CN106124668A - 一种益心舒片的指纹图谱检测方法 - Google Patents

一种益心舒片的指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种益心舒片的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters C18、Syncronis C18或者kromasil C18（4.6mm×250 mm，5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3~1.5%甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0~80min，5%A~90%A；流速为0.8~1.1mL/min；检测波长为250~290nm；柱温为25~35℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。本发明建立了益心舒片的HPLC指纹图谱，以丹参和五味子中的化学成分为主要目标，并通过对照品比对及HPLC‑Q‑TOF‑MS对主要共有峰进行指认，以全面反映产品信息，更好的控制产品的质量，保证临床疗效。

Description

一种益心舒片的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药质量检测方法，特别是一种益心舒片的指纹图谱检测方法。
背景技术
益心舒片是由人参、丹参、五味子、黄芪、川芎、麦冬、山楂共六味药组成的中药复方制剂，其中丹参是君药。其具有益气复脉，活血化瘀，养阴生津的功效，用于气阴两虚，心悸脉结代，胸闷不舒、胸痛及冠心病心绞痛见有上述症状者。目前文献报导较多的是益心舒胶囊的质量标准研究，主要集中在鉴别及含量测定方面，而益心舒片的质量标准研究报导较少，并且也是集中在含量测定方面，尚未见有关益心舒片的指纹图谱研究。为了更好更全面的控制产品质量，保证临床疗效，研发益心舒片的指纹图谱检测方法，对更好的控制产品的质量具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以更全面的反应药品的信息，更有效地控制益心舒片质量的益心舒片的指纹图谱检测方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特点是，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18、Syncronis C18或者kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.3％～1.5％甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为0.8～1.1mL/min；检测波长为250～290nm；柱温为25～35℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
本发明所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法技术方案中，进一步优选的技术方案是：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18、Syncronis C18或者kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5％～1.0％甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A； 流速为0.9～1.1mL/min；检测波长为250～270nm；柱温为28～32℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
本发明所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法技术方案中，进一步优选的技术方案是：色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5％甲酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为1.0mL/min；检测波长为260nm；柱温为30℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
本发明所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法技术方案中，进一步优选的技术方案是：建立益心舒片的标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测益心舒片样品的指纹图谱，然后将其与上述益心舒片的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
本发明所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法技术方案中，进一步优选的技术方案是：
参照峰溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1mL含五味子醇甲100μg的溶液，摇匀，即得；
混合对照品溶液的制备精密称取咖啡酸，阿魏酸，迷迭香酸，丹酚酸B，五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，丹参酮IIA对照品适量，加甲醇制成每1mL含咖啡酸、阿魏酸、丹参酮II A各20μg，含迷迭香酸、五味子甲素、五味子乙素各50μg，含丹酚酸B、五味子醇甲、五味子酯甲各100μg的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇10mL，250W，40kHz超声处理1h，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得；
测定法分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录80分钟的色谱图。
本发明所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法技术方案中，进一步优选的技术方案是：供试品指纹图谱中29个共有峰，以五味子醇甲参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和主要共有峰的相对峰面积，应符合下表规定：
