CN102692473A

CN102692473A - 一种栀子药材指纹图谱的测定方法

Info

Publication number: CN102692473A
Application number: CN2011100679324A
Authority: CN
Inventors: 蔡艳; 裴彩云; 贾继明; 宋剑; 郭文胜
Original assignee: Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-03-22
Filing date: 2011-03-22
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2031-03-22
Also published as: CN102692473B

Abstract

本发明提供了在同一系统适应性条件下，采用在紫外-可见(UV-Vis)检测波长下，同时测定栀子中主要的两类成分，即环稀醚萜苷类和西红花苷类，通过对不同产地的栀子药材进行研究建立栀子药材的指纹图谱，符合药物制剂质量控制的要求，可有效控制该栀子药材的质量。

Description

一种栀子药材指纹图谱的测定方法

技术领域

本发明涉及到一种栀子药材指纹图谱的测定方法。

背景技术

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。9～11月果实成熟呈红黄色时采收，除去果梗和杂质，蒸至上气或置沸水中略烫，取出干燥。性寒味苦[中华人民共和国卫生部药典委员会. 中国药典(一部) [M ]. 北京:化学工业出版社, 2010.]。其主要化学成分为环烯醚萜类（栀子苷、京尼平龙胆二糖苷、山栀子苷、栀子酮苷等）[王钢力,陈德昌,赵淑杰.中国中药杂志,1996,21(21):67-69]，西红花苷类（栀子黄色素、栀子蓝色素）主要用于食品着色剂，还含有挥发油，多糖等化学成分[崔树德.中药大全[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1986:235.]。具泻火除烦，清热利湿，凉血散癖之功。我国主产于江西、湖南、湖北、浙江、福建和广西等省区。

由于产地气候环境的差异及栀子药材采收季节的不同，致使其对栀子药材化学成分含量影响很大。目前常用的鉴定栀子药材的优劣主要是测定栀子苷含量，2010版《中国药典》也只以测定栀子苷含量为指标。

中药材的化学成分复杂多样，近年来随着色谱技术的提高指纹图谱技术已被广泛应用，采用单一波长单一指标物建立指纹图谱，不能反应样品的系统性、完备性，采用多波长建立药材指纹图谱的本质就是尽可能使图谱中每个指纹峰在其最大吸收波长状态下表现在图谱中，这样更能反应样品的特征性。

发明内容

本发明的目的是提供一种栀子药材的指纹图谱测定方法，本发明指纹图谱测定方法采用高效液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：

色谱条件：色谱柱为Waters Symmetry -C₁₈，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相A为水，B为乙腈，流速0.8ml/min，按下表进行梯度洗脱；

时间（min）	流动相A	流动相B
			0	90%	10%
12	86%	14%
			15	86%	14%
20	78%	22%
			30	78%	22%
40	65%	35%
			50	60%	40%

柱温30℃；检测波长：0-20分钟为238nm、20-60分钟为440nm；

供试品溶液的配制：取栀子药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50ml甲醇，称定重量，超声处理30min，时时振摇，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，微孔滤膜过滤，即得；

测定法：精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，即得。

本发明指纹图谱测定方法中所使用的供试栀子药材需要粉碎以利于提取，优选为粉碎后全部通过药典四号筛，样品溶液滤过的微孔滤膜规格优选为0.22μm。

本发明方法测定栀子药材指纹图谱从多个方面评价该方法的可行性，评价方法如下：

1.仪器与试药

Agilent 公司1100型HPLC仪

超声仪：HS10260D 天津市恒奥科技发展有限公司

色谱柱：Waters Symmetry -C18(4.6mm×250mm，5μm) Waters公司。

对照品：栀子苷对照品购于中国药品生物药品检定所，批号（110749－200516）。京尼平龙胆二糖苷、西红花苷-1由本实验室自己分离得到经波谱鉴定确认其结构。

药材：栀子10批药材经河北省药检所鉴定为栀子药材，产地分别为1.湖北 2. 江西丰城Ⅰ3.江西泽丰4.浙江金华5.江西樟树Ⅰ6.金溪 7.江西樟树Ⅱ8.广西9江西新干 10.湖南石门。

试剂：甲醇、乙腈为色谱级，水：双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2.方法

2.1供试品溶液的制备：

取栀子药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50ml甲醇，称定重量，超声处理30min，时时振摇，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，微孔滤膜过滤，即得。

2.2对照品溶液的制备：

栀子苷对照品溶液的配制：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇中制成50μg/ml的溶液。

京尼平龙胆二糖苷对照品溶液的配制：取京尼平龙胆二糖苷适量，加甲醇制成0.2mg/ml的溶液；

西红花苷-1对照品溶液的配制：取西红花苷-1对照品适量，加甲醇制成0.1mg/ml的溶液。

2.3色谱条件与系统适应性试验：

柱温30℃；检测波长：0-20分钟为238nm、20-60分钟为440nm；

2.4测定法：

精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，分别精密吸三种对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

3.方法学试验

3.1 精密度试验

精密称取2号栀子药材，制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件，连续进样5次。分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果显示各指纹峰的RSD%小于2.5%。

3.2 重复性试验

精密称取2号栀子药材5份，制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件，分别对5份样品进行测定。并对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果显示各指纹峰的RSD%小于2.0%。

3.3稳定性试验

精密称取2号栀子药材，制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件，分别在0，4，8，12，24h进样分析，分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果显示各指纹峰的RSD%小于1.5%。

