CN113588824A - 一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，步骤：包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取适量川芎，提取纯化其中的多糖类化合物，将得到的川芎多糖类化合物用超纯水定容，用微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；(2)混合对照品溶液制备：精密称取葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖5种对照品，加入超纯水配置成混合对照品溶液；(3)测定：分别精密量取步骤(1)制备得到的供试品溶液和步骤(2)制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，流动相为乙腈‑水溶液，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得川芎的指纹图谱。

Description

一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

中药现行的定量评价方法利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，而大多数品种仅有一般的检查项目。中药因其组分复杂，化学成分具有多样性和复杂性，一直是质量评价的重点与难点。

在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。近年来，由于色谱技术的迅速发展和检测能力的大大提高，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证，中药指纹图谱对促进中药材的现代化发展和提高中药材及中药制剂的质量具有重要意义。

川芎是伞形科藁本属植物，是伞形科藁本属多年草本植物的干燥根茎，其性温，味辛，归肝、心、胆经。具有祛风止痛，活血行气的功效。临床上主要用于治疗心血管、妇科等疾病。川芎道地产区主要集中在四川都江堰地区，目前是以四川都江堰、彭州、崇州、什邡、新都等地为中心形成了主产区，为著名的川产道地药材。

川芎的活性成分主要包括挥发油类、酚酸类和生物碱类，目前确定化学结构的有11个化合物，川芎嗪类包括四甲基吡嗪、3-异丙基-6仲丁基-2,5-哌嗪二酮、胆碱、三甲胺、腺嘌呤和腺苷等；内酯类化合物包括洋川芎内酯、藁本内酯、丹酸内酯、蛇床内酯、新蛇床内酯、川芎内酯等；酚酸类化合物包括阿魏酸、香兰素、丹酸、咖啡酸、棕榈酸、亚油酸和大黄酚等化合物；川芎中其他成分还包括多糖类化合物和少量的有机酸酯及一些挥发性不饱和烃类化合物。

现有技术一种川芎指纹图谱的测定方法中公开的川芎指纹图谱的测定方法选取了盐酸川芎嗪、阿魏酸、洋川芎内酯、藁本内酯、蛇床子素和欧当归内酯作为对照品，建立川芎指纹图谱，但是藁本内酯不稳定，含量变化较大，不能客观反应药材质量，且蛇床子素和欧当归内酯在川芎中的含量较低，用于评定川芎的质量意义不大；现有技术川芎药材的检测方法、鉴定方法公开了的川芎药材的检测方法、鉴定方法使用荧光分光光度法进行检测，鉴定方法为使用藁本内酯为对照品，采用荧光分光光度法测定川芎药材中总荧光物质的含量，该成分含量高低对区分是否出自道地产区有一定意义，但是藁本内酯不稳定，含量变化较大，不能客观反应药材质量；现有技术一种利用HPLC-UV鉴别川芎药材贮存年限的方法中公开的鉴别川芎药材贮存年限的方法可以根据HPLC-UV图谱中的特征峰峰形差异来分辨川芎药材的贮存年限，但是对不同产地的川芎药材能否鉴别开来没有提及。

发明内容

现有技术中川芎产地的鉴别方法通常使用阿魏酸、川芎内酯、藁本内酯、川芎嗪等作为对照品进行指纹图谱的鉴定，但是藁本内酯不稳定，含量变化较大，不能客观反应药材质量，生物碱含量较低，使用川芎嗪作为对照品评价川芎的意义不是很大。

已知川芎中含有多种多糖类化合物，如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖醛酸、以及鼠李糖等，本发明通过前期研究发现，不同产地的川芎中所含具体多糖类化合物的含量有较为明显的差别，以四川都江堰产的川芎和江西产的川芎为例，产地为四川都江堰的川芎中的多糖类化合物主要以葡萄糖、半乳糖为主，江西产的川芎中多糖类化合物主要以葡萄糖、阿拉伯糖为主，且江西产的川芎中阿拉伯糖和半乳糖的比例为3～5:1。现有技术中未见有针对川芎中多糖进行指纹图谱鉴定的研究报道。

