CN104215702B - 丹蒌片指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丹蒌片指纹图谱检测方法，其中色谱条件为：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相，采用梯度洗脱方式，检测波长为280±2nm，250±2nm流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量1-25μl；指纹图谱共有特征指纹峰15个，其峰面积综合占总峰面积的90%以上；5号色谱峰是葛根素的特征峰，葛根素特征峰的相对保留时间和相对保留面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱共有特征峰。本发明方法具有精密度高、稳定、重现性好、加样回收率高、方法简便的特点，能快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂的指纹图谱检测方法，具体涉及丹蒌片的的指纹图谱检测方法。
背景技术
中药指纹图谱是指某种或某几种中药材中所共有的，具有特征性的某类成分的色谱或光谱的图谱。目前，中药指纹图谱质量控制技术作为控制中药质量均一性和稳定性的检测手段，是实现中药现代化的一种关键技术，对有效控制中药制剂的质量具有重要意义。对于成分复杂的中药，过去那种以单一有效成分作为其质量控制指标的做法是不全面的。色谱指纹图谱质量控制模式以色谱分析为手段，从中获取反应中药内在质量的信息，通过对指纹特征的分析比较，评价中药内在质量的真实性、一致性和稳定性，是现阶段综合评价中药质量的最优技术，国家食品药品监督管理局已要求中药制剂实施指纹图谱质量控制。
丹蒌片由瓜蒌皮、薤白、葛根、川芎、丹参、赤芍、泽泻、黄芪、骨碎补、郁金制成，具有痰消瘀化、血脉和畅、痹宜痛止功效，用于治疗冠心病、心绞痛。中国专利文献CN102908583A公开了该组合物的质量控制方法，采用薄层色谱法分别以川芎、芍药苷、丹参酮ⅡA、黄芪甲苷中的一种或多种为对照品在各特定色谱条件下的薄层斑点为对照鉴别，用高效液相色谱法以葛根素为对照品测定葛根含量，上述方法难以全面表征丹蒌片的物理化学特征，因此对丹蒌片的质量控制方法有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹蒌片指纹图谱方法，该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
中国专利文献CN102908583A公开了丹蒌片由下列重量份数的原料制成：
瓜蒌皮30-145重量份、薤白15-65重量份、葛根55-220重量份、川芎20-85重量份、丹参55-220重量份、赤芍20-85重量份、泽泻55-220重量份、黄芪50-180重量份、骨碎补10-40重量份、郁金20-85重量份；
制备方法是：取原料药，川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30,65℃测；葛根和丹参，单包，加乙醇回流提取2-4次，每次0.5-2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30,65℃测；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30,65℃测；将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂等剂型；
或制备方法为取原料药，川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30,65℃测；葛根和丹参，单包，加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30,65℃测；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30,65℃测；将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂等剂型。
本发明提供一种丹蒌片指纹图谱检测方法，其特征在于该方法为：
取丹蒌片，研磨，称取粉末0.2-0.5g，加入50-80%甲醇溶液，超声提取20-50min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
其中色谱条件为：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：
0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为280±2nm，250±2nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量1-25μl；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇或乙醇或乙腈，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443-14.175μg/mL、丹参素浓度为2.85-123.1μg/mL、葛根素浓度为11.625-372μg/mL、大豆苷浓度为3.83-122.5μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93-157.75μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45-78.46μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992-6.375μg/mL的混合对照品溶液，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
