CN101288699A - 一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于控制延胡索及其制剂质量及药效的指纹图谱及其制法，它公开该指纹图谱为延胡索中抗心肌缺血活性部位的指纹图谱，该活性部位以季铵碱类成分为主要组成部分，其中非洲防己碱(columbamine)、13－甲基脱氢紫堇达明碱(13－methyldehydrocorydalmine)、脱氢紫堇鳞茎碱(dehydrocorybulbine)、巴马汀(palmatine)、脱氢延胡索碱(dehydrocorydaline)5种为主要季铵碱类成分。本发明通过建立延胡索活性部位的指纹图谱，可以鉴别样品的真伪和评价延胡索药材或制剂的质量和疗效，使延胡索及其制剂的质量有了真正可控制的标准，确保产品的质量稳定。本发明制作该指纹图谱的方法操作简便，准确可靠，适于在延胡索及其制剂的质量控制方面使用。

Description

一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法

技术领域

本发明属延胡索原料质量控制方法领域，特别是涉及一种利用延胡索抗心肌缺血活性部位的指纹图谱来控制延胡索及其制剂质量和药效的方法。

背景技术

我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量控制标准和科学的检测手段，难以有效地控制其内在质量，尤其缺乏与其功效相关联的有效成分(群)的质量控制方法，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展，加强中药原料质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药原料进行科学的质量控制，才能保证中药的质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。

延胡索为罂粟科(Papaveraeeae)紫堇属(Corydalis)植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎，是著名的“浙八味”之一。延胡索又名延胡、玄胡索、元胡索、元胡，味辛、苦、温，归肝、脾经，具有活血散瘀、行气止痛的功效。延胡索始载于《本草拾遗》，作为传统镇痛药和活血化瘀药在我国医药学的应用中已有两千多年的历史，古代和现代中医用延胡索主要用于气血瘀滞诸痛证，主治胸痹心痛，脘腹疼痛，腰痛，疝气痛，痛经，经闭，产后瘀滞腹痛，跌打损伤等。

延胡索的化学成分目前发现的主要是生物碱，至今共从其块茎中发现二十五种，按其化学结构可分为原小檗碱类、原托品碱类、阿朴菲类、苯并菲啶类、苯酞异喹啉类、苄基异喹啉类、异喹啉苄咪唑啉类等几种类型的生物碱，其中多数属原小檗碱类和阿朴菲类。如按其氨基氮的性质划分则可分为叔胺碱和季铵碱两大类。近代对延胡索的研究主要集中于中枢神经系统方面，延胡索中的叔胺碱类多显示镇痛、镇静及安定作用，延胡索乙素为代表化合物；如将延胡索乙素脱氢转化为相应的季铵碱(棕榈碱)，即失去其镇痛、镇静作用，相反，小檗碱氢化成相应的叔胺碱，就显示较强的镇痛和镇静作用，说明它们的药理作用与其氨基氮的性质密切相关。

我国古代医籍较多提到使用延胡索治疗心痛、胸痹，如《雷公炮炙论》称“心痛欲死，速觅元胡”，东晋葛洪著《肘后备急方》也主张用元胡治心痛，现代在治疗心血管疾病的方剂中亦广泛应用；现代药理研究证明，延胡索在增加冠脉血流量，改善心肌缺血、缺氧等方面具有显著的作用，初步确定延胡索对心血管系统有显著作用的主要是季铵生物碱类成分。

