CN112710765A - 一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，包括：a)对照品溶液制备；b)供试品溶液制备；c)高效液相色谱测定；d)取26批栀子药材分别制备供试品溶液，依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，选择不同批次栀子的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱，计算各共有色谱峰的相对保留时间、峰面积；e) 采用正交偏最小二乘判别分析；f) 采用液相色谱‑串联质谱仪鉴定共有色谱峰。本发明方法专属性强、峰识别数目多，指纹图谱结合正交偏最小二乘判别分析可用于不同产地栀子的鉴别及质量标志物的筛选，采用液质联用技术，对共有色谱峰进行定性分析，明确不同产地栀子药材的质量差异物质。
Description
技术领域
本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，具体涉及一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用。
背景技术
栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，其性苦，寒，具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒等功效。临床上常用于热病心烦，湿热黄疸，淋证涩痛等症的治疗。现代药理学研究，栀子具有利胆、降血压、抗菌、抗炎等等作用。
栀子作为常用的大宗药材之一，分布区域广泛，主产于江西、湖南等地。不同产地的生长环境、气候条件等因素使得药材中的各类成分差异较大。而目前对于栀子药材的质量控制多集中于单一成分的含量测定，《中国药典》2015版中以栀子苷的含量作为考察指标，无法完整反应药材的内在品质以及不同产地栀子的质量差异，因此建立一种简单有效的评价方法尤为重要。
目前已有研究显示栀子中含有环烯醚萜类、有机酸类、西红花苷类等化合物，明确栀子药材中的化学成分组成有助于其物质基础研究。传统的分离纯化方法耗时长、成本高，近年来液质联用技术(LC-ESI-MS/MS)由于其强大的定性分析能力在中药领域得到了广泛应用，通过电喷雾软电离质谱技术(ESI)可以获得分子离子峰，二级碰撞可以获得丰富的碎片离子，从而推断出化合物的结构，对于药材中的色谱峰识别更准确。
发明内容
有鉴于此，本发明期望提供一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，采用高效液相色谱法建立栀子指纹图谱，方法可靠、准确，结合正交偏最小二乘判别分析能特征性地区别不同产地的栀子药材，并筛选出质量标志物。采用液质联用技术，对共有色谱峰进行定性分析，明确不同产地栀子药材的质量差异物质。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，包括以下步骤：
a)对照品溶液制备：取适量栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷精密称定，加50％～100％甲醇或乙腈制成栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷的混合对照品溶液；
b)供试品溶液制备：取栀子药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或者乙醇，浓度为50％～100％，料液比为1：25～1：100，称定重量，回流或超声处理10-50min，放冷，再称定重量，用50％～100％甲醇或50％～100％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得；
c)高效液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录指纹图谱；所述色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为纯甲醇或纯乙腈，流动相B为含添加剂为0.05％-0.5％甲酸、0.05％-0.5％乙酸或0.05％-0.5％磷酸的水相，流速为0.5mL/min-1.5mL/min，所述进样量为5-50μL，所述检测波长为200-500nm；
d)指纹图谱的建立：取26批栀子药材分别按步骤b)制备供试品溶液，按步骤c)依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，选择不同批次栀子的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱，计算各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积；
e)共有色谱峰结构的鉴定：采用液相色谱-串联质谱仪鉴定共有色谱峰，液相色谱方法与步骤c)一致，质谱所用的电离模式为电喷雾负离子电离，所述气帘气：25-45psi；温度：300-400℃；干燥气流速：8-12L/min；离子化压力：3500-4500V；毛细管电压：60-80V；裂解电压：15-30eV；
f)鉴别分析：以步骤d)指纹图谱中共有色谱峰峰面积为数据，用SIMICA 14.1(维护信息收集和分析的软件界面14.1版本)进行正交偏最小二乘判别分析，结合变量重要性投影(VIP)法，确定质量标志物，以此区别江西与福建和湖南的栀子药材。
进一步地，所述步骤a)中，取适量栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷精密称定，加50％甲醇制成每1mL含栀子苷80～200μg、西红花苷I 80～200μg、西红花苷II 80～200μg、京尼平龙胆双糖苷80～200μg的混合对照品溶液。
进一步地，所述步骤b)中，取栀子药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，加入浓度为50-100％的甲醇，料液比为1：25～1：100，称定重量，超声处理20-40min，放冷，再称定重量，用50-100％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
进一步地，所述步骤c)中，色谱柱长度为100-250mm，直径为2.1-4.6mm，粒径为1.7-5μm，流动相A为纯乙腈，流动相B为含添加剂浓度0.1～0.5％甲酸的水相，采用梯度洗脱，0～55min,5～40％A；55～60min,40～90％A；60～65min,90％A。
