CN103197018B - 一种养血清脑颗粒蒽醌类成分检测方法 - Google Patents
一种养血清脑颗粒蒽醌类成分检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种养血清脑颗粒蒽醌类成分检测方法，包括以下步骤：步骤1，对照品溶液的制备；步骤2，供试品溶液的制备；步骤3，注入色谱仪，得到色谱图；步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中蒽醌类成分的种类。
Description
技术领域：
本发明涉及一种中药有效成分的检测方法，特别涉及一种养血清脑颗粒蒽醌类成分检测方法。
背景技术：
养血清脑颗粒是由天津天士力制药股份有限公司生产的一种复方中药，以川芎、当归为君药，由11味中药采用现代化制剂工艺精制而成。养血清脑颗粒可以改善软脑膜微循环，增加脑血流量，缓解血管痉挛与止痛，具有养血平肝、活血通络之功效。根据文献报道，决明子中蒽醌类成分具有降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化等功效。
养血清脑颗粒其处方如下：
主药：当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠母、延胡索、细辛。
辅料为：糊精、甜菊素。
决明子是养血清脑颗粒中的重要药味之一，其中主要成分为蒽醌类成分包括：大黄酚(Chrysophanol)、大黄素(Emodin)、芦荟大黄素(Aloeemodin)、大黄酸(Rhein)、橙黄决明素(Aurantio-obtusin,即1,7-二甲氧基-2,6,8-三羟-3-甲基蒽醌)、大黄酚-四吡喃葡萄糖苷(chrysophanol-tetra-β-D-glucopyranoside)3-甲基-2-羟基-1,6,7,8-四甲氧基蒽醌(2-hydroxy-1,6,7,8-tetramethoxy-3-methylanthraquinone)及3-甲基-2,8-二羟基-1,6,7-三甲氧基蒽醌(2,8-dihydroxy-1,6,7-trimethoxy-3-methylanthraquinone)等。
为对养血清脑颗粒中的蒽醌类成分进行检测和分析，本发明对养血清脑颗粒中的化学成分进行分析与研究。以蒽醌部位为研究对象，为制定新的质量标准和有效控制产品质量提供了依据。
发明内容：
本发明经过筛选，获得一种灵敏度高，检测准确，操作简单，成本低廉的养血清脑颗粒蒽醌类成分检测方法。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，对照品溶液的制备；
步骤2，供试品溶液的制备；
步骤3，注入液相色谱-质谱联用色谱仪，得到色谱图；
步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中蒽醌类成分的种类。
根据本发明的检测方法，其中步骤1所述对照品采用橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚。
根据本发明的检测方法，其中，
步骤1所述对照品溶液的制备，步骤如下：准确称取上述对照品(橙黄决明素5.1mg，芦荟大黄素2.85mg，大黄素5.01mg，大黄酚4.18mg)置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。
根据本发明的检测方法，其中步骤2所述供试品溶液采用D101大孔树脂柱和聚酰胺柱制备。
步骤2所述供试品溶液的制备，步骤如下：
精密称取未加入辅料的养血清脑颗粒浸膏100g，用20％的乙醇溶解，以D101大孔树脂柱层析分离，20％乙醇(5倍柱体积)、95％乙醇(5倍柱体积)分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液，将可能的药效物质进行富集。将95％乙醇洗脱液浓缩，用30％乙醇溶液溶解，以100-200目的聚酰胺柱层析分离，30％乙醇(5倍柱体积)、95％乙醇(5倍柱体积)分别洗脱。收集95％乙醇洗脱液即为目标蒽醌部位。
根据本发明的方法，其中步骤3中所述色谱仪为液相色谱-质谱联用仪器，色谱条件如下：
液相条件：色谱柱PhenomenexC18(250×4.60mm,Gemini5μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％的甲酸-水，采用梯度洗脱。体积流量为1.0ml/min，检测波长为254nm，190-500nm全波长扫描，柱温为30℃，进样量10μl；
质谱条件：检测模式为电喷雾离子化(ESI)方式，检测离子为正、负离子，扫描范围100-1000m/z，干燥气的流量为8L/min，干燥气的温度为350℃，雾化气的压力为35psi。
其中，流动相梯度洗脱程序如下：
根据本发明的方法，包括以下步骤：
步骤1，对照品溶液的制备
称取对照品橙黄决明素5.1mg，芦荟大黄素2.85mg，大黄素5.01mg，大黄酚4.18mg，置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液；
步骤2，供试品溶液的制备