目前，对延胡索及其制剂的质量控制方法决大多数集中于对延胡索乙素的HPLC分析，而对其所含的季胺类生物碱的测定很少报道，不能系统、完整地反映延胡索内在质量，尤其是没有与其特定功效相关联的质量控制方法。要全面有效地控制延胡索及其制剂的质量，必须对其物质群整体予以控制。指纹图谱提供了这样一种方法，将常规的单一指标成分或活性成分为质量控制的指标提升到一个新的阶段，用色谱的指纹特征，和通过指纹图谱得到的量化参数，更有效地鉴别真伪，控制质量。近年来，很多中药都进行了指纹图谱的研究。李先端等报道了不同品种醋制延胡索指纹图谱的比较研究(中药材，2007，30(2)：114-146)，窦志英等报道了陕西产延胡索药材HPLC指纹图谱研究(天津中医药大学学报，2007，26(3)：150-153)，梁晶等报道了延胡索药材HPLC指纹图谱的化学模式识别研究(药物分析杂志，2006，26(12)：1698-1701)，但都没有说明该指纹图谱反映的是哪种成分部位及与延胡索的抗心肌缺血是否相关。

从以上所述可以看出，延胡索不同的化学成分有着各自不同的药理作用，目前延胡索及其制剂的质量还没有真正可控制的技术，没有应用于生产中药材的质量控制，尤其是没有与其特定功效相关联的质量控制方法。根据延胡索现有的化学成分和药理临床研究资料，以及申请人对延胡索抗心肌缺血作用的研究进展，确定需要表征活性部位和主要活性成分为季铵碱类成分，因此要求能全面体现延胡索药材中季铵碱类成分的整体特征。采用液相色谱-质谱(LC/MS/MS)联用技术，对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，保证了延胡索中有效成分在指纹图谱中被充分体现。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法。本发明通过对延胡索抗心肌缺血活性部位HPLC指纹图谱的研究，提供了一种更好的延胡索及其制剂的质量控制方法，尤其是与其特定功效相关联的质量控制方法。弥补了现有质量控制技术的不足，使延胡索及其制剂的质量有了真正可控制的标准，确保产品的质量稳定。

本发明通过对延胡索药材进行组分分离和活性筛选，从中获得一种具有显著抗心肌缺血活性的提取物，该提取物为首次从延胡索中提取分离得到，其抗心肌缺血活性明显强于延胡索其它部位，其抗心肌缺血活性的结果如表1、表2所示。

延胡索抗心肌缺血活性部位的确定

(1)对异丙肾上腺素(ISO)诱发心肌缺血小鼠缺氧存活时间的影响

小鼠随机分为7组，每组8只：延胡索活性部位低剂量给药组，中剂量给药组，高剂量给药组，粗提物组，无生物碱组，模型组和空白对照组。模型组和空白对照组给予等容积的生理盐水。各组连续灌胃给药3d，在第3天给药后1h，除空白对照组外均尾静脉注射ISO2mg/kg。15min后，放入250mL底部盛有7.5g钠石灰的广口瓶，密闭，记录小鼠窒息死亡时间。组间采用t检验进行显著性分析，以P＜0.05作为显著性差异的标准。结果见表1。

(2)对异丙肾上腺素(ISO)诱发大鼠心肌缺血的影响

经初筛合格的大鼠随机分为6组，每组8只：空白对照组，模型组，延胡索活性部位低剂量组、中剂量组、高剂量组和粗提物组。实验开始后，给药低剂量组、中剂量组、高剂量组和粗提物组均按10mL/kg体重灌胃给予相应药物，空白对照及模型组灌服同体积蒸馏水，每天给药1次，连续7天。从实验第5天开始，除空白对照组腹腔注射同体积生理盐水外，其余各组均于灌胃给药后1h腹腔注射ISO注射液(5mg/kg)，连续注射3天，时间间隔均为24h。造成大鼠急性心肌缺血模型。末次注射ISO后2h处死大鼠，颈动脉取血，离心提取血清。按试剂盒提供的方法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、NO活性。数据以X±S表示，组间采用t检验进行显著性分析，以P＜0.05作为显著性差异的标准。结果见表2。

表1对ISO诱导心肌缺氧小鼠存活时间的影响(x±s，n＝8)

与空白对照组比较^#P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.01

表2对ISO诱发心肌缺血大鼠血清LDH、CK、NO的影响(x±s，n＝8)