基于此，本发明提供一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，该鉴别方法能够将不同产地的川芎进行鉴别，特别是将四川都江堰产地和江西产地的川芎进行鉴别，并且可以采用此方法将四川产地的道地川芎与其他产地的川芎进行鉴别。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，提供一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取适量川芎，提取纯化其中的多糖类化合物，将得到的川芎多糖类化合物用超纯水定容，用微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；

(2)混合对照品溶液制备：精密称取葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖5种对照品，加入超纯水配置成混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取步骤(1)制备得到的供试品溶液和步骤(2)制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得川芎的指纹图谱。

在本发明的第二方面，提供一种第一方面所述川芎道地药材指纹图谱鉴别方法和/或所述川芎道地药材指纹图谱鉴别方法得到的指纹图谱在川芎产地分析和质量控制中的应用。

在本发明的第三方面，提供一种川芎产地分析和质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取多个批次的川芎按第一方面所述方法得到川芎样品的指纹图谱，将该多个批次川芎样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

(2)将待测样品指纹图谱与川芎对照指纹图谱进行相似性比较，以分析待测川芎的产地分析和质量，计算方法为相关系数法。

本发明的具体实施方式具有以下有益效果：

本发明基于前期的研究发现，以四川都江堰产的川芎和江西产的川芎为例，产地为四川都江堰的川芎中的多糖类化合物主要以葡萄糖、半乳糖为主，江西产的川芎中多糖类化合物主要以葡萄糖、阿拉伯糖为主，可见不同产地川芎的多糖类化合物种类和数量不同，基于此提出以多糖类化合物为对照品的指纹图谱鉴定方法，现有技术中之前未见有针对川芎中多糖进行指纹图谱鉴定的研究报道。

克服了现有技术中川芎产地的鉴别方法通常使用阿魏酸、川芎内酯、藁本内酯、川芎嗪等作为对照品进行指纹图谱的鉴定时，藁本内酯不稳定，含量变化较大，不能客观反应药材质量带来的问题，以及生物碱含量较低，使用川芎嗪作为对照品评价川芎质量意义不大的问题。

本发明中以葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖5种多糖类化合物为对照品，覆盖面广，代表性强，所构建的指纹图谱能够更加全面反应川芎的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，能够用于该类制剂的质量控制；

本发明具体实施方式中对多糖类化合物的提取纯化方法能够使得其中的有效成分更好得溶出，使得检测结果更加精确。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中10批次川芎的指纹图谱；

图2为本发明实施例1中川芎的指纹图谱；

图3为本发明实施例1中混合对照品的指纹图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如上文中记载的，现有技术中之前未见有针对川芎中多糖化合物进行指纹图谱鉴定的研究报道，鉴于此，本发明提供一种以多糖化合物为对照品的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法。

本发明的一种实施方式中，提供了一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取适量川芎，提取纯化其中的多糖类化合物，将得到的川芎多糖类化合物用超纯水定容，用微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；

(2)混合对照品溶液制备：精密称取葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖5种对照品，加入超纯水配置成混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取步骤(1)制备得到的供试品溶液和步骤(2)制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得川芎的指纹图谱。

本发明基于前期的研究发现，以四川都江堰产的川芎和江西产的川芎为例，产地为四川都江堰的川芎中的多糖类化合物主要以葡萄糖、半乳糖为主，江西产的川芎中多糖类化合物主要以葡萄糖、阿拉伯糖为主，可见不同产地川芎的多糖类化合物种类和数量不同，基于此提出以多糖类化合物为对照品的指纹图谱鉴定方法，现有技术中之前未见有针对川芎中多糖进行指纹图谱鉴定的研究报道。

