固相萃取柱的活化是：先用1mL的甲醇通过固相萃取柱，再用1mL水通过固相萃取柱，得活化的固相萃取柱。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）中的固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱，为ProElut PLS、Oasis HLB、BOND ELUT PLEXA中的一种。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）中的供试品抗毒素/抗血清是指经过有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清。
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