测定法：将供试品溶液注入高效液相色谱仪即得;
所述丹蒌片由如下原料份的原料药制成：瓜蒌皮30-145份、薤白15-65份、葛根55-220份、川芎20-85份、丹参55-220份、赤芍20-85份、泽泻55-220份、黄芪50-180份、骨碎补10-40份和郁金20-85份。
所述乙腈、0.1%甲酸水溶液的体积比为55.2-82.8：44.8-17.2。
所述色谱条件为：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为280±2nm，250±2nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量,10μl，理论板数N葛根素（250nm）=5.54（tR/Wh/2）2=85077.9,N葛根素（280nm）=5.54（tR/Wh/2）2=76326.9。
所述指纹图谱共有特征指纹峰有15个，其峰面积综合占总峰面积的90%以上；250nm波长下，5号色谱峰是葛根素的特征峰，葛根素特征峰的相对保留时间和相对保留面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱共有特征峰为：
1号峰：相对保留时间0.323-0.326，相对峰面积0.001-0.007
2号峰：相对保留时间0.399-0.401，相对峰面积0.005-0.009
3号峰：相对保留时间0.416-0.419，相对峰面积0.005-0.010
4号峰：相对保留时间0.701-0.705，相对峰面积0.127-0.186
5号峰：相对保留时间1，相对保留面积1
6号峰：相对保留时间1.089-1.095，相对峰面积0.036-0.044
7号峰：相对保留时间1.131-1.142，相对峰面积0.162-0.204
8号峰：相对保留时间1.183-1.194，相对峰面积0.110-0.136
9号峰：相对保留时间1.423-1.436，相对峰面积0.175-0.236
10号峰：相对保留时间1.631-1.657，相对峰面积0.023-0.048
11号峰：相对保留时间2.455-2.530，相对峰面积0.008-0.124
12号峰：相对保留时间2.500-2.577，相对峰面积0.052-0.112
13号峰：相对保留时间2.579-2.664，相对峰面积0.019-0.048
14号峰：相对保留时间3.225-3.318，相对峰面积0.014-0.023
15号峰：相对保留时间3.372-3.483，相对峰面积0.007-0.018。
优选的25nm下以葛根素的色谱峰（5号色谱峰）的相对保留时间和相对保留面积为1得到的丹蒌片指纹图谱中共有特征峰为：
1号峰：相对保留时间0.323，相对峰面积0.001-0.007
2号峰：相对保留时间0.399，相对峰面积0.005-0.009
3号峰：相对保留时间0.416，相对峰面积0.005-0.010
4号峰：相对保留时间0.701，相对峰面积0.127-0.186
5号峰：相对保留时间1，相对保留面积1
6号峰：相对保留时间1.089，相对峰面积0.036-0.044
7号峰：相对保留时间1.131，相对峰面积0.162-0.204
8号峰：相对保留时间1.183，相对峰面积0.110-0.136
9号峰：相对保留时间1.423，相对峰面积0.175-0.236
10号峰：相对保留时间1.631，相对峰面积0.023-0.048
11号峰：相对保留时间2.455，相对峰面积0.008-0.124
12号峰：相对保留时间2.500，相对峰面积0.052-0.112
13号峰：相对保留时间2.579，相对峰面积0.019-0.048
14号峰：相对保留时间3.225，相对峰面积0.014-0.023
15号峰：相对保留时间3.372，相对峰面积0.007-0.018。
所述指纹图谱共有特征指纹峰有15个，其峰面积综合占总峰面积的90%以上；5号色谱峰是葛根素的特征峰，葛根素特征峰的相对保留时间和相对保留面积为1，计算280nm下其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱共有特征峰为：
1号峰：相对保留时间0.323-0.326，相对峰面积0.033-0.208
2号峰：相对保留时间0.399-0.401，相对峰面积0.084-0.160
3号峰：相对保留时间0.416-0.419，相对峰面积0.060-0.170
4号峰：相对保留时间0.701-0.705，相对峰面积0.165-0.259
5号峰：相对保留时间1，相对峰面积1
6号峰：相对保留时间1.089-1.095，相对峰面积0.039-0.052
7号峰：相对保留时间1.131-1.142，相对峰面积0.230-0.290
8号峰：相对保留时间1.183-1.194，相对峰面积0.112-0.130
9号峰：相对保留时间1.423-1.436，相对峰面积0.205-0.273
10号峰：相对保留时间1.631-1.657，相对峰面积0.037-0.089
11号峰：相对保留时间2.455-2.530，相对峰面积0.023-0.343
12号峰：相对保留时间2.500-2.577，相对峰面积0.059-0.129
13号峰：相对保留时间2.579-2.664，相对峰面积0.065-0.253
14号峰：相对保留时间3.225-3.318，相对峰面积0.025-0.047
15号峰：相对保留时间3.372-3.483，相对峰面积0.017-0.043。
所述指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.90.