注：计算软件为国家药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)。
注：部分峰因峰面积太小和分离度未达到基线分离，相对峰面积重复性较差，因此不对其进行相对峰面积的 控制。
与现有技术相比，本发明方法的技术效果如下：本发明建立了益心舒片的HPLC指纹图谱，以丹参和五味子中的化学成分为主要目标，并通过对照品比对及HPLC-Q-TOF-MS对主要共有峰进行指认，以全面反映产品信息，更好的控制产品的质量，保证临床疗效。
图谱见附录：
图1为益心舒片的标准指纹图谱；
图2为波长的考察图谱；
图3为流动相系统的考察图谱；
图4为酸浓度的考察图谱；
图5为柱温考察图谱；
图6为流速考察图谱；
图7为色谱柱的考察结果图谱；
图8为延长时间测试滞后峰图谱；
图9为十批益心舒片指纹图谱；
图10为十批益心舒片对照指纹图谱；
图11为益心舒片指纹图谱中各共有峰归属色谱图；
图12为益心舒片指纹图谱中色谱峰的对照品定性图；图中：A混合对照品溶液，B供试品溶液；
7：咖啡酸、9：阿魏酸、13：迷迭香酸、15：丹酚酸B，S：五味子醇甲，21：五味子酯甲，24：五味子甲素，26：五味子乙素，27：丹参酮II A。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种益心舒片的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18、Syncronis C18或者kromasil C18(4.6mm× 250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.3％甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为0.8mL/min；检测波长为250nm；柱温为25℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
实施例2，一种益心舒片的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18、Syncronis C18或者kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为1.5％甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为1.1mL/min；检测波长为290nm；柱温为35℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
实施例3，一种益心舒片的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18、Syncronis C18或者kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5％甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为0.9mL/min；检测波长为250nm；柱温为28℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
实施例4，一种益心舒片的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18、Syncronis C18或者kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为1.0％甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为1.1mL/min；检测波长为270nm；柱温为32℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
实施例5，一种益心舒片的指纹图谱检测方法，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersC18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5％甲酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为1.0mL/min；检测波长为260nm；柱温为30℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
实施例6，实施例1-5任何一项所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法中：建立益心舒片的标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测益心舒片样品的指纹图谱，然后将其与上述益心舒片的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.90。心舒片的标准指纹图谱参照图1。
实施例7，实施例6所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法中：
参照峰溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1mL含五味子醇甲100μg的溶液，摇匀，即得；
混合对照品溶液的制备精密称取咖啡酸，阿魏酸，迷迭香酸，丹酚酸B，五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，丹参酮II A对照品适量，加甲醇制成每1mL含咖啡酸、阿魏酸、丹参酮II A各20μg，含迷迭香酸、五味子甲素、五味子乙素各50μg，含丹酚酸B、五味子醇甲、五味子酯甲各100μg的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇10mL，250W，40kHz超声处理1h，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得；
测定法分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录80分钟的色谱图。
实施例8，一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其方法包括：
(1)建立益心舒片的标准指纹图谱；
照高效液相色谱法；