3.4参照峰的选择：

取不同产地的栀子样品，按2.1供试品溶液的制备及2.3液相色谱条件，建立不同产地栀子样品的指纹图谱，结果见图1，不同产地的栀子均是栀子苷含量最高，且分离效果好，故选栀子苷作为参照峰。

3.5栀子药材指纹图谱共有模式确立

根据国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，将1～10批次栀子药材图谱数据导入，经多点校正和数据匹配，以中位数法生成对照指纹图谱。相似度见表1，指纹图谱见图2。

3.6相似度计算及分析

按照建立的指纹图谱对不同产地的栀子药材进行相似度分析，结果表明，不同产地、气候条件对栀子化学成分的影响很大。

表1 栀子10批药材指纹图谱相似度计算结果

3.7系统聚类分析

系统聚类分析是一种无管理、无指导的模式识别方法。聚类分析可将一些观察对象依据某些特征加以归类，在生物学和医学分类问题中有着广泛的应用，它可依据所测样品的数据，对样品进行分类。先把N个样品或观察指标看成N类，然后逐步合并，直到N个对象并成一类为止。本实验运用统计软件对其进行系统聚类分析，图3为系统聚类分析的树形图，它直观地显示了整个聚类过程，将10个不同产地的栀子药材分为4类，由结果显示中的树形图可知，3、9、5、2、6为Ⅰ类；4、10、7为Ⅱ类；8为Ⅲ类；1为Ⅳ类。结果见图3。

由图3可以看出10份药材基本可以分为四大类，S3、S5、S2、S9、S6为一类S4、S7、S10为一类、S8为一类S1为一类，S1为一类与其它样品相似度较低。聚类分析可以体现样品之间的远近亲疏关系，所以这种分类方法可以作为道地药材的鉴定。

4 结论

4.1 栀子不同产地的指纹图谱可以看出，产地及气候条件对中药的化学成分及含量的大小影响有很大差异。故用药时应固定产地，建立栀子药材的GAP基地以保证栀子药材有很好的稳定性。

4.2 检测波长的选择：栀子苷在238nm处有最大吸收（2010版《中国药典》一部）；西红花苷类在440nm有最大吸收（经190nm-500nm全波长扫描）。本实验选择紫外－可见光检测使其更好的反应栀子药材的指纹图谱，选择了在238nm测定环烯醚萜苷类物质，等液相条件到20分钟时，在同一检测通道将波长改变到可见光440nm测定西红花苷类物质，整个液相条件在50分钟内即可达到较好的分离。

4.3 色谱条件的选择：本实验主要对乙腈-水，甲醇－水系统进行了考察结果乙腈－水系统分离效果较好，甲醇－水系统分离西红花苷类峰型好，且达到基线分离，但是分离环稀醚萜苷类物质峰型不成形，故选择乙腈－水系统进行梯度洗脱。

4.4 样品制备方法的选择：栀子药材在烘箱60℃烘干、粉碎、过四号筛，分别精密称取栀子药材0.1g，6份置三角瓶中，分别用甲醇超声、纯水超声、50%甲醇超声、甲醇回流水浴提取、水回流提取、50%甲醇回流提取。结果50%甲醇超声提取不完全；水回流提取对环烯醚萜苷类提取完全，但对西红花苷类物质提取不完全，甲醇超声、甲醇回流提取差别不大，故选择甲醇超声提取，此方法简单，易操作。

综上，本发明栀子指纹图谱测定方法，采用双波长（UV-Vis）高效液相色谱法，可在同一色谱条件下利用不同波长检测，实现多类组分、多个成分的同时测定，提高了效率，并且有很好的准确度和精密度，它是一种科学、可行的中药分析模式，这一方法在中药质量控制方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1 栀子药材特征指纹图谱（2号峰为京尼平龙胆二糖苷、3号峰为栀子苷、5号峰为西红花苷-1）。

图2 10批栀子药材色谱图。

图3 栀子样品聚类图。

具体实施方式

实施例1

柱温30℃；检测波长：0-20分钟为238nm、20-60分钟为440nm；

供试品溶液的配制：将栀子药材粉碎5分钟，取粉碎好的栀子药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50ml甲醇，称定重量，超声处理30min，时时振摇，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，微孔滤膜过滤，即得；

评价结果：

评价结果表

	精密度RSD(%)	重复性RSD(%)	溶液稳定性RSD(%)
				结果	2.5	2.0	1.5

结论：该方法用于测定栀子药材指纹图谱，结果令人满意可以用于控制栀子药材的质量。

实施例2

柱温30℃；检测波长：0-20分钟为238nm、20-60分钟为440nm；

供试品溶液的配制：取可完全通过药典四号筛的栀子药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50ml甲醇，称定重量，超声处理30min，时时振摇，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，0.22微孔滤膜过滤，即得；

评价结果：

评价结果表

	精密度RSD(%)	重复性RSD(%)	溶液稳定性RSD(%)
				结果	2.2	2.4	1.7

Claims

1.一种栀子药材指纹图谱测定方法，其特征在于该方法采用高效液相色谱法，色谱条件及测定方法如下：

时间（min）流动相A 流动相B 0 90% 10% 12 86% 14% 15 86% 14% 20 78% 22% 30 78% 22% 40 65% 35% 50 60% 40%

柱温30℃；检测波长：0-20分钟为238nm、20-60分钟为440nm；

2.如权利要求1所述的栀子药材指纹图谱测定方法，其特征在于所述栀子药材粉末为栀子药材粉碎后全部通过药典四号筛的粉末；所述微孔滤膜规格为0.22μm。