与空白对照组比较^#P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

减少心肌耗氧量、增加心肌供血是抗心肌缺血药物的重要疗效指标。已研究证实，血中心肌酶LDH、CK的含量对急性心肌缺血具有检测意义，可提示心肌组织的损伤。近年的研究表明NO具有较强的舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、抗血小板聚集、粘附和释放活性物质作用，可防止血管痉挛和血栓形成。血管内皮细胞持续释放NO，对于维持心血管系统恒定的舒张状态和冠脉的基础张力，调节血压和心肌血液灌流具有重要作用。表1、表2结果表明，延胡索活性部位不仅可以显著延长模型小鼠的缺氧存活时间，而且可以明显降低血清心肌酶LDH、CK的含量，提高大鼠急性心肌缺血后NO水平，表明延胡索活性部位可有效防治由ISO所致心肌缺血及缺血损伤，保护心肌细胞；对内源性血管活性物质和心肌保护物质的代谢也起到积极调节作用，并有显著的提高心肌耐缺氧缺血作用，提示延胡索活性部位对心肌缺血具有良好的作用，从而确定该部位为延胡索抗心肌缺血活性部位。同时也提示，延胡索活性部位抗心肌缺血作用可能为扩张血管、降低心肌耗氧量等作用的综合结果，血管内皮细胞保护效应是该活性部位抗心肌缺血缺氧重要机理之一。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现：

本发明用延胡索中的抗心肌缺血活性部位制作指纹图谱，通过系统化学分离和结构鉴定，以及LC/MS/MS分析，表明该活性部位以季铵碱类成分为主要组成部分，其中非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀、脱氢延胡索碱5种为主要季铵碱类成分。

本发明通过指纹图谱的建立来表征该活性部位中的成分及其相互关系，其指纹图谱的分析方法为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.2％～1％醋酸水溶液(含0.2％三乙胺)，等度洗脱；流速0.8～1.2mL/min；柱温20～40℃；检测波长210～350nm。在上述条件下，分别吸取对照品溶液和延胡索或其制剂的抗心肌缺血活性部位的供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪进行分析，在此条件下，制作延胡索及其制剂中抗心肌缺血活性部位的指纹图谱。该指纹图谱中包含不少于12个色谱峰，色谱中5种主要季铵碱类成分分别为：3号峰：非洲防己碱，6号峰：13-甲基脱氢紫堇达明碱，7号峰：脱氢紫堇鳞茎碱，10号峰：巴马汀，12号峰：脱氢延胡索碱，其中脱氢延胡索碱是一个重要的活性成分。

本发明选取多批不同批号的样品，进行HPLC指纹图谱分析。对合适样品的HPLC指纹图谱中所有色谱峰进行比较，确定其共有峰。选取含量较高的脱氢延胡索碱作为指标成分峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，用指纹图谱软件对所得数据和图谱进行处理，即得到延胡索抗心肌缺血活性部位的对照指纹图谱。该对照指纹图谱表达了延胡索中季铵碱类成分的整体分布特征。

建立对照指纹图谱的样品选择，按照以下原则进行：结合药效实验情况，优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。将指纹图谱和定量测定结果进行对照比较，剔除特别不合理的样品，优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。结合指纹图谱和定量分析结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰形(峰的形状和峰高比例)较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。

本发明通过某一延胡索或其制剂指纹图谱的整体特征，包括色谱峰组成、峰值大小、各峰之间的比例，结合主要季铵碱类成分非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀、脱氢延胡索碱等的定量分析与延胡索抗心肌缺血活性部位的对照指纹图谱比较，来鉴别样品的真伪和评价延胡索药材或制剂的质量和疗效。

本发明的制作方法中所指延胡索及其制剂抗心肌缺血活性部位的供试品溶液为：取延胡索药材或制剂粉末，用50～95％乙醇回流提取1～3次，每次1～4小时，提取液经过大孔吸附树脂，用2～10％氨水洗去杂质，再用30～95％乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得到活性部位。取活性部位20mg，用80％甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