本发明的鉴定方法克服了现有技术中川芎产地的鉴别方法通常使用阿魏酸、川芎内酯、藁本内酯、川芎嗪等作为对照品进行指纹图谱的鉴定时，藁本内酯不稳定，含量变化较大，不能客观反应药材质量带来的问题，以及生物碱含量较低，使用川芎嗪作为对照品评价川芎质量意义不大的问题。

在本发明的实施方式中，检测对象为川芎中的多糖类化合物，因此需要先将川芎中的多糖化合物进行提取和纯化，在本发明的实施方式中，所述提取纯化方法为：

取川芎适量，研成细粉，取细粉精密称定，加入石油醚回流去除脂质；将滤渣干燥后加入超纯水使用水蒸气进行蒸馏，将滤液凝缩后加入氯仿和正丁醇的混合溶液去除其中的蛋白质，浓缩后加入无水乙醇进行醇沉，洗涤后得到川芎多糖；

将得到的川芎多糖转移至容量瓶中，用超纯水定容至刻度，用微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；

进一步优选的，石油醚回流的条件为：70-90℃回流2-3h，回流次数为2-3次；

进一步优选的，水蒸气蒸馏的条件为：蒸馏3-4次，每次4-5小时；

优选的，加入氯仿和正丁醇的混合溶液去除蛋白质的操作进行多次，直到无蛋白质为止；氯仿和正丁醇的混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比为4-6:1；

本发明实施方式中川芎多糖化合物的提取和纯化方法可以最大程度地将川芎中的多糖化合物提取出来，并且可以将川芎中的脂质和蛋白质类化合物去除，减少脂质和蛋白类化合物对后续检测的干扰，使得后续的高效液相色谱分析能够出峰更加明显，使检测结果更加精确。

在本发明的实施方式中，高效液相色谱检测采用的检测器为：蒸发光散射检测器(ELSD)；

在本发明的实施方式中，高效液相色谱检测采用的色谱柱为：TSKgel ODS-140HTP(2.1mmIDX10 cm,2.3μm)；

在本发明的实施方式中，流动相：A：乙腈，B水；

在本发明的实施方式中，梯度洗脱条件为：0～15min，10％～48％A；15～30min，48～80％A；30～45min，80～10％A；45～60min，10～5％A；

在本发明的实施方式中，流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量10μl。

本发明的一种实施方式中，提供了一种上述川芎道地药材指纹图谱鉴别方法和/或所述川芎道地药材指纹图谱鉴别方法得到的指纹图谱在川芎产地分析和质量控制中的应用。

本发明的一种实施方式中，提供了一种川芎产地分析和质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取多个批次的川芎按第一方面所述方法得到川芎样品的指纹图谱，将该多个批次川芎样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

(2)将待测样品指纹图谱与川芎对照指纹图谱进行相似性比较，以分析待测川芎的产地分析和质量，计算方法为相关系数法。

下面结合实施例对本发明做进一步的解释和说明。

实施例1

(1)对照品溶液的制备：称取葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖各适量，精密称定，加超纯水制成每1ml含320μg阿魏酸的溶液，作为对照品溶液；

(2)供试品溶液制备：按照批次，将四川都江堰产地的川芎研成40目的细粉，取100g细粉精密称定，加入石油醚90℃下回流2.5h去除脂质，回流3次；过滤将滤渣干燥后加入超纯水使用水蒸气进行蒸馏，蒸馏3次，每次5小时，将滤液凝缩后加入体积比为4:1的氯仿和正丁醇的混合溶液去除其中的蛋白质，去除蛋白质的操作进行多次，直到无蛋白质为止，浓缩后加入无水乙醇进行醇沉，洗涤后得到川芎多糖；将得到的川芎多糖转移至容量瓶中，用超纯水定容至刻度，用微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；

(3)高效液相色谱法测定川芎的指纹图谱

将按步骤(1)和(2)方法制备得到的川芎药材供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件为：以TSKgel ODS-140HTP(2.1mmIDX10 cm,2.3μm)为色谱柱；以乙腈-水溶液为流动相，按下表1进行梯度洗脱，流动相流速1.0ml/min，柱温为30℃；进样量10μl；