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：WatersSymmetry ShieildTMC18，4.6mm×250mm，5μm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5％甲酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为1.0mL/min；检测波长为260nm；柱温为30℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000；
参照峰溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1mL含五味子醇甲100μg的溶液，摇匀，即得；
混合对照品溶液的制备精密称取咖啡酸，阿魏酸，迷迭香酸，丹酚酸B，五味子 醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，丹参酮II A对照品适量，加甲醇制成每1mL含咖啡酸、阿魏酸、丹参酮II A各20μg，含迷迭香酸、五味子甲素、五味子乙素各50μg，含丹酚酸B、五味子醇甲、五味子酯甲各100μg的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇10mL，250W，40kHz超声处理1h，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得；
测定法分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录80分钟的色谱图；
(2)按以上相同的方法测定待测益心舒片样品的指纹图谱，然后将其与上述益心舒片的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
供试品指纹图谱中29个共有峰，以五味子醇甲参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，应符合下表规定：
实施例9，益心舒片的指纹图谱检测方法实验。
1.1仪器与试药
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪，MWD紫外检测器；Agilent 1290超高压液相色谱仪，DAD紫外检测器(美国安捷伦公司)；质谱检测器为Agilent 6538Q-TOF-MS，电喷雾(ESI)离子源(美国安捷伦公司)，MettlerAE240电子分析天平(德国梅特勒公司)；BP211D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Centrifuge 5415D高速离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-QAcademic纯水机(美国密理博公司)；KQ-250DB型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。
对照品：迷迭香酸对照品(批号：111871-201404，含量以98.6％计)、咖啡酸对照品(批号：110885-200102)、阿魏酸对照品(批号：110773-201313，含量以99.6％计)、丹酚酸B对照品(111562-201313，含量以97.0％计)，五味子醇甲对照品(批号：110857-201412，含量以99.4％计)，五味子酯甲对照品(批号111529-200503)，五味子甲素对照品(批号：110764-200107)，五味子乙素对照品(批号：110765-200306)，丹参酮II A(批号：110766-200416)，对照品，均购自中国食品药品检定研究院。
试剂：乙腈(色谱纯，美国天地公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
1.2药品来源
本文研究用益心舒片由江苏康缘药业股份有限公司生产。批号分别为：130501、130601、140216、140501、140601、140602、141102、150120、150122、150123。
1.3参照物的选择
益心舒片指纹图谱为主要针对处方中君药丹参及五味子两味药材中的成分建立的指纹图谱，选择含量较高，保留时间适中，分离较好的五味子醇甲作为参照物。
1.4色谱条件考察
1.4.1检测波长的选择
使用多波长检测器，从250nm～320nm每隔10nm设置一个波长，通过获得的指纹图谱发现260nm和270nm波长下，图谱的色谱峰较多，可代表的信息量较大，各色谱峰分离度较好，且基线平稳，最优选择260nm作为益心舒片指纹图谱采集波长，结果见图2。
1.4.2流动相的选择
考虑到丹参中有酸性成分，因此选择酸性流动相进行考察，分别考察甲醇-醋酸水，乙腈-醋酸水，乙腈-三氟乙酸水，乙腈-甲酸水系统，结果显示甲醇-醋酸水系统下基线漂移严重，乙腈-三氟乙酸水系统，峰形较尖锐，峰数目较多，基线平稳，分离度好，乙腈-甲酸系统分离效果与乙腈-三氟乙酸水系统分离效果相当，考虑到三氟乙酸不能进质谱分析，因此选用优选乙腈-甲酸系统作为流动相。结果见图3。
1.4.3流动相酸浓度的选择
分别考察体积浓度为0.1％甲酸，0.5％甲酸，1.0％，1.5％的甲酸对分离效果的影响，结果0.5％与1.0％，1.5％甲酸分离效果相当，综合考虑分离效果及色谱柱的损耗，选择0.5～1.0％的甲酸作为流动相种类，最优选择0.5％，结果见图4。
1.4.4柱温的考察
分别考察了柱温25℃、30℃和35℃时对分离效果的影响，结果柱温为25℃、30℃时各个成分分离度和色谱峰的对称性均较好，因此选择柱温为25～30℃，，最优选择30℃，结果见图5。
1.4.5流速的考察
考察流速为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mL/min所得图谱，结果流速为0.9、1.0、1.1ml/min时各成分分离度和峰型均较好，因此流速可选择0.9～1.1ml/min，考虑到分析时间和色谱柱的损耗最优选择1.0ml/min，结果见图6。
1.4.6色谱柱的选择
对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)、Waters Symmetry ShieildTMC18(4.6mm×250mm，5μm)、Syncronis C18(4.6mm×250mm，5μm)和Phenomenex Gemini C18(4.6mm×250mm，5μm)，结果显示，Waters Symmetry ShieildTMC18对样品的分离效果最好，用两支该类型的色谱柱进行试验，结果重复性较好，因此选择用该类型色谱柱为益心舒片指纹图谱分析柱，结果见图7。