所述供试品溶液制备方法中50-80%甲醇溶液由0.5-5mol/L的磷酸甲醇溶液或0.5-5mol/L的盐酸乙腈溶液或0.5-5mol/L的磷酸乙腈溶液中的任意一种替换；超声提取20-50min由加热回流5-60分钟或回流提取1-12小时或微波萃取0.1-4小时的任意一种替换。
所述供试品溶液制备方法中50-80%甲醇溶液由0.5-5mol/L的磷酸甲醇溶液或0.5-5mol/L的盐酸乙腈溶液或0.5-5mol/L的磷酸乙腈溶液中的任意一种替换；超声提取20-50min由加热回流5-60分钟或回流提取1-12小时或微波萃取0.1-4小时的任意一种替换。
所述供试品溶液制备方法中50-80%甲醇溶液由0.5-5mol/L的磷酸甲醇溶液或0.5-5mol/L的盐酸乙腈溶液或0.5-5mol/L的磷酸乙腈溶液中的任意一种替换；超声提取20-50min由加热回流5-60分钟或回流提取1-12小时或微波萃取0.1-4小时的任意一种替换。
本发明所述的丹蒌片原料药组成优选为：
瓜蒌皮86重量份、薤白40重量份、葛根138重量份、川芎52重量份、丹参138重量份、赤芍52重量份、泽泻138重量份、黄芪114重量份、骨碎补26重量份、郁金52重量份；或
瓜蒌皮137重量份、薤白20重量份、葛根216重量份、川芎22重量份、丹参216重量份、赤芍22重量份、泽泻216重量份、黄芪60重量份、骨碎补39重量份、郁金22重量份；或
瓜蒌皮35重量份、薤白60重量份、葛根60重量份、川芎82重量份、丹参60重量份、赤芍82重量份、泽泻60重量份、黄芪168重量份、骨碎补13重量份、郁金82重量份；或
瓜蒌皮117重量份、薤白28重量份、葛根186重量份、川芎32重量份、丹参186重量份、赤芍32重量份、泽泻186重量份、黄芪80重量份、骨碎补34重量份、郁金32重量份；或
瓜蒌皮55重量份、薤白52重量份、葛根90重量份、川芎72重量份、丹参90重量份、赤芍72重量份、泽泻90重量份、黄芪148重量份、骨碎补18重量份、郁金72重量份；或
瓜蒌皮97重量份、薤白35重量份、葛根156重量份、川芎42重量份、丹参156重量份、赤芍42重量份、泽泻156重量份、黄芪100重量份、骨碎补30重量份、郁金42重量份；或
瓜蒌皮75重量份、薤白45重量份、葛根120重量份、川芎62重量份、丹参120重量份、赤芍62重量份、泽泻120重量份、黄芪128重量份、骨碎补22重量份、郁金62重量份。
所述供试品是按照上述中国专利文献CN102908583A公开的制备方法制成。
本发明具有下述优点：
本发明方法具有精密度高、稳定、重现性好、方法简便的特点，能快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
实验例1对照品指纹图谱的建立方法
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，METTLER TOLEDO百万分之一微量电子天平。
1.2试药
甲醇；乙腈（天津市康科德科技有限公司色谱纯）；甲酸（色谱纯，TEDIA）；Millipore超纯水；丹蒌片为吉林康乃尔药业有限公司生产。
2方法与结果
2.1色谱条件
以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43min A相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
2.2特征指纹图谱的测定
对照品的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间。
实验例2丹蒌片的标准指纹图谱的建立方法
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，METTLER TOLEDO百万分之一微量电子天平。
1.2试药
甲醇；乙腈（天津市康科德科技有限公司色谱纯）；甲酸（色谱纯，TEDIA）；Millipore超纯水；丹蒌片为吉林康乃尔药业有限公司生产（按CN102908583A实施例1）。
2方法与结果
2.1色谱条件
以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43min A相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm和280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
2.2指纹图谱的测定
2.2.1丹蒌片指纹图谱制备
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.2g，加入50%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取20min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片250nm和280nm下的标准指纹图谱（图1和图2）。
2.2.2共有峰的确定
通过12批丹蒌片指纹图谱测定，比较其色谱图，确定共有峰有15个，其中以5号指纹峰（葛根素的特征峰）为参照物，其峰面积超过总峰面积的10%，列举12批样品共有峰的相对保留时间以及250nm、280nm波长下的相对峰面积统计结果见表1、表2、表3。
表112批丹篓片共有峰的相对保留时间统计结果
表2250nm波长下12批丹篓片共有峰的相对峰面积统计结果
表3280nm波长下12批丹篓片共有峰的相对峰面积统计结果
附图说明
图1是丹蒌片250nm波长下色谱图；
图2是丹蒌片280nm波长下色谱图；
图1、图2中1-5-羟甲基糠醛、2-丹参素、3-葛根素、4-大豆苷、5-丹酚酸B、6-丹酚酸A、7-丹参酮ⅡA。
具体实施方式
实施例1