称取未加入辅料的养血清脑颗粒浸膏100g，用20％的乙醇溶解，以D101大孔树脂柱层析分离，5倍柱体积20％乙醇、5倍柱体积95％乙醇分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液，将可能的药效物质进行富集；将95％乙醇洗脱液浓缩，用30％乙醇溶液溶解，以100-200目的聚酰胺柱层析分离，5倍柱体积30％乙醇、5倍柱体积95％乙醇分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液即为目标蒽醌部位；
步骤3，注入色谱仪，得到色谱图，色谱仪为液相色谱-质谱联用仪器，色谱条件如下：
液相条件：色谱柱PhenomenexC18(250×4.60mm,Gemini5μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％的甲酸-水，梯度洗脱见表；体积流量为1.0ml/min，检测波长为254nm，190-500nm全波长扫描，柱温为30℃，进样量10μl，质谱条件：检测模式为电喷雾离子化方式，检测离子为正、负离子，扫描范围100-1000m/z，干燥气的流量为8L/min，干燥气的温度为350℃，雾化气的压力为35psi，
流动相梯度洗脱程序
步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中蒽醌类成分的种类。
根据本发明的方法，其中还包括对其中的橙黄决明素、芦荟大黄素及大黄素三个物质含量进行测定的步骤。
本发明的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)及Agilent1200HPLC-6310IONTrapMass液相色谱-质谱联用系统(美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；乙腈(色谱级，美国Merck公司)。
对照品：芦荟大黄素(批号:110795-200806)、大黄素(批号:110756-200110)、大黄酚(批号:110796-200615)、橙黄决明素(批号:111900-201001)，均购自中国药品生物制品检定所，养血清脑颗粒浸膏由天津天士力制药股份有限公司提供(浸膏批号:20100907)。
2方法与结果
2.1色谱条件
液相条件：色谱柱PhenomenexC18(250×4.60mm,Gemini5μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％的甲酸-水，梯度洗脱见表1。体积流量为1.0ml/min，检测波长为254nm，190-500nm全波长扫描，柱温为30℃，进样量10μl；
质谱条件：检测模式为电喷雾离子化(ESI)方式，检测离子为正、负离子，扫描范围100-1000m/z，干燥气的流量为8L/min，干燥气的温度为350℃，雾化气的压力为35psi。
表1流动相梯度洗脱程序
2.2对照品溶液的制备
准确称取上述对照品(橙黄决明素5.1mg，芦荟大黄素2.85mg，大黄素5.01mg，大黄酚4.18mg)置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液[i]。
2.3供试品溶液的制备
精密称取未加入辅料的养血清脑颗粒浸膏100g，用20％的乙醇溶解，以D101大孔树脂柱层析分离，20％乙醇(5倍柱体积)、95％乙醇(5倍柱体积)分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液，将可能的药效物质进行富集。将95％乙醇洗脱液浓缩，用30％乙醇溶液溶解，以100-200目的聚酰胺柱层析分离，30％乙醇(5倍柱体积)、95％乙醇(5倍柱体积)分别洗脱。收集95％乙醇洗脱液即为目标蒽醌部位。
2.4HPLC-DAD-MS/MS特征峰归属
通过液质联用技术，配合供试品与标准品的比较可以完成对物质的定性分析[ii,iii,iv]。本实验以养血清脑颗粒为研究对象，对其中的成分进行药味来源分析，结合质谱碎片信息及混合标准品的成分比较，对特征峰进行了归属指认。供试品与对照品HPLC比较图谱见图1，供试品溶液的液质联用图谱见图2，特征峰归属指认结果见表2，部分蒽醌类物质的结构式见表3。
色谱峰1，通过m/z902.8[M+H]+及939.4[M+Cl]-共同判断该物质分子量为902，结合文献报导[v]及药味归属，判断该物质可能为决明子药味中的大黄酚-四吡喃葡萄糖苷(chrysophanol-tetra-β-D-glucopyranoside)。色谱峰2，通过m/z331.0[M+H]+可推知该化合物的分子量为330，两个碎片离子峰315.6[M-CH3]+及297.6[M-CH3-H2O]+可能通过如路线3所示途径裂解而来。初步推测其可能为橙黄决明素(Aurantio-obtusin)或3-甲基-1,2,8-三羟基-6,7-二甲氧基蒽醌(1,2,8-trihydroxy-6,7-dimethoxy-3-methylanthraquinone)，这两种成分为同分异构体难以通过质谱数据进行鉴别，而在相同的色谱条件下，橙黄决明素标准品与供试品溶液中该物质保留时间相同，最终判断该物质可能为决明子药味中的橙黄决明素[vi]。色谱峰5，通过m/z359.7[M+H]+推测它的分子量为358，而其他质谱碎片离子峰325.8[M-CH3-H2O]+、310.6[M-2CH3-H2O]+的结构推导如路线4。