1.4.7滞后峰测试
延长测试时间至120min，结果80min后无色谱峰，因此在益心舒片指纹图谱测定时，色谱条件适宜，无滞后成分影响样品测定，结果见图8。
综上所述，确定益心舒片指纹图谱测定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Waters Symmetry ShieildTMC18柱(4.6×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.5％甲酸为流动相B，梯度洗脱，0～80min，5％A～90％A；流速为1.0ml/min；检测波长为260nm；柱温为30℃；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
1.5供试品溶液的制备
1.5.1提取溶剂的选择
取批号为150122批的益心舒片10片，除去包衣，研细，称取9份，每份约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇各10mL，超声提取(250W，40KHz)1h，放冷，离心，取上清液，测定。以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标，试验结果表明，75％甲醇提取时色谱峰数目较多，且主峰峰面积除以取样量的值较大，因此选择75％甲醇作为提取溶剂。
1.5.2提取方法的选择
取批号为150122批的益心舒片10片，除去包衣，研细，称取2份，每份约1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇10mL，考察超声提取(250W，40KHz)1h和回流提取1h，放冷，离心，取上清液，测定，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标，试验结果表明，超声与回流两种方式提取效果相当，考虑到超声提取操作简单易行，选择超声提取法。
综合上述试验结果，确定益心舒片指纹图谱供试品溶液的制备方法为：取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇10mL，超声(250W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得。
1.6精密度试验
取批号为150122批的益心舒片，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品10μL，重复进样6次，记录色谱图。以五味子醇甲为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰相对保留时间的RSD均小于0.10％；相对峰面积的RSD均小于2.89％，见表2-1和表2-2。结果表明该仪器精密度良好。
表2-1益心舒片指纹图谱精密度考察结果(相对保留时间)
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
1 0.152 0.152 0.152 0.152 0.152 0.152 0.069
2 0.165 0.165 0.165 0.165 0.165 0.165 0.045
3 0.275 0.275 0.275 0.275 0.275 0.275 0.071
4 0.365 0.365 0.365 0.365 0.365 0.365 0.031
5 0.396 0.396 0.396 0.396 0.396 0.396 0.062
6 0.406 0.406 0.406 0.406 0.406 0.406 0.040
7 0.428 0.428 0.428 0.427 0.427 0.427 0.041
8 0.464 0.464 0.464 0.464 0.464 0.464 0.015
9 0.556 0.556 0.556 0.556 0.556 0.556 0.020
10 0.581 0.581 0.581 0.581 0.580 0.580 0.007
11 0.609 0.608 0.609 0.608 0.608 0.608 0.016
12 0.623 0.622 0.623 0.622 0.622 0.622 0.020
13 0.638 0.638 0.638 0.637 0.637 0.637 0.020
14 0.670 0.669 0.670 0.669 0.669 0.669 0.021
15 0.716 0.716 0.716 0.716 0.716 0.716 0.023
16 0.753 0.753 0.753 0.753 0.753 0.753 0.023
17 0.989 0.989 0.989 0.989 0.989 0.989 0.021
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
19 1.088 1.088 1.088 1.088 1.088 1.088 0.008
20 1.171 1.171 1.171 1.171 1.170 1.170 0.007
21 1.280 1.281 1.280 1.280 1.280 1.280 0.015
22 1.302 1.303 1.302 1.302 1.302 1.302 0.016
23 1.385 1.385 1.385 1.385 1.384 1.384 0.024
24 1.414 1.414 1.414 1.413 1.413 1.413 0.017
25 1.478 1.478 1.478 1.478 1.477 1.477 0.021
26 1.493 1.493 1.493 1.493 1.492 1.492 0.022
27 1.503 1.503 1.503 1.503 1.502 1.502 0.023
28 1.521 1.521 1.521 1.521 1.521 1.520 0.023
29 1.544 1.544 1.544 1.544 1.543 1.543 0.025
表2-2益心舒片指纹图谱精密度考察结果(相对峰面积)