进一步地，确定10个共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱。
本发明有益效果如下：本发明方法专属性强、峰识别数目多，得到的栀子指纹图谱能够全面、特征性地反应栀子药材的组成成分，指纹图谱结合正交偏最小二乘判别分析可用于不同产地栀子的鉴别及质量标志物的筛选，采用液质联用技术，对共有色谱峰进行定性分析，明确不同产地栀子药材的质量差异物质。
附图说明
图1为本发明实施例中26批栀子药材的HPLC指纹图谱；
图2为本发明实施例中栀子标准对照指纹图谱；
图3为本发明实施例栀子药材的正交偏最小二乘判别分析得分图。
图4为本发明实施例栀子药材的变量载荷评价参数(VIP)值；
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。
本发明一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，包括以下步骤：
步骤1：对照品溶液制备，取适量栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷，精密称定，加50％甲醇或乙腈制成每1mL含栀子苷80～200μg、西红花苷I 80～200μg、西红花苷II 80～200μg、京尼平龙胆双糖苷80～200μg的混合对照品溶液；
步骤2：供试品溶液制备，取栀子药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或乙醇，浓度为50％～100％，料液比为1：25～1：100，称定重量，回流或超声处理10-50min，放冷，再称定重量，用50％～100％甲醇或50％～100％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得；
进一步地，取栀子药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，加入浓度为50-100％的甲醇，料液比为1：25～1：100，称定重量，超声处理20-40min，放冷，再称定重量，用50-100％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；
进一步的，超声处理可以为功率500W，频率40kHz；
步骤3：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录指纹图谱；所述色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为含添加剂为甲酸、乙酸或磷酸的水相，流速为0.5mL/min-1.5mL/min，所述进样量为5-50μL，所述检测波长为：200-500nm；
进一步地，色谱柱长度为100-250mm，直径为2.1-4.6mm，粒径为1.7-5μm，流动相A为乙腈，流动相B为含添加剂浓度0.1～0.5％甲酸的水相，采用梯度洗脱，0～55min,5～40％A；55～60min,40～90％A；60～65min,90％A；
步骤4：指纹图谱的建立，取26批栀子药材分别按步骤102制备供试品溶液，按步骤c)依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，选择不同批次栀子的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱，计算各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积；
进一步地，优选确定10个共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱，以4号峰为参照峰，10个共有色谱峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、相对峰面积如表1所示；
表1标准对照指纹图谱的保留时间、相对保留时间、峰面积、相对峰面积
步骤5：鉴别分析，以步骤4指纹图谱中共有色谱峰峰面积为数据，用SIMICA 14.1进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，根据OPLS-DA中变量重要性投影值(VIP)确定质量标志物，以此区别不同产地的栀子药材。
步骤6：共有色谱峰结构的鉴定，采用液相色谱-串联质谱仪鉴定共有色谱峰，液相色谱方法与步骤3一致，质谱所用的电离模式为电喷雾负离子电离，所述气帘气：25-45psi；温度：300-400℃；干燥气流速：8-12L/min；离子化压力：3500-4500V；毛细管电压：60-80V；裂解电压：15-30eV；
下面将通过具体实施例来进一步详细阐述：
实施例一：
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Alliance高效液相色谱系统，包括2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站。MS204TS电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)，安捷伦超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪Q-TOF 6540。
色谱柱：Tnature-ACCHROM C18柱(4.6×250mm,5μm,美国沃特世公司)，SymmetryC18柱(4.6×250mm,5μm,美国沃特世公司)和AglientEclipse XDB-C18(4.6×250mm,5μm,美国安捷伦公司)。
1.2试药
对照品：京尼平龙胆双糖苷(批号6144，规格20mg，纯度99.1％)，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；栀子苷(批号BP0632)、西红花苷I(批号BP0406)、西红花苷II(批号BP0407)，均购自成都普瑞法科技开发有限公司；栀子对照药材(批号120986-201610，规格1g)购自中国食品药品检定研究院；药材：栀子药材共26批，采自江西省芦家园基地下喻村、安塘基地熊家村、中宅基地全村、湖南、福建，由江西樟树天齐堂中药饮片有限公司提供，质量符合2015年版《中国药典》。经中国科学院大连化学物理研究所杨小平鉴定鉴定，研究样品均为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，具体信息见表2。
