CN106442809A

CN106442809A - 大叶金花草指纹图谱的构建方法及其指纹图谱

Info

Publication number: CN106442809A
Application number: CN201611235239.2A
Authority: CN
Inventors: 朱华; 周洁; 周雨晴; 杜沛霖; 周峰
Original assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN106442809B

Abstract

本发明公开了一种大叶金花草指纹图谱的构建方法及其指纹图谱，具体是：材料准备；制备原儿茶醛参照溶液；制备原儿茶酸参照溶液；制备牡荆素参照溶液；制备荭草苷参照溶液；用乙醇超声提取法制备供试品溶液；采用 HPLC 测定得到指纹图谱。以及由此方法得到的大叶金花草标准指纹图谱，通过对大叶金花草高效液相色谱指纹图谱的研究，得到了一种较好的大叶金花草质量控制方法。本发明方法简便、快速、准确、重现性好,为大叶金花草质量的全面有效控制提供了有力保障。

Description

大叶金花草指纹图谱的构建方法及其指纹图谱

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及中药药材的质量控制方法，具体涉及大叶金花草指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。

背景技术

大叶金花草出自《广西中药志》。

大叶金花草多年生草本，高可达65厘米。根茎坚硬而短，横走，密被赤褐色钻状鳞片。叶近生，叶柄长达25厘米，禾秆色，光亮，直立；叶近革质，无毛；3～4回羽状分裂，披针形，长20～40厘米，宽5～12厘米；下部羽片卵状技针形，斜展，长5～10厘米，宽2～5厘米；小羽片矩圆形或披针形；末回裂片楔形，先端截形，有牙齿，基部楔形，下延，叶脉下面明显，2叉状分枝。孢子囊群顶生，每裂片上1～2枚，囊群盖灰棕色，半杯形，宽与叶缘等长，向外开裂。

拉丁植物动物矿物名：Sphenomeris chinensis(L.)Maxon[Adiantum chusanumL.;Stenoloma chusana(L.)Ching]。

拉丁文名：Herba Stenolomae。

功效分类：清热解毒药；利湿药。

科属分类：鳞始蕨科。

别名：野黄连、水黄连、牙齿芒、擎天蕨、雪仙草、扫雪花、蜢蚱参、上树细辛草、青蕨、金花草、大金花草、乌韭、石发、地柏枝、雉鸡尾、小鸡尾草、细叶狼箕、花叶凤尾草、乌竹、墙柏、细叶凤凰尾、土黄连、孔雀尾、万能解毒草、苦黄连。

性味：微苦；寒；无毒。

归经：肝经；肺经；大肠经。

功能：清热解毒；利湿止血。

主治：感冒发热；咳嗽；咽喉肿痛；肠炎；痢疾；肝炎；湿热带下；痈疮肿毒；痄腮；口疮；烫火伤；毒蛇、狂犬咬伤；皮肤湿疹；吐血；尿血；便血；外伤出血。

用法用量：内服：煎汤，15-30g；或绞汁。外用：适量，捣敷；或研末外敷；或煎汤洗。

生态环境：生于海拔200-1900m的林下、路边或空旷处。

药材基源：为鳞始蕨科植物乌蕨的全草或根茎。

采收储藏：夏、秋季挖取带根茎的全草，去杂质，洗净，鲜用或晒干。

大叶金花草广泛的分布于西南及江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、西藏、陕西、四川等地，具有清热解毒、利湿、止血的功效、主治感冒发热、咳嗽、咽喉肿痛、肠炎、痢疾、肝炎、湿热带下、痈疮肿毒、痄腮、口疮、烫火伤、毒伤、狂犬咬伤、皮肤湿疹、吐血、尿血、便血、外伤出血，具有广谱的的抗菌活性和解毒作用。民间用于治疗胃癌、肠癌、食物中毒和农药中毒，有“万能解毒药”之称。其化学成分主要有有机酸类和黄酮类。牡荆素又名牡荆苷，为大叶金花草的有效成分之一，具有防癌抗肿瘤、抗炎、解痉、降压等作用。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它可以较全面地反映药材所含化学成分的种类和数量，有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点已被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种大叶金花草指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的大叶金花草标准指纹图谱，通过对大叶金花草高效液相色谱指纹图谱的研究，得到了一种较好的大叶金花草质量控制方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