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.2g，加入50%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取20min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例2
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.25g，加入70%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取30min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-25min，A相：10-20%、B相：90-80%，25-43min，A相：20-40%、B相：80-60%，43-53min，A相：40-100%、B相：60-0%；检测波长为250nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例3
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.5g，加入80%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取50min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例4
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.2g，加入50%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取20min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例5
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.25g，加入70%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取30min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-25min，A相：10-20%、B相：90-80%，25-43min，A相：20-40%、B相：80-60%，43-53min，A相：40-100%、B相：60-0%；检测波长为280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例6
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.5g，加入80%甲醇溶液配成10mg/ml溶液，超声提取50min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例7
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.5g，加入2.5mol/L磷酸甲醇溶液配成10mg/ml溶液，加热回流提取30min，放至室温，用磷酸甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm或280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例8
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.5g，加入2.5mol/L盐酸乙腈溶液配成10mg/ml溶液，回流提取6h，放至室温，用盐酸乙腈补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm或280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
实施例9
1、丹蒌片的制备：
瓜蒌皮86g、薤白40g、葛根138g、川芎52g、丹参138g、赤芍52g、泽泻138g、黄芪114g、骨碎补26g、郁金52g；川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70%乙醇加热回流提取二次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；葛根和丹参（单包），加乙醇回流提取三次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30（65℃）。将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，制粒，压制成1000片，包薄膜衣或糖衣，即得。
2、丹蒌片指纹图谱检测
供试品溶液的制备：取丹蒌片，研磨，称取粉末0.5g，加入2.5mol/L磷酸乙腈溶液配成10mg/ml溶液，回流提取6h，放至室温，用磷酸乙腈补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