表2 26批栀子样品信息
试剂：乙腈(色谱级)、甲醇(色谱级)、乙醇(色谱级)均购自Sigma-Aldrich。磷酸(色谱级)购自Sigma-Aldrich。甲酸(色谱级)购自Aladdin。实验室用水来自Milli-Q超纯水净化系统(Billerica,MA,USA)。
2方法
2.1色谱条件
HPLC-DAD色谱条件色谱柱：Tnature-ACCHROM C18柱(4.6×250mm,5μm,美国沃特世公司)，流动相乙腈(A)-0.5％甲酸溶液(B)洗脱，0～55min,5～40％A；55～60min,40～90％A；60～65min,90％A；流速为1mL/min；进样量为10μL；柱温为30℃；检测波长：0～28min,254nm；28～65min,440nm。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液制备：取适量栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷，精密称定，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含栀子苷80μg、西红花苷I 80μg、西红花苷II 80μg、京尼平龙胆双糖苷80μg的混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液制备：取栀子药材粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得。
2.3方法学考察
2.3.1精密度试验取同一批次栀子药材，制备供试品溶液，连续进样6次，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，主要特征峰的相对峰面积RSD小于3％，表明仪器精密度良好。
2.3.2稳定性试验取同一批次栀子药材，制备供试品溶液，分别于0h、6h、12h、18h、24h注入液相色谱仪，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，主要特征峰的相对峰面积RSD小于4％，表明供试品溶液24h内稳定性良好。
2.3.3重复性试验取同一批次栀子药材，制备6份供试品溶液，进样，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，主要特征峰的相对峰面积RSD小于4％，表明该方法重复性良好。
2.4耐用性试验
色谱柱的影响：取同一供试品溶液，比较Symmetry C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)、Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)和Tnature C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)等3种色谱柱对栀子特征图谱的影响。结果表明，栀子样品在三根不同品牌C18色谱柱上的分离效果差别较大，其中在Tnature C18色谱柱上50分钟左右的色谱峰峰形和分离度相对较好。综合考虑，选定Tnature C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)作为栀子药材特征图谱的分析色谱柱。
柱温的影响：取同一供试品溶液，考察20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等5个柱温条件对栀子特征谱图的影响。结果表明，不同柱温条件下，栀子样品的特征图谱无显著性差异。综合考虑，选定栀子药材特征图谱的柱温为30℃。
不同流速的影响：在相同色谱柱上，比较0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min等5个流速条件对栀子特征图谱的影响。结果表明，不同流速条件下，栀子样品的特征图谱分离效果基本相同。综合考虑，选定栀子药材特征图谱的流速为1.0mL/min。
不同流动相的影响：取同一供试品溶液，分别用乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.5％甲酸水溶液、乙腈-0.5％乙酸水溶液对流动相体系进行考察。乙腈-0.5％甲酸水溶液体系下的色谱峰的峰数较多、响应值较高、分离度较好，且基线平稳。选择乙腈-0.5％甲酸水溶液作为流动相体系。
3操作分析
3.1栀子药材指纹图谱的建立
取26批栀子药材，按“2.2.2”项下方法制备得到供试品溶液，所有供试品溶液均按“2.1.1”项下的色谱条件分别进样进行分析，获得栀子药材的HPLC指纹图谱(图1)。将其全部导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》(2012版)，设定S1为参照谱图，采用中位数法进行自动匹配，加以多点校正，确定10个共有色谱峰，得到栀子药材的对照谱图，如图2所示。以4号峰为参照峰，10个共有色谱峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、相对峰面积如表1所示。
实施例二：
1鉴别分析
栀子样品的正交偏最小二乘判别分析：正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)分析是一种有监督的模式识别方法，可将组内的差异最小化，更强调不同组之间的差异。其中一些参数如监督模型解释率(R2Y)、模型预测能力(Q2)可用于评价模型稳定性及准确度。R2Y、Q2高于0.5时，表示模型预测率较高，当二者接近1时，说明模型越稳定。本实验将25批样品的11个共有峰峰面积导入SIMCA-P14.1软件，进行OPLS-DA分析，获得相应模型。其模型质量参数Q2Y＝0.928，R2Y为0.944，Q2为0.968。从OPLS-DA得分矩阵图(图3)可以看出，江西产区的栀子与其他两个产区(福建与湖南)的栀子在OPLS-DA 图中呈现了各自的特定区域，分离效果明显。为进一步确认对样品分类贡献度较大的成分，采用OPLS-DA中变量重要性投影值(VIP)筛选质量差异性物质。在95％的置信区间内，VIP值大于1的化合物在两组分类中发挥重要作用。如图4所示，只有峰5的VIP值大于1，说明峰5是区分江西栀子与福建与湖南栀子的质量差异物。
2栀子指纹图谱中共有色谱峰结构的鉴定