1.7稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0h、3h、8h、11h、16h、24h进样，记录指纹色谱图谱，共测定6个时间点，以五味子醇甲为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各峰相对保留时间的RSD均小于0.42％；相对峰面积的RSD均小于3.12％，见表3-1和表3-2。结果表明供试品溶液在室温条件下24小时内稳定性良好。
表3-1益心舒片指纹图谱稳定性考察结果(相对保留时间)
表3-2益心舒片指纹图谱稳定性考察结果(相对峰面积)
1.8重复性试验
取益心舒片样品，按供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份，依法测定。以五味子醇甲为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰相对保留时间的RSD均小于0.63％；相对峰面积的RSD均小于4.88％，见表4-1和表4-2。结果表明该方法重复性良好。
表4-1益心舒片指纹图谱重复性考察结果(相对保留时间)
表4-2益心舒片指纹图谱重复性考察结果(相对峰面积)
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
1 0.220 0.217 0.225 0.218 0.221 0.217 1.40
2 0.076 0.079 0.076 0.077 0.075 0.075 1.97
3 0.340 0.345 0.354 0.353 0.355 0.352 1.71
4 0.035 0.036 0.034 0.034 0.035 0.033 3.04
5 0.037 0.035 0.034 0.035 0.034 0.036 3.32
6 0.022 0.023 0.021 0.022 0.021 0.020 4.88
7 0.026 0.025 0.025 0.026 0.025 0.027 3.18
8 0.087 0.088 0.09 0.089 0.088 0.088 1.17
9 0.056 0.056 0.057 0.055 0.058 0.054 2.53
10 0.179 0.181 0.186 0.179 0.185 0.186 1.85
11 0.054 0.055 0.053 0.053 0.055 0.054 1.66
12 0.064 0.066 0.061 0.065 0.064 0.064 2.61
13 0.135 0.134 0.128 0.127 0.128 0.13 2.60
14 0.183 0.181 0.184 0.179 0.179 0.182 1.14
15 1.714 1.718 1.713 1.715 1.717 1.719 0.14
16 0.051 0.049 0.051 0.05 0.052 0.048 2.93
17 0.024 0.023 0.023 0.025 0.023 0.024 3.45
S 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
19 0.285 0.284 0.285 0.286 0.288 0.290 0.79
20 0.172 0.175 0.169 0.173 0.173 0.167 1.72
21 0.075 0.073 0.071 0.072 0.073 0.071 2.09
22 0.231 0.231 0.230 0.227 0.228 0.229 0.71
23 0.119 0.123 0.125 0.117 0.118 0.120 2.56
24 0.139 0.139 0.137 0.138 0.140 0.147 2.56
25 0.081 0.082 0.081 0.079 0.083 0.080 1.75
26 0.637 0.631 0.636 0.629 0.632 0.632 0.48
27 0.077 0.075 0.073 0.079 0.075 0.076 2.69
28 0.034 0.034 0.036 0.035 0.035 0.034 2.36
29 0.059 0.060 0.065 0.062 0.063 0.059 3.95
1.9指纹图谱的建立
1.9.1十批益心舒片指纹图谱的检测
取10批益心舒片，按上述规定的方法进行测定，不同批次的益心舒片指纹图谱见图9。
1.9.2共有峰的确定及对照指纹图谱的获得
将十批益心舒片指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统。选择10批益心舒片指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成益心舒片的对照指纹图谱，见图10。计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积和相似度，结果见表5-1、5-2、6。
表5-1十批益心舒片共有峰相对保留时间
表5-2十批益心舒片主要共有峰相对峰面积
表6 10批益心舒片指纹图谱相似度结果
批号 相似度 批号 相似度
150123 0.953 140601 0.961
150122 0.959 140501 0.936
150120 0.964 140216 0.991
141102 0.932 130601 0.973
140602 0.954 130501 0.951
十批益心舒片指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.932，暂定益心舒片用益心舒片指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.90。根据十批指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间，暂定本品指纹图谱中各共有峰相对保留时间和相对峰面积应符合表7的限度范围。
1.10指纹图谱中共有峰的归属
通过与处方中的七味药材制备的样品图谱比较，结果显示益心舒片指纹图谱中的成分主要来自丹参、五味子、川芎药材，山楂、麦冬、人参药材对共有峰几乎没有贡献。结果见图11。
1.11指纹图谱中主要共有峰的指认
质谱条件：ESI离子源，正负离子模式，毛细管电压3500V，雾化室电压40psi，干燥气流速10l/min，加热毛细管温度350℃，源内裂解电压175V，传输电压65V，质量数扫描范围m/z100～1000，碰撞能量为20～25V。
本实验用对照品比对，结合HPLC-Q-TOF-MS质谱图中化合物的质荷比及相关参考文献对主要共有峰进行了指认。在实验条件下，供试品中的酚酸类成分对质谱负离子检测有较好的响应，其它成分对正离子检测有较好的响应。质谱结果与对照品结果一致，对照品比对的HPLC结果见图12，MS结果见表8。