本发明的制作方法中所指对照品溶液为：包括至少5种主要季铵碱类成分：非洲防己碱，13-甲基脱氢紫堇达明碱，脱氢紫堇鳞茎碱，巴马汀，脱氢延胡索碱的混合溶液。

本发明的制作方法中所述指纹图谱是在测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即脱氢延胡索碱对照品溶液的色谱峰面积重现性RSD不高于3％，保留时间重现性RSD不高于2％；脱氢延胡索碱和相邻峰的分离度不小于1.5；色谱柱柱效以脱氢延胡索碱峰计不少于3000块理论塔板数。

本发明通过抗心肌缺血实验筛选得到了延胡索中具有抗心肌缺血作用的活性部位，通过对该活性部位的化学成分分离及结构鉴定，以及LC/MS/MS分析，确定该活性部位以季铵碱类成分为主要组成部分，鉴定的生物碱成分有别隐品碱，非洲防己碱，fumaricine，黄连碱，13-甲基脱氢紫堇达明碱，脱氢紫堇鳞茎碱，corysamine，13-methylpalmatrubine，巴马汀，小檗碱，脱氢延胡索碱。其中季铵碱类成分9个，占总峰面积的80％以上，非洲防己碱，13-甲基脱氢紫堇达明碱，脱氢紫堇鳞茎碱，巴马汀，脱氢延胡索碱5种为主要季铵碱类成分。

分别以包括非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀、脱氢延胡索碱等在内的主要季铵碱类成分为对照，通过HPLC方法，建立了该活性部位的指纹图谱，并对其中的成分进行了紫外(UV)光谱识别，各色谱峰的UV在210～350nm波长内均有三个较强吸收峰，证实了该活性部位的主要成分为季铵类生物碱。该活性部位指纹图谱中包含不少于12个色谱峰，这些色谱峰的组成、峰值大小、各峰之间的比例依延胡索的来源和产地而异。通过所制作的延胡索或其制剂活性部位指纹图谱，与延胡索活性部位的对照指纹图谱进行比较，以及结合指标成分(如脱氢延胡索碱)的定量分析结果，可以综合评价延胡索药材或制剂的质量。即某一来源的延胡索药材或制剂的活性部位指纹图谱中各色谱峰的组成、峰值大小、各峰之间的比例代表了该延胡索中季铵类生物碱活性成分组成、各组成成分的量的多少和它们之间的相对比值，通过与延胡索活性部位的对照指纹图谱进行比较，并通过己知成分(如脱氢延胡索碱等)的定量分析，可以以数据的形式表明其中已知成分的含量，从其含量的高低也能反映延胡索的质量。这种通过某一延胡索活性部位的指纹图谱的整体特征结合指标成分的定量分析，不仅可以鉴别样品的真伪，而且可以控制延胡索及其制剂的质量。

A.样品真伪的鉴别

根据公式计算九批样品指纹图谱中各特征峰的相对保留时间RRT(RRT＝特征峰的保留时间/指标峰的保留时间)，结合两个实验室的验证结果，确定了各特征峰的相对保留时间和范围(表3)。

9个特征指纹图谱鉴别峰平均相对保留时间为：3号峰：非洲防己碱0.44，4号峰：fumaricine0.48，5号峰：黄连碱0.52，6号峰：13-甲基脱氢紫堇达明碱0.56，7号峰：脱氢紫堇鳞茎碱0.61，9号峰：13-methylpalmatrubine 0.73，10号峰：巴马汀0.77，11号峰：小檗碱0.87，12号峰：脱氢延胡索碱1.00。

表3延胡索HPLC特征指纹图谱鉴别峰平均相对保留时间和范围

根据实验条件对待测样品进行测定，得出样品的HPLC指纹图谱，计算各特征峰的相对保留时间，并与所列对照指纹图谱和相对保留时间表进行比较，如各特征峰均存在，而且相对保留时间(RRT)吻合，则可确定为该原料。