对照品标准液的制备：取5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称重，加甲醇，制得5-羟甲基糠醛浓度为0.443、丹参素浓度为2.85μg/mL、葛根素浓度为11.625μg/mL、大豆苷浓度为3.83μg/mL、丹酚酸B浓度为4.93μg/mL、丹酚酸A浓度为2.45μg/mL、丹参酮ⅡA浓度为0.1992μg/mL的混合对照品溶液，照中国药典2005版或2010版一部附录高效液相色谱法试验，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1%甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A相：14-20%、B相：86-80%，25-28min，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A相：21-22%、B相：79-78%，33-43minA相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0%；检测波长为250nm或280nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量10μl，理论板数按葛根素峰计，应不低于85077.9。
将供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪，与5号峰（葛根素的特征峰）的相对保留时间和相对峰面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱。
精密度试验
取20110901批次供试品溶液注入液相色谱仪，连续6次进针，以峰面积计算，5-羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮ⅡA的精密度RSD均符合要求，结果见表4-表9。
表4250nm日内精密度试验结果(n=6)
表5280nm日内精密度试验结果(n=6)
表6250nm日间精密度（24h后）试验结果(n=6)
表7280nm日间精密度（24h后）试验结果(n=6)
表8250nm日间精密度（48h后）试验结果(n=6)
表9280nm日间精密度（48h后）试验结果(n=6)
溶液稳定性考察
取20110901批次供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、10、14、24、48h进样10μL测定，考察供试品溶液的稳定性,结果表明供试品溶液室温放置48h基本稳定，见表10和11。
表10250nm稳定性试验结果
表11280nm稳定性试验结果
重复性试验
取20110901批次样品片剂，按供试品制备方法平行处理6份样品，分别注入液相色谱仪进行测定，结果见表12和13。
表12250nm重复性试验结果(n=6)
表13280nm重复性试验结果(n=6)
数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统
配制12批丹篓片供试品溶液进样10ul注入液相色谱仪后将250nm波长下色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，分析结果如表14所示。
表14分析结果
配制12批丹篓片供试品溶液进样10ul注入液相色谱仪后将280nm波长下色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，分析结果如表15所示。
表15分析结果
虽然本发明已经通过上述具体实施例对其进行了详细阐述，但是，本专业普通技术人员应该明白，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变化，均属于本发明所要保护的范围。
Claims (7)
1.一种丹蒌片指纹图谱检测方法，其特征在于该方法为：
取丹蒌片，研磨，称取粉末0.2-0.5g，加入50-80% 甲醇溶液，超声提取20-50min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液；
其中色谱条件为：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为A相，0.1% 甲酸水溶液为B相组成流动相；采用梯度洗脱方式，其洗脱时间与流动相比例为：0-4min，A相：4-10%、B相：96-90%，4-23min，A相：10-14%、B相：90-86%，23-25min，A 相：14-20%、B相：86-80%，25-28min ，A相：20-21%、B相：80-79%，28-33min，A 相：21-22%、B相：79-78%，33-43min，A相：22-40%、B相：78-60%，43-48min，A 相：40-90%、B相：60-10%，48-53min，A相：90-100%、B相：10-0% ；检测波长为280±2nm，250±2nm，流速0.5-1.5mL/min，柱温20-50℃，进样量1-25μl ；
对照品标准液的制备：取5- 羟甲基糠醛、丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参酮Ⅱ A 对照品适量，精密称重，加甲醇或乙醇或乙腈，制得5- 羟甲基糠醛浓度为0.443-14.175μg/mL、丹参素浓度为3.85-123.1μg/mL、葛根素浓度为11.625-372μg/mL、大豆苷浓度为3.83-122.5μg/mL、丹酚酸B 浓度为4.93-157.75μg/mL、丹酚酸A 浓度为2.45-78.46μg/mL、丹参酮Ⅱ A 浓度为0.1992-6.375μg/mL 的混合对照品溶液，与供试品溶液相同色谱条件进行测定，得到各自特征峰的保留时间；
测定法：将供试品溶液注入高效液相色谱仪即得;
所述丹蒌片由如下原料份的原料药制成：瓜蒌皮30-145 份、薤白15-65 份、葛根55-220 份、川芎20-85 份、丹参55-220 份、赤芍20-85 份、泽泻55-220 份、黄芪50-180 份、骨碎补10-40 份和郁金20-85 份。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述进样量,10μl，N 葛根素（250nm）=5.54（tR/Wh/2）2=85077.9,N 葛根素（280nm）=5.54（tR/Wh/2）2=76326.9。