表8益心舒片主要共有峰的HPLC-Q-TOF-MS分析
峰号 保留时间 分子量 离子化模式 测定值 选择离子 化合物名称
7 18.771 180.2 ESI- 179.0345 [M-H]- 咖啡酸
9 24.422 194.0 ESI- 193.0505 [M-H]- 阿魏酸
13 27.990 360.33 ESI- 359.0775 [M-H]- 迷迭香酸
14 29.396 492.44 ESI- 491.1144 [M-H]- 丹酚酸C
15 31.446 718.60 ESI- 717.1473 [M-H]- 丹酚酸B
18 43.904 432.5 ESI+ 415.2141 [M-OH]+ 五味子醇甲
19 47.756 416.47 ESI+ 399.1816 [M-OH]+ 五味子醇乙
21 56.216 536.60 ESI+ 559.1949 [M+Na]+ 五味子酯甲
22 57.178 296.35 ESI+ 297.1491 [M+H]+ 隐丹参酮
24 62.061 416.51 ESI+ 417.2329 [M+H]+ 五味子甲素
26 65.534 400.46 ESI+ 401.1974 [M+H]+ 五味子乙素
27 65.969 294.34 ESI+ 295.1343 [M+H]+ 丹参酮IIA

Claims (6)

1.一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法采用以下方法建立益心舒片的标准指纹图谱：采用高效液相色谱法，
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters C18、Syncronis C18或者kromasil C18 ，4.6mm× 250 mm，5 μm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.3%~1.5%甲酸、醋酸或三氟乙酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，0~80min， 5%A~90%A；流速为0.8~1.1mL/min；检测波长为250~290nm；柱温为25~35℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
2.根据权利要求1所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特征在于：色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：Waters C18、Syncronis C18或者kromasil C18 ，4.6mm× 250 mm，5 μm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5%~1.0%甲酸、醋酸或三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，0~80min， 5%A~90%A；流速为0.9~1.1mL/min；检测波长为250~270nm；柱温为28~32℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
3.根据权利要求1所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特征在于：
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱： WatersC18，4.6mm× 250 mm，5 μm；以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.5%甲酸为流动相B，梯度洗脱，0~80min， 5%A~90%A；流速为1.0mL/min；检测波长为260nm；柱温为30℃，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。
4.根据权利要求1－3任何一项所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特征在于：建立益心舒片的标准指纹图谱后，按相同的方法测定待测益心舒片样品的指纹图谱，然后将其与上述益心舒片的标准指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
5.根据权利要求4所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特征在于：
参照峰溶液的制备 精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1mL含五味子醇甲100μg的溶液，摇匀，即得；
混合对照品溶液的制备 精密称取咖啡酸，阿魏酸，迷迭香酸，丹酚酸B，五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素，丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成每1mL含咖啡酸、阿魏酸、丹参酮ⅡA各20μg，含迷迭香酸、五味子甲素、五味子乙素各50μg，含丹酚酸B、五味子醇甲、五味子酯甲各100μg的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备 取益心舒片10片，除去包衣，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇10mL，250 W，40 kHz超声处理1h，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得；
测定法 分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，记录80分钟的色谱图。
6.根据权利要求5所述的一种益心舒片的指纹图谱检测方法，其特征在于：供试品指纹图谱中29个共有峰，以五味子醇甲参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和主要共有峰的相对峰面积，应符合下表规定：
。
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