大叶金花草指纹图谱的构建方法，采用液相色谱法对大叶金花草进行测定，具体方法如下：

（1）材料准备：供试品的大叶金花草全采自广西，经广西中医药大学药用植物园鉴定为陵齿蕨科植物乌蕨Stenoloma chusanaum Ching的全草；原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素四种对照品由中国食品药品检定研究院提供；将供试品磨成粉末，过2号筛备用；

（2）参照物溶液的制备：

原儿茶醛，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0498mg/ml的参照溶液；

原儿茶酸，五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0538mg/ml的参照溶液；

牡荆素，五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0573mg/ml的参照溶液；

荭草苷，五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0503mg/ml的参照溶液；

（3）供试品溶液的制备：

称取供试品粉末0.3g，置于50ml锥形瓶中，加入50%乙醇30ml超声30min，滤过，浓缩至约15ml，用60ml乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，挥干乙酸乙酯，得残留物，残留物用10%乙腈定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml～5ml容量瓶，再用10%乙腈稀释至刻度线即得供试品溶液；

（4）色谱条件及系统适用性试验：

色谱柱：Agilent TC-C18；

流动相：B泵：乙腈；D泵：0.4%磷酸；

梯度洗脱程序：

0～10min，B泵：10%→15%，D泵:90%→85%；

10～40min，B泵：15%→20%，D泵:85%→80%；

40～45min，B泵：20%→25%，D泵:80%→75%；

45～55min，B泵：25%→30%，D泵:75%→70%；

55～70min，B泵：30%→30%，D泵:70%→70%；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：25℃；

理论塔板数按原儿茶酸计算不低于10000；

（5）测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

液相色谱仪为Agilent 1260 Infinity Series高效液相色谱仪，选择耐受压力为0-6200psi或0-42MPa。

指纹图谱中有 14个特征共有峰，利用DAD检测器，对供试品与参照物同时检测，其中2号峰为原儿茶酸，3号峰为原儿茶醛，6号峰为荭草苷，8号峰为牡荆素。

大叶金花草指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱在大叶金花草提取物和制剂检测中的应用。

本发明的有益效果为：

1、本发明采用乙腈-磷酸溶液洗脱系统，使金花草中大部分黄酮类化合物得到了较好分离，得到较完整的HPLC谱图，确定了指纹图谱条件；

2、本发明检测方法所采用的供试品制备简单，色谱条件易于实现；该方法快速、准确，精密度，重现性和稳定性良好，色谱峰信息丰富且分离度好，所建立的指纹图谱能够有效地表征大叶金花草的质量；

3、本发明将大叶金花草作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异，适用于对大叶金花草真伪、产地和品质的鉴别和控制；

4、本发明提供了一种大叶金花草指纹图谱的构建方法，通过该方法可获得大叶金花草的标准指纹图谱，完善了大叶金花草的质量评价体系，为大叶金花草质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。

附图说明

图 1 为大叶金花草HPLC指纹图谱；

图 2 为25批次大叶金花草原始指纹图谱；

图3为采用水回流提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；

图4为采用水超声提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；

图5为采用65%乙醇超声提取（乙酸乙酯萃取）对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；

图6为采用65%乙醇超声提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；

图7为采用40%乙醇超声提取（乙酸乙酯萃取）对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；

图8为采用乙酸乙酯超声提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；

图9为采用水冷浸法提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱。

具体实施方式

（2）参照物溶液的制备：

（3）供试品溶液的制备：

称取25批供试品粉末每批0.3g，置于50ml锥形瓶中，加入50%乙醇30ml超声30min，滤过，浓缩至约15ml，用60ml乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，挥干乙酸乙酯，得残留物，残留物用10%乙腈定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml～5ml容量瓶，再用10%乙腈稀释至刻度线即得供试品溶液；

（4）色谱条件及系统适用性试验：

色谱柱：Agilent TC-C18；

流动相：B泵：乙腈；D泵：0.4%磷酸；

梯度洗脱程序：

0～10min，B泵：10%→15%，D泵:90%→85%；

10～40min，B泵：15%→20%，D泵:85%→80%；

40～45min，B泵：20%→25%，D泵:80%→75%；

45～55min，B泵：25%→30%，D泵:75%→70%；

55～70min，B泵：30%→30%，D泵:70%→70%；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：25℃；