采用高效液相色谱-飞行时间串联四极杆高分辨质谱(HPLC-QTOF-MS/MS)对栀子的化合物进行定性分析。通过与对照品对比及分析一级精确分子量及二级碎片离子信息，对栀子指纹图谱各共有峰进行归属，液相色谱方法与2.1.1方法一致，所用的电离模式为电喷雾负离子电离，所述气帘气：25-45psi；温度：300-400℃；干燥气流速：8-12L/min；离子化压力：3500-4500V；毛细管电压：60-80V；裂解电压：15-30eV，结果见表2。
*对照品确认
表2栀子指纹图谱中共有峰的鉴定
现有方法相似度计算
取26批(S1～S26)栀子药材分别按2.2.2方法制备供试品溶液，按2.1.1方法依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，计算相似度，结果显示，26批栀子药材(S1～S26)的相似度分别为1.000，0.999，1.000，1.000，0.996，0.999，0.999，0.999，0.997，0.992，0.998，0.999，0.995，0.994，0.995，0.998，0.982，0.989，0.976，0.979，0.997，0.992，0.982，0.987，0.992，0.996。相似度结果显示26批栀子药材在相似度均在0.9以上，不同产地的栀子药材难以实现区分。
本发明提供的技术方案与现有技术的比较如下:
| 专属性 | 峰识别数目 | 产地区分 | 质量标志物 | |
| 现有技术 | 弱 | 少 | 无法区分 | 无法确定 |
| 本发明 | 强 | 多 | 可以区分 | 可以确定 |
从表中可以看出本发明方法专属性强、峰识别数目多，指纹图谱结合正交偏最小二乘判别分析可用于不同产地栀子的鉴别及质量标志物的筛选，采用液质联用技术，对共有色谱峰进行定性分析，明确不同产地栀子药材的质量差异物质。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。
Claims (5)
1.一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，其特征在于，包括以下步骤：
a) 对照品溶液制备：取适量栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷精密称定，加50%~100%甲醇或乙腈制成栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷的混合对照品溶液；
b) 供试品溶液制备：取栀子药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇或乙醇，浓度为50%~100%，料液比为1：25~1：100，称定重量，回流或超声处理10-50min，放冷，再称定重量，用50%~100%甲醇或50%~100%乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得；
c) 高效液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录指纹图谱；所述色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为纯甲醇或纯乙腈，流动相B为含添加剂为0.05%-0.5%甲酸、0.05%-0.5%乙酸或0.05%-0.5%磷酸的水相，流速为0.5 mL/min-1.5 mL/min，所述进样量为5-50 μL，所述检测波长为200-500 nm；
d) 指纹图谱的建立：取26批栀子药材分别按步骤b)制备供试品溶液，按步骤c)依次高效液相色谱测定，记录指纹图谱，将所述指纹图谱全部导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，选择不同批次栀子的指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱，计算各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积；
e) 鉴别分析：以步骤d)指纹图谱中共有色谱峰峰面积为数据，用SIMICA 14.1进行正交偏最小二乘判别分析，根据OPLS-DA中变量重要性投影值确定质量标志物，以此区别不同产地的栀子药材；
f) 共有色谱峰结构的鉴定：采用液相色谱-串联质谱仪鉴定共有色谱峰，液相色谱方法与步骤c)一致，质谱所用的电离模式为电喷雾负离子电离，所述气帘气：25-45 psi；温度：300-400 ℃；干燥气流速：8 -12 L/min；离子化压力：3500-4500 V；毛细管电压：60-80V；裂解电压：15-30 eV。
2.根据权利要求1所述的一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，其特征在于，所述步骤a)中，取适量栀子苷、西红花苷I、西红花苷II、京尼平龙胆双糖苷精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含栀子苷80~200 μg、西红花苷I 80~200 μg、西红花苷II 80~200 μg、京尼平龙胆双糖苷80~200 μg的混合对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，其特征在于，所述步骤b)中，取栀子药材粉末，精密称定，过三号筛，置具塞锥形瓶中，加入浓度为50-100%甲醇，料液比为1：25~1：100，称定重量，超声处理20-40 min，放冷，再称定重量，用50-100%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。
4.根据权利要求1所述的一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，其特征在于，所述步骤c)中，色谱柱长度为100-250 mm，直径为2.1-4.6 mm，粒径为1.7-5μm，流动相A为纯乙腈，流动相B为含添加剂浓度0.1~0.5%甲酸的水相，采用梯度洗脱，0~55 min, 5~40%A；55~60 min, 40~90%A；60~65 min, 90%A。
5.根据权利要求1所述的一种栀子药材的指纹图谱检测方法及其应用，其特征在于，所述步骤d)中，确定10个共有色谱峰，生成标准对照指纹图谱。
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