B.样品质量控制

采用中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件(国家药典委员会)，将九批样品的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，以12个特征峰计算得到的相似度应不小于0.9(表4)。

表4九批样品指纹图谱的相似度

根据实验条件对待测样品进行测定，得出样品的HPLC指纹图谱，与对照指纹图谱进行比较，并以各特征峰计算不同批次样品指纹图谱的相似度，如相似度大于0.9，说明不同批次的同一种样品其指纹图谱保持基本一致，反映了该样品的化学组成及含量分布状况，所建立的指纹图谱具有稳定性和可控性，可以确保产品质量和药效的稳定。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、研究表明，延胡索不同类型的化学成分有着各自不同的药理作用。因此对其某一种活性成分进行检测，就有失全面。本发明以延胡索季铵碱类成分建立起来的HPLC指纹图谱，代表了延胡索在心血管系统方面的药理作用，能有效表征延胡索及其制剂的质量，提供了一种全面评价延胡索原料质量的科学方法，适于在延胡索及其制剂质量控制方面使用。

2、延胡索活性部位的指纹图谱能全面体现延胡索中季铵碱类成分的整体特征。采用液相色谱-质谱联用技术，对指纹图谱中的主要色谱峰进行了归属，保证了延胡索中有效成分在指纹图谱中被充分体现。

3、将延胡索指纹图谱作为一个整体看待，注重其整体面貌特征，既避免了只测定一、二个化学成分来判定延胡索整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价延胡索质量提供了新的对照标准，为提高延胡索及其制剂的质量和疗效做出了贡献。

4、本发明具有方法简便、稳定、精密度高以及重现性好等特点。由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。因此本发明在选择的波长下进行测定，充分反映了延胡索季铵碱类成分的信息，不仅分离时间短，节约了检验的成本和时间，而且各色谱峰吸收值良好，分离效果满意，基线平稳。

附图说明：

图1本发明对照品的HPLC色谱图(3号峰：非洲防己碱，5号峰：黄连碱，6号峰：13-甲基脱氢紫堇达明碱，7号峰：脱氢紫堇鳞茎碱，9号峰：13-methylpalmatrubine，10号峰：巴马汀，11号峰：小檗碱，12号峰：脱氢延胡索碱)

图2 8个主要季铵碱类成分的UV图谱(1：非洲防己碱，2：黄连碱，3：13-甲基脱氢紫堇达明碱，4：脱氢紫堇鳞茎碱，5：13-methylpalmatrubine，6：巴马汀，7：小檗碱，8：脱氢延胡索碱)

图3延胡索抗心肌缺血活性部位HPL C对照指纹图谱

图4九批延胡索活性部位样品HPLC指纹图谱

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实验例1

延胡索药材：中国浙江

仪器：Waters 2690型高效液相色谱仪(515泵，996 PAD检测器，Millennium³²工作站)；Agilent 1100型高效液相色谱仪和API 3000型质谱检测器(Analyst 1.1数据处理系统)；中药色谱指纹图谱相似度评价软件(国家药典委员会，2004A版)。

活性部位供试品溶液的制备：

延胡索药材适度粉碎，用80％乙醇回流提取3次，每次4小时，提取液经过X-5大孔吸附树脂，先用5％氨水洗去杂质，再用50％乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得延胡索活性部位。取活性部位20mg，用80％甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：

称取非洲防己碱、黄连碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、13-methylpalmatrubine、巴马汀、小檗碱、脱氢延胡索碱溶液对照品各适量，加甲醇溶解制成每mL含非洲防己碱39.60μg、黄连碱9.93μg、13-甲基脱氢紫堇达明碱9.98μg、脱氢紫堇鳞茎碱39.92μg、13-methylpalmatrubine 5.13μg、巴马汀41.60μg、小檗碱9.95μg、脱氢延胡索碱126.88μg的溶液，即得对照品溶液。