结合文献报导[v]及药味归属，该物质可能为决明子药味中的3-甲基-2-羟基-1,6,7,8-四甲氧基蒽醌(2-hydroxy-1,6,7,8-tetramethoxy-3-methylanthraquinone)。色谱峰6，通过m/z367.4[M+Na]+推测它的分子量为344，307.1[M-2H2O]+可能为3-甲基-2,8-二羟基-1,6,7-三甲氧基蒽醌(2,8-dihydroxy-1,6,7-trimethoxy-3-methylanthraquinone)脱掉两分子水所得，结合文献报导及药味归属，推测其可能为3-甲基-2,8-二羟基-1,6,7-三甲氧基蒽醌。芦荟大黄素(Aloeemodin)、大黄酸(Rhein)、大黄素(Emodin)、大黄酚(Chrysophanol)质谱碎片离子峰分析如表1，而且供试品与混合标准品溶液在相同的色谱条件下保留时间完全一致，进一步验证了这些物质的准确性。
表2.养血清脑颗粒中蒽醌类成分特征峰归属
路线3.化合物2(橙黄决明素)的主要碎裂途径
路线4.化合物5(3-甲基-2-羟基-1,6,7,8-四甲氧基蒽醌)的主要碎裂途径
表3.部分蒽醌类物质的化学结构式
注：(2)橙黄决明素；(3)芦荟大黄素；(4)大黄酸；(5)3-甲基-2-羟基-1,6,7,8-四甲氧基
蒽醌；(6)3-甲基-2,8-二羟基-1,6,7-三甲氧基蒽醌；(7)大黄素；(8)大黄酚
养血清脑颗粒由11味中药组方而成，成分比较复杂，而蒽醌类成分为养血中决明子药味的主要药效成分。养血清脑中蒽醌类成分极性较小，本实验先通过D101进行初步富集，除去大极性的干扰物质，而可能的药效成分则进一步通过聚酰胺柱层析得到，两种树脂的结合使用可以更好的减少大极性物质的干扰，更加有效的富集蒽醌部位。
本试验选用了三根不同厂家的色谱柱进行实验，比较分离度、峰形与柱效，最终确定为PhenomenexC18液相色谱柱。考察了不同的流动相系统，最终确定以乙腈-0.5％甲酸为流动相较为适宜。以获得最多的峰信息为基准考察，通过DAD选择最佳吸收波长，最终确定蒽醌部位最佳吸收波长为254nm。
HPLC-DAD-MS/MS分析技术广泛应用于中药复方制剂分析，结合分子量与碎片离子的双重信息，可以对复方中的化学成分进行快速准确的鉴定。这种分析方法准确性较高，对某些同分异构体也可以得到很好的分析。本实验首先通过有效的分离手段把养血清脑颗粒中的目标蒽醌进行富集，然后对此目标部位进行分析，最终确定了养血清脑颗粒中的8个蒽醌类特征成分。
根据本发明的方法，其中还包括对其中的橙黄决明素、芦荟大黄素及大黄素三个物质含量进行测定的步骤，具体如下：
线性关系考察吸取适量“2.2”项的混合标准品溶液，以峰面积(A)为纵坐标，进样体积μl为横坐标进行线性回归分析。线性回归方程：橙黄决明素y＝21.117x+1.4833,r2＝0.9998，线性范围为0.05μg-0.5μg；芦荟大黄素y＝113.45x+9.6952,r2＝0.9998，线性范围为0.03μg-0.3μg；大黄素y＝128.77x+7.5976,r2＝0.9999，线性范围为0.05μg-0.5μg。结果表明，橙黄决明素、芦荟大黄素及大黄素在一定的线性范围内均有良好的线性。
样品含量测定精密称取蒽醌部位720mg，置于25ml的容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，进样10μl。以外标法计算目标蒽醌部位中的橙黄决明素、芦荟大黄素及大黄素的含量，结果显示三种蒽醌的含量分别为：橙黄决明素15.76mg/g，芦荟大黄素0.40mg/g，大黄素1.37mg/g。
加样回收率精密称取蒽醌部位360mg，分别加入相应量的对照品储备液，测定回收率，平行6份。计算加样回收率，橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素的加样回收率分别为98.6％，99.2％，102.5％，RSD分别为3.1％，2.6％，4.2％。
附图说明：
图1.供试品(A)与对照品(B)HPLC比较图谱，1.橙黄决明素；2.芦荟大黄素；3.大黄素；4.大黄酚；
图2.养血清脑颗粒蒽醌部位LC-MS/MS联用图谱。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)及Agilent1200HPLC-6310IONTrapMass液相色谱-质谱联用系统(美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；乙腈(色谱级，美国Merck公司)。
对照品：芦荟大黄素(批号:110795-200806)、大黄酸(批号:0757-200206)、大黄素(批号:110756-200110)、大黄酚(批号:110796-200615)、橙黄决明素(批号:111900-201001)，均购自中国药品生物制品检定所，养血清脑颗粒浸膏由天津天士力制药股份有限公司提供(浸膏批号:20100907)。
2方法与结果
2.1色谱条件
液相条件：色谱柱PhenomenexC18(250×4.60mm,Gemini5μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％的甲酸-水，梯度洗脱见表1。体积流量为1.0ml/min，检测波长为254nm，190-500nm全波长扫描，柱温为30℃，进样量10μl。