理论塔板数按原儿茶酸计算不低于10000；

（5）测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，见图1-2。

提取方法考察

金花草药材含有黄酮、酚酸，醛类及挥发油等成分，酚性酸类化合物具有抗真菌活性，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化的活性，黄酮类化合物是乌蕨保肝、抗炎、止血作用的主要有效成分。因此指纹图谱主要针对黄酮、酚酸，醛类成分制定。

游离黄酮类成分难溶于水，较易溶于乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，黄酮苷类具有一定的水溶性，可溶于热水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等；酚酸能溶于水、乙醇、乙醚；醛类易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和热水，溶于冷水，不溶于苯和氯仿等溶剂，故可选用的溶剂有：水、乙醇、乙酸乙酯。常用的溶剂提取方法有：煎煮、回流、超声、冷浸等。本实验对提取方法进行了如下比较：取04号大叶金花草药材粉末0.3g(共7份)，分别采用水回流提取，乙酸乙酯萃取；水超声提取，乙酸乙酯萃取；65%乙醇超声提取，乙酸乙酯萃取；65%乙醇超声提取；40%乙醇超声提取，乙酸乙酯萃取；乙酸乙酯超声提取；水冷浸法提取(提取溶剂均为20ml溶剂，超声和回流均为30min，冷浸为3h，萃取均为40ml乙酸乙酯，萃取两次，每次20ml)，超声功率为200W，频率40kHz。过滤，将溶液浓缩至干，10%乙腈溶解，定容至5ml容量瓶中，用移液枪从容量瓶中移取1ml，再用10%乙腈稀释5倍。将供试品溶液放于离心机中15000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL进样，进行HPLC分析，结果如图5-2~5-8。

结果表明：方法、、提取的物质更多，提取的量大，其中方法用40%乙醇超声提取，乙酸乙酯萃取的方法基线更平稳，故选择该法。

提取条件优化

以乙醇浓度（30%、40%、50%）、乙醇用量（10ml、20ml、30ml）、超声时间(30 min、60 min、90 min)和20ml乙酸乙酯萃取次数（1次、2次、3次）为四个因素，设计L9（34）正交试验，以确定最佳的供试品溶液制备方法。

取04号大叶金花草药材粉末0.3g(共9份)，按正交试验表加入乙醇溶液并超声，滤过，浓缩至约15ml，用乙酸乙酯萃取，每次20ml，挥干乙酸乙酯，得残留物。残留物用10%乙腈定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml至5ml容量瓶中，再用10%乙腈稀释至刻度线。将供试品溶液放于离心机中15000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL进样，进行HPLC检测，得到HPLC检测结果：18个峰在9个图谱中均出现，且面积之和大于总面积的95%，因此以这18个峰的峰面积之和作为考察指标。

比较R值，可知乙醇浓度和超声时间在此试验中起主要作用，萃取次数对试验的影响不大。比较K可知道，各因子对实验的影响分别是：就乙醇浓度而言，50%乙醇＞30%乙醇＞40%乙醇；就乙醇用量来说，30ml＞20ml＞10ml；就超声时间来说，30min＞60min＞90min；就提取次数来说，3次＞1次＞2次。综上，最终选定的供试液提取方法为用50%的乙醇30ml，超声提取30min，再用60ml乙酸乙酯萃取3次，每次20ml。

最佳检测波长的确定

将样品溶液进样经DAD检测器检测后，得到3D图谱以及8个波长下的色谱图，在210nm下样品有最大的吸收，基线平稳，出峰数目最多，丰度合适，故选择210nm作为检测波长。结果表明：210nm对各成分色谱峰检测灵敏度高，且各峰分离度良好，反映出的信息量充足。

不同洗脱系统的考察

考察了乙腈-醋酸（非线性）、甲醇-磷酸（线性）、乙腈-磷酸（线性）、乙腈-磷酸（非线性）和乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐四个系统，结果表明乙腈磷酸非线性洗脱系统较好。