测定色谱条件：

色谱柱为Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.8％醋酸水溶液(含0.2％三乙胺)(24∶76)；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长335nm。

指纹图谱建立：

在上述色谱条件下，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行分析，制作指纹图谱。对照品的HPLC色谱图如图1所示，其中3号峰：非洲防己碱，5号峰：黄连碱，6号峰：13-甲基脱氢紫堇达明碱，7号峰：脱氢紫堇鳞茎碱，9号峰：13-methylpalmatrubine，10号峰：巴马汀，11号峰：小檗碱，12号峰：脱氢延胡索碱。上述8个季铵碱成分在210～350nm波长内均有三个较强吸收峰，如图2所示。

通过对三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即脱氢延胡索碱对照品溶液的色谱峰面积重现性RSD不高于3％，保留时间重现性RSD不高于2％；脱氢延胡索碱和相邻峰的分离度不小于1.5；色谱柱柱效以脱氢延胡索碱峰计不少于3000块理论塔板数。

共有峰的标定：

经过比较九批延胡索活性部位样品的色谱图，确定了12个共有指纹峰，其峰面积占总峰面积的90.82％，其中12号峰(脱氢延胡索碱)占总峰面积的44％，峰面积大，分离度好，作为参照峰，以其保留时间和峰面积作为1，分别计算其它各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，得到活性部位样品的指纹图谱的相关技术参数。以12个共有指纹峰相对保留时间和相对峰面积进行方法学考察，结果显示，其精密度试验的RSD分别为0.02～0.38％和0.13～2.67％；重复性试验的RSD分别为0.05～0.25％和0.50～2.50％；稳定性试验的RSD分别为0.11～0.50％和0.15～2.19％。表明所建立方法稳定可靠。

相似度评价：

采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)。该软件具有生成对照图谱的功能，如图3所示。将九批样品的HPLC指纹图谱(如图4所示)与对照指纹图谱进行比较，以12个特征峰计算不同批次样品指纹图谱的相似度，结果均在0.99以上，见表4。

对共有特征峰的描述：

(1)特征峰共12个，其中以脱氢延胡索碱的峰面积最大。

(2)共有特征峰的整体相似度较高，说明指纹图谱的相似性较好，所得对照指纹图谱如附图3。

(3)5种主要季铵碱(峰3、6、7、10、12)色谱峰峰面积比值为：非洲防己碱∶13-甲基脱氢紫堇达明碱∶脱氢紫堇鳞茎碱∶巴马汀∶脱氢延胡索碱＝0.198±0.007∶0.068±0.005∶0.181±0.002∶0.326±0.013∶1。

(4)8种主要季铵碱含量测定结果见表5，其总含量约占活性部位的30％。

表5延胡索活性部位中8种季铵碱的平均含量

以上实验结果显示，应用该方法对延胡索及其制剂抗心肌缺血活性部位进行测定，操作简便，方法可靠，建立的延胡索指纹图谱质量控制方法，能够运用于实际生产中的质量控制，满足药材鉴别和质量控制的需求。结合指标成分的定性定量分析结果，可以综合评价延胡索药材或制剂的质量，保证其质量和药效的稳定、可控。

Claims (5)

1、一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法，其特征在于：

(1)以抗心肌缺血实验筛选得到的延胡索及其制剂中的活性部位为指纹图谱的物质基础，该活性部位以季铵碱类成分为主要组成部分，其中非洲防己碱(columbamine)、13-甲基脱氢紫堇达明碱(13-methyldehydrocorydalmine)、脱氢紫堇鳞茎碱(dehydrocorybulbine)、巴马汀(palmatine)、脱氢延胡索碱(dehydrocorydaline)5种为主要季铵碱类成分。