3.根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，指纹图谱共有特征指纹峰有15 个，其峰面积综合占总峰面积的90% 以上；5 号色谱峰是葛根素的特征峰，葛根素特征峰的相对保留时间和相对保留面积为1，计算250nm 下其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱共有特征峰为：
1 号峰：相对保留时间0.323-0.326，相对峰面积0.001-0.007
2 号峰：相对保留时间0.399-0.401，相对峰面积0.005-0.009
3 号峰：相对保留时间0.416-0.419，相对峰面积0.005-0.010
4 号峰：相对保留时间0.701-0.705，相对峰面积0.127-0.186
5 号峰：相对保留时间1，相对峰面积1
6 号峰：相对保留时间1.089-1.095，相对峰面积0.036-0.044
7 号峰：相对保留时间1.131-1.142，相对峰面积0.162-0.204
8 号峰：相对保留时间1.183-1.194，相对峰面积0.110-0.136
9 号峰：相对保留时间1.423-1.436，相对峰面积0.175-0.236
10 号峰：相对保留时间1.631-1.657，相对峰面积0.023-0.048
11 号峰：相对保留时间2.455-2.530，相对峰面积0.008-0.124
12 号峰：相对保留时间2.500-2.577，相对峰面积0.052-0.112
13 号峰：相对保留时间2.579-2.664，相对峰面积0.019-0.048
14 号峰：相对保留时间3.225-3.318，相对峰面积0.014-0.023
15 号峰：相对保留时间3.372-3.483，相对峰面积0.007-0.018。
4.根据权利要求3 所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，丹蒌片指纹图谱中共有特征峰为：
1 号峰：相对保留时间0.323，相对峰面积0.001-0.007
2 号峰：相对保留时间0.399，相对峰面积0.005-0.009
3 号峰：相对保留时间0.416，相对峰面积0.005-0.010
4 号峰：相对保留时间0.701，相对峰面积0.127-0.186
5 号峰：相对保留时间1，相对峰面积1
6 号峰：相对保留时间1.089，相对峰面积0.036-0.044
7 号峰：相对保留时间1.131，相对峰面积0.162-0.204
8 号峰：相对保留时间1.183，相对峰面积0.110-0.136
9 号峰：相对保留时间1.423，相对峰面积0.175-0.236
10 号峰：相对保留时间1.631，相对峰面积0.023-0.048
11 号峰：相对保留时间2.455，相对峰面积0.008-0.124
12 号峰：相对保留时间2.500，相对峰面积0.052-0.112
13 号峰：相对保留时间2.579，相对峰面积0.019-0.048
14 号峰：相对保留时间3.225，相对峰面积0.014-0.023
15 号峰：相对保留时间3.372，相对峰面积0.007-0.018。
5.根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，指纹图谱共有特征指纹峰有15 个，其峰面积综合占总峰面积的90% 以上；5 号色谱峰是葛根素的特征峰，葛根素特征峰的相对保留时间和相对保留面积为1，计算280nm 下其他峰的相对保留时间和相对峰面积，即得到丹蒌片的标准指纹图谱共有特征峰为：
1 号峰：相对保留时间0.323-0.326，相对峰面积0.033-0.208
2 号峰：相对保留时间0.399-0.401，相对峰面积0.084-0.160
3 号峰：相对保留时间0.416-0.419，相对峰面积0.060-0.170
4 号峰：相对保留时间0.701-0.705，相对峰面积0.165-0.259
5 号峰：相对保留时间1，相对峰面积1
6 号峰：相对保留时间1.089-1.095，相对峰面积0.039-0.052
7 号峰：相对保留时间1.131-1.142，相对峰面积0.230-0.290
8 号峰：相对保留时间1.183-1.194，相对峰面积0.112-0.130
9 号峰：相对保留时间1.423-1.436，相对峰面积0.205-0.273
10 号峰：相对保留时间1.631-1.657，相对峰面积0.037-0.089
11 号峰：相对保留时间2.455-2.530，相对峰面积0.023-0.343
12 号峰：相对保留时间2.500-2.577，相对峰面积0.059-0.129
13 号峰：相对保留时间2.579-2.664，相对峰面积0.065-0.253
14 号峰：相对保留时间3.225-3.318，相对峰面积0.025-0.047
15 号峰：相对保留时间3.372-3.483，相对峰面积0.017-0.043。
6.根据权利要求1或5 任一所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版》进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.90。
7. 根据权利要求1-4 中任一所述的指纹图谱检测方法，所述供试品溶液制备方法中50-80% 甲醇溶液由0.5-5mol/L 的磷酸甲醇溶液或0.5-5mol/L 的盐酸乙腈溶液或0.5-5mol/L 的磷酸乙腈溶液中的任意一种替换；超声提取20-50min 由加热回流5-60 分钟或回流提取1-12 小时或微波萃取0.1-4 小时的任意一种替换。
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