质谱条件：检测模式为电喷雾离子化(ESI)方式，检测离子为正、负离子，扫描范围100-1000m/z，干燥气的流量为8L/min，干燥气的温度为350℃，雾化气的压力为35psi。
表1流动相梯度洗脱程序
2.2对照品溶液的制备
准确称取上述对照品(橙黄决明素6.09mg，芦荟大黄素0.8mg，大黄酸1.11mg，大黄素0.4mg，大黄酚4.41mg)置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液[1]。
2.3供试品溶液的制备
精密称取未加入辅料的养血清脑颗粒浸膏100g，用20％的乙醇溶解，以D101大孔树脂柱层析分离，20％乙醇(5倍柱体积)、95％乙醇(5倍柱体积)分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液，将可能的药效物质进行富集。将95％乙醇洗脱液浓缩，用30％乙醇溶液溶解，以100-200目的聚酰胺柱层析分离，30％乙醇(5倍柱体积)、95％乙醇(5倍柱体积)分别洗脱。收集95％乙醇洗脱液即为目标蒽醌部位。
参考文献
-----------------------
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[vi]胡轶娟，朱军，万丽.决明子HPLC指纹图谱研究[J].中国中医药科技，2008，9，15(5)：365-367.
Claims (4)
1.一种养血清脑颗粒蒽醌类成分检测方法，包括以下步骤：
步骤1，对照品溶液的制备；对照品采用橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素和大黄酚；
步骤2，供试品溶液的制备；精密称取未加入辅料的养血清脑颗粒浸膏100g，用20％的乙醇溶解，以D101大孔树脂柱层析分离，5倍柱体积20％乙醇、5倍柱体积95％乙醇分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液，将可能的药效物质进行富集，将95％乙醇洗脱液浓缩，用30％乙醇溶液溶解，以100-200目的聚酰胺柱层析分离，5倍柱体积30％乙醇、5倍柱体积95％乙醇分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液即为目标蒽醌部位；
步骤3，注入液相色谱-质谱联用色谱仪，得到色谱图；其中液相条件为：色谱柱C18，规格为250×4.60mm,5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％的甲酸-水，采用梯度洗脱，体积流量为1.0ml/min，检测波长为254nm，190-500nm全波长扫描，柱温为30℃，进样量10μl；
流动相梯度洗脱程序如下：
步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中蒽醌类成分的种类，并对其中的橙黄决明素、芦荟大黄素及大黄素三个物质含量进行测定的步骤。
2.根据权利要求1的检测方法，其中步骤1所述对照品溶液的制备，步骤如下：称取对照品橙黄决明素5.1mg，芦荟大黄素2.85mg，大黄素5.01mg，大黄酚4.18mg，置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。
3.根据权利要求1的检测方法，其中质谱条件：检测模式为电喷雾离子化方式，检测离子为正、负离子，扫描范围100-1000m/z，干燥气的流量为8L/min，干燥气的温度为350℃，雾化气的压力为35psi。
4.根据权利要求3的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，对照品溶液的制备
称取对照品橙黄决明素5.1mg，芦荟大黄素2.85mg，大黄素5.01mg，大黄酚4.18mg，置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液；
步骤2，供试品溶液的制备
称取未加入辅料的养血清脑颗粒浸膏100g，用20％的乙醇溶解，以D101大孔树脂柱层析分离，5倍柱体积20％乙醇、5倍柱体积95％乙醇分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液，将可能的药效物质进行富集；将95％乙醇洗脱液浓缩，用30％乙醇溶液溶解，以100-200目的聚酰胺柱层析分离，5倍柱体积30％乙醇、5倍柱体积95％乙醇分别洗脱，收集95％乙醇洗脱液即为目标蒽醌部位；
步骤3，注入色谱仪，得到色谱图，色谱仪为液相色谱-质谱联用仪器，色谱条件如下：
液相条件：色谱柱PhenomenexC18，规格250×4.60mm,Gemini5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％的甲酸-水，梯度洗脱见表；体积流量为1.0ml/min，检测波长为254nm，190-500nm全波长扫描，柱温为30℃，进样量10μl，
质谱条件：检测模式为电喷雾离子化方式，检测离子为正、负离子，扫描范围100-1000m/z，干燥气的流量为8L/min，干燥气的温度为350℃，雾化气的压力为35psi，
流动相梯度洗脱程序
步骤4，根据色谱图得到供试品溶液中蒽醌类成分的种类。
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