(2)通过指纹图谱的建立来表征该活性部位中的成分及其相互关系，其指纹图谱的分析方法为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.2％～1％醋酸水溶液(含0.2％三乙胺)，等度洗脱；流速0.8～1.2mL/min；柱温20～40℃；检测波长210～350nm。在上述条件下，分别吸取对照品溶液和延胡索或其制剂的抗心肌缺血活性部位的供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪进行分析，在此条件下，制作延胡索及其制剂中抗心肌缺血活性部位的指纹图谱，该指纹图谱中包含不少于12个色谱峰，色谱中5种主要的季铵碱类成分分别为：3号峰：非洲防己碱，6号峰：13-甲基脱氢紫堇达明碱，7号峰：脱氢紫堇鳞茎碱，10号峰：巴马汀，12号峰：脱氢延胡索碱，其中脱氢延胡索碱是一个重要的活性成分。

(3)选取含量较高的脱氢延胡索碱作为指标成分峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，用指纹图谱软件对所得数据和图谱进行处理，即得到延胡索抗心肌缺血活性部位的对照指纹图谱。

优先考虑确定疗效的药材的指纹图谱。优先考虑含量在平均值附近的样品的指纹图谱。结合指纹图谱和定量分析结果，选取特征峰分离较好，峰的保留时间和峰高适宜、峰形较典型的指纹图谱。优先选取基线平稳、信噪比好的指纹图谱。

(4)通过某一延胡索或其制剂指纹图谱的整体特征，包括色谱峰组成、峰值大小、各峰之间的比例，结合主要季铵碱类成分非洲防己碱、13-甲基脱氢紫堇达明碱、脱氢紫堇鳞茎碱、巴马汀、脱氢延胡索碱等的定量分析与延胡索抗心肌缺血活性部位的对照指纹图谱比较，来鉴别样品的真伪和评价延胡索药材或制剂的质量和疗效。

A.样品真伪的鉴别

9个特征指纹图谱鉴别峰平均相对保留时间为：3号峰：非洲防己碱0.44，4号峰：fumaricine0.48，5号峰：黄连碱(coptisine)0.52，6号峰：13-甲基脱氢紫堇达明碱0.56，7号峰：脱氢紫堇鳞茎碱0.61，9号峰：13-methylpalmatrubine 0.73，10号峰：巴马汀0.77，11号峰：小檗碱(berberine)0.87，12号峰：脱氢延胡索碱1.00。

B.样品质量控制

将样品的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱与延胡索抗心肌缺血活性部位的对照指纹图谱比较，以共有峰计算得到指纹图谱的相似度应不得小于0.9。

2、按照权利要求1所述一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法，其特征在于：所述延胡索及其制剂抗心肌缺血活性部位的供试品溶液为：取延胡索药材或制剂粉末，用50～95％乙醇回流提取1～3次，每次1～4小时，提取液经过大孔吸附树脂，用2～10％氨水洗去杂质，再用30～95％乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，干燥，得到活性部位。取活性部位20mg，用80％甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

3、按照权利要求1所述一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法，其特征在于：所述对照品溶液为：包括至少5种主要季铵碱类成分：非洲防己碱，13-甲基脱氢紫堇达明碱，脱氢紫堇鳞茎碱，巴马汀，脱氢延胡索碱的混合溶液。

4、按照权利要求1所述一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法，其特征在于：所述流动相为乙腈-0.8％醋酸水溶液(含0.2％三乙胺)(24∶76)；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长335nm。

5、按照权利要求1所述一种用指纹图谱控制延胡索及其制剂质量和药效的方法，其特征在于：所述指纹图谱是在测定条件确定后，通过对至少三批样品进行测定，计算相关参数，并在此基础上提出高效液相色谱系统的适用参数条件。即脱氢延胡索碱对照品溶液的色谱峰面积重现性RSD不高于3％，保留时间重现性RSD不高于2％；脱氢延胡索碱和相邻峰的分离度不小于1.5；色谱柱柱效以脱氢延胡索碱峰计不少于3000块理论塔板数。

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