表1

时间(min)	乙腈(％)	水(％)
			0	10	90
15	48	52
			30	80	20
45	10	90
			60	5	95

用指纹图谱软件对10批四川都江堰产地的川芎的图谱进行分析处理，即得各批次四川都江堰产地的川芎的指纹图谱，图谱共有8个共有特征峰，见图1。

混合对照品的指纹图谱如图1所示，通过与混合对照品色谱图比较，确认3号峰为葡萄糖，4号峰为半乳糖，6号峰为阿拉伯糖，7号峰为甘露糖，8号峰为鼠李糖。将所测的10批次四川都江堰产地的川芎图谱导入“中药色谱指纹相似度评价系统”软件分析，进行色谱峰匹配。以附图2作为参照图谱，生成的指纹图谱为图3。

实施例2

(1)系统适用性试验及阴性干扰试验

在上述色谱条件下，分别精密量取供试品溶液及空白溶剂各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果表明，空白溶剂HPLC色谱图在与阿魏酸对照品相同保留时间位置上未出峰，在其他共有峰位置上也未出峰，空白溶剂对测定无干扰。

(2)精密度试验

取对照品溶液，实施例1步骤(3)色谱条件重复进样6次，各色谱峰保留时间、峰面积RSD均小于5％；结果表明，精密度良好。

(3)稳定性试验

按上述实施例1的步骤(2)制备供试品溶液，供试品溶液制备完成后，精密吸取10ul，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，以后每隔2小时测定一次，考察24小时，计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积相对标准偏差，RSD均小于3％，结果表明，供试品中各共有组分在24小时内溶液稳定性良好。

(4)重复性试验

取川芎，按上述实施例1的步骤(2)制备供试品溶液，重复测定6次，计算样品中各组分的含量，结果表明各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取适量川芎，提取纯化其中的多糖类化合物，将得到的川芎多糖类化合物用超纯水定容，用微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；

(2)混合对照品溶液制备：精密称取葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖5种对照品，加入超纯水配置成混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取步骤(1)制备得到的供试品溶液和步骤(2)制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，流动相为乙腈-水溶液，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得川芎的指纹图谱。

2.如权利要求1所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，提取纯化方法为：

取川芎适量，研成细粉，取细粉精密称定，加入石油醚回流去除脂质；将滤渣干燥后加入超纯水使用水蒸气进行蒸馏，将滤液凝缩后加入氯仿和正丁醇的混合溶液去除其中的蛋白质，浓缩后加入无水乙醇进行醇沉，洗涤后得到川芎多糖。

3.如权利要求2所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，石油醚回流的条件为：70-90℃回流2-3h，回流次数为2-3次。

4.如权利要求2所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，水蒸气蒸馏的条件为：蒸馏3-4次，每次4-5小时。

5.如权利要求2所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，加入氯仿和正丁醇的混合溶液去除蛋白质的操作进行多次，直到无蛋白质为止；氯仿和正丁醇的混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比为4-6:1。

6.如权利要求1所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，高效液相色谱检测采用的色谱柱为：TSKgel ODS-140HTP(2.1mmIDX10 cm,2.3μm)。

7.如权利要求1所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，流动相：A：乙腈，B水；梯度洗脱条件为：0～15min，10％～48％A；15～30min，48～80％A；30～45min，80～10％A；45～60min，10～5％A。

8.如权利要求1所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法，其特征在于，流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；进样量10μl。

9.权利要求1所述的川芎道地药材指纹图谱鉴别方法和/或所述川芎道地药材指纹图谱鉴别方法得到的指纹图谱在川芎产地分析和质量控制中的应用。

10.一种川芎产地分析和质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取多个批次的川芎按权利要求1所述方法得到川芎样品的指纹图谱，将该多个批次川芎样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

(2)将待测样品指纹图谱与川芎对照指纹图谱进行相似性比较，以分析待测川芎的产地分析和质量，计算方法为相关系数法。

Images