不同色谱柱的考察

色谱柱的柱效明显影响某些成分的分离度，故在构建指纹图谱时应考虑柱效。因金花草中黄酮类成分较多，黄酮类成分一般在ODS柱（C₁₈反相色谱柱）能得到较好分离，故使用C₁₈反相柱。本实验考察了Phenomenex Gemini 5µm C₁₈、依利特SinoChrom OBS-BP 5µm和Agilent TC-C18三种色谱柱对样品的检测效果。同一供试品溶液，在同一HPLC仪器上，在其他色谱条件不变的情况下，色谱峰保留时间、色谱峰的峰形、分离度等均以 Agilent TC-C18柱为好。

不同柱温的考察

考察了25℃和35℃柱温下的检测效果，结果表明温度的变化对样品检测影响不大，本实验选定柱温条件为25℃。

专属性

对25批样品的图谱相似度空白进样检测表明溶剂不干扰检测，3.202min为溶剂峰;延长冲洗至100min，在70min后未见出峰。

精密度

取大叶金花草供试液，进样6针，每次进样量为10µL，采用“中药指纹图谱相似性评价系统”进行评价（中位数法），相似度均＞0.997，见表1；以3号峰（原儿茶醛对照峰）作为参照，计算其余13个峰的相对保留时间和相对峰面积，得出14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果RSD＜0.3%，见表2和3，表明精密度好。

表1 精密度实验相似性评价结果

表2 相对保留时间RSD值

表3 相对峰面积RSD值

重复性

取一个药材，制6份供试品，分别进样，采用《中药指纹图谱相似性评价系统》进行评价，相似度均＞0.997；以3号峰（原儿茶醛对照峰）作为参照，计算其余13个峰的相对保留时间和相对峰面积，得出14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果RSD＜0.2%，表明方法重复性好。

稳定性

取同一个供试品，分别在0h、3h、6h、12h和24h进样检测，采用“中药指纹图谱相似性评价系统”对结果进行评价，相似度均＞0.994；以3号峰（原儿茶醛对照峰）作为参照，计算其余13个峰的相对保留时间和相对峰面积，得出14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果RSD＜0.2%，表明供试品溶液放置24h内稳定。

相似度比较

将记录得到的25批药材HPLC图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012）版》软件，计算各峰与共有模式之间的相似度，结果见表4。

表4 二十五批大叶金花草药材相似度评价结果

结论

25批大叶金花草图谱非常相似，说明在化学成分上比较稳定。

采用乙腈-磷酸溶液洗脱系统，使金花草中大部分黄酮类化合物得到了较好分离，得到较完整的HPLC谱图，确定了指纹图谱条件。本法精密度和重现性较好，可用来评价金花草的内在质量。

除01号、11号和20号，这三批药材相似度在0.71～0.89，其余相似度都大于0.90。01号药材质地柔软，颜色较深；11号和20号药材总体较短，颜色较深。说明药材的长短和颜色（代表了药材的生长期）会影响其指纹图谱的相似度。

在挑选合格药材时，该药材指纹图谱与共有模式的相似度应＞0.90。也就是说，不同生长期的药材所含不同量的次生代谢产物，这种含量差异会反映在指纹图谱上。

Claims

1.大叶金花草指纹图谱的构建方法，其特征在于，采用液相色谱法对大叶金花草进行测定，具体方法如下：

（2）参照物溶液的制备：

（3）供试品溶液的制备：

（4）色谱条件及系统适用性试验：

色谱柱：Agilent TC-C18；

流动相：B泵：乙腈；D泵：0.4%磷酸；

梯度洗脱程序：

0～10min，B泵：10%→15%，D泵:90%→85%；

10～40min，B泵：15%→20%，D泵:85%→80%；

40～45min，B泵：20%→25%，D泵:80%→75%；

45～55min，B泵：25%→30%，D泵:75%→70%；

55～70min，B泵：30%→30%，D泵:70%→70%；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：25℃；

理论塔板数按原儿茶酸计算不低于10000；

2.根据权利要求1所述大叶金花草指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述液相色谱仪为Agilent 1260 Infinity Series高效液相色谱仪，选择耐受压力为0-6200psi或0-42MPa。

3.根据权利要求1所述大叶金花草指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述指纹图谱中有 14个特征共有峰，利用DAD检测器，对供试品与参照物同时检测，其中2号峰为原儿茶酸，3号峰为原儿茶醛，6号峰为荭草苷，8号峰为牡荆素。

4.根据权利要求1所述大叶金花草指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱在大叶金花草提取物和制剂检测中的应用。