CN109771463A - 新疆一枝蒿提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种新疆一枝蒿提取物及其制备方法和用途。所述制备方法包括：(1)将新疆一枝蒿药材用乙醇加热回流提取，收集提取液并回收溶剂后得到新疆一枝蒿粗提取物；(2)将所述新疆一枝蒿粗提取物加水悬浮，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿萃取，分别收集石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和氯仿萃取液，回收溶剂后得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物，其中乙酸乙酯萃取物即为所述新疆一枝蒿提取物。本发明可以高效地提取和富集新疆一枝蒿提取物有效成分，含量高、杂质少，并明确了具有抗氧化、抗感染作用的有效成分。

Description

新疆一枝蒿提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及新疆一枝蒿提取物及其制备方法和用途。

背景技术

新疆一枝蒿为新疆维吾尔族和哈萨克族民间传统常用药材，来源于菊科(Compositae)蒿属多年生植物岩蒿Artemisia rupest L.的全草，维吾尔药名一孜伙艾密尼(药名出处：《维吾尔药志》)，其主产于新疆地区，主要分布于新疆维吾尔自治区内的阿尔泰、天山地区，生长于海拔1500～4000米的草原和森林地带，在新疆地区各族民间广泛沿用至今，故名新疆一枝蒿。维医认为新疆一枝蒿性寒，味辛、苦，具有祛风解表，清热解毒，活血散瘀等功效，用于治疗风寒感冒，跌打瘀肿，风疹，解蛇毒等。该药材记载于清代《本草纲目拾遗》(1765年)，记载：“巴里坤出一种药，名一枝蒿。生深山中无枝叶，一枝茁土，气味如蒿。四月间，牧马入山，收草携归，煎膏以售远客，有贩至兰州货卖者。活血解毒，去一切积滞，沉痼阴寒等疾……”。目前已收入《药品标准》维吾尔药分册、《维吾尔药志(上册)》和《中华本草(维吾尔药卷)【1-2】》。现代生物学家认为，由于新疆气候干燥，新疆一枝蒿生长环境严酷，为了适应环境，一枝蒿以减少枝叶(减少蒸发)，呈独一枝的形态顺应自然，故与其它蒿属植物相比，其在新疆地区有较强的生命力。在民间，维吾尔族和哈萨克族牧民对它更有特殊的感情，几乎每个毡房家家户户都备有此药，流传“家有一枝蒿，不怕毒蛇咬”，“家有一枝蒿，百病都除掉”等谚语。维吾尔药志中记载新疆一枝蒿有祛风活血、散瘀消肿、健胃消食、清热解毒、抗过敏、解蛇毒等功效，用于治疗毒蛇咬伤、荨麻疹、消化不良、感冒、肝炎、过敏性疾病等病症。

新疆一枝蒿是新疆地区特色民族药，广泛应用于临床，且临床制剂较多，如以新疆一枝蒿为主要原料的单味药制剂一枝蒿冲剂及复方制剂在临床用于感冒和肝炎疗效显著。随着民族药基础研究的深入，其临床应用价值得到更多重视，有很大的开发研究前景。

发明内容

为了阐明新疆一枝蒿的有效成分、作用机理和安全性，以便临床更好使用，本发明提出了新疆一枝蒿提取物及其制备方法和用途。

一方面，本发明提出了一种新疆一枝蒿提取物的制备方法，包括：

(1)将新疆一枝蒿药材用乙醇加热回流提取，收集提取液并回收溶剂后得到新疆一枝蒿粗提取物；

(2)将所述新疆一枝蒿粗提取物加水悬浮，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿萃取，分别收集石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和氯仿萃取液，回收溶剂后石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物，其中乙酸乙酯萃取物即为所述新疆一枝蒿提取物。

所述乙醇的体积浓度为75-85％，优选为79％，加热回流提取时间为1.5-2.5h，优选为2h，乙醇与新疆一枝蒿药材的比例为15-25ml乙醇/g药材，优选为19ml乙醇/g药材，加热回流提取至少为两次。

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿与水层的体积比为1∶1。

所述乙酸乙酯萃取物通过色谱分离得到单体化合物，优选地，所述色谱包括硅胶柱色谱和凝胶柱色谱。

另一方面，本发明还提出了一种利用所述制备方法制备的新疆一枝蒿提取物。

所述新疆一枝蒿提取物包括黄酮类化合物、倍半萜酮酸类化合物和甾醇类化合物。

所述黄酮类化合物包括紫花牡荆素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素，所述倍半萜酮酸类化合物包括一枝蒿酮酸，所述甾醇类化合物包括胡萝卜苷和β-谷甾醇。

又一方面，本发明还提出了一种利用新疆一枝蒿提取物制备的抗氧化剂和抗病毒剂。

又一方面，本发明还提出了一种新疆一枝蒿提取物在制备抗氧化剂和抗病毒剂中的用途。

又一方面，本发明还提出了一种新疆一枝蒿HPLC指纹图谱的建立方法，包括：

(1)将不同批次的新疆一枝蒿道地药材粉碎，将药材粉末加入甲醇加热回流提取，将得到的滤液挥干溶剂，得到样品浸膏，将样品浸膏溶解于甲醇制得供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪，获得不同批次的新疆一枝蒿标准指纹图谱；

(3)通过标准品比对的方法，确定新疆一枝蒿指纹图谱的主要色谱峰，包括t_R为27.114的槲皮素、t_R为27.586的木犀草素、t_R为34.085的一枝蒿酮酸、t_R为51.022的紫花牡荆素与t_R为51.942的洋艾素。

步骤(1)中甲醇的体积浓度为55-95％，优选75％，甲醇与药材粉末的比例为15-25ml甲醇/g药材粉末，加热回流提取时间为1.5-2.5h，优选2h，加热回流提取2次。

步骤(2)中的色谱条件为：色谱柱为Hydrosphere C18，流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶液，波长为254nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃，进样量为20μL。

又一方面，本发明还提出了一种利用构建的指纹图谱在新疆一枝蒿质量控制中的应用。

所述应用还包括利用通过高效液相色谱法建立的标准曲线测定不同批次新疆一枝蒿中木犀草素的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提出了新疆一枝蒿提取物的最佳提取工艺和有效部位的富集纯化工艺，可以高效地提取和富集新疆一枝蒿提取物有效成分，含量高、杂质少；

(2)通过对新疆一枝蒿提取物中有效成分的分离和纯化，明确了具有抗氧化、抗感染作用的有效成分，有利于其应用；

(3)体外测试表明，本发明的提取物具有抗氧化、抗病毒的活性，可以用于抗氧化剂和抗病毒剂的制备；

(4)本发明提出了一种HPLC指纹图谱的构建方法，结合含量测定可以有效、准确的评价不同批次新疆一枝蒿的质量。

附图说明

图1A和1B分别为乙醇浓度和提取时间对槲皮素峰面积的等高线图和效应面分析图；

图2A和2B分别为乙醇浓度和料液比对槲皮素峰面积的等高线图和效应面分析图；

图3A和3B分别为提取时间和料液比对槲皮素峰面积的等高线图和效应面分析图；

图4为槲皮素标准品的标准曲线；

图5为上样量与洗脱液体积的响应曲面；

图6为上样量与洗脱剂浓度响应曲面；

图7为洗脱液体积与洗脱剂浓度响应曲面；

图8为新疆一枝蒿的对照指纹图谱；

图9为各个新疆一枝蒿样品的叠加色谱图；

图10为木犀草素的标准曲线；

图11为新疆一支蒿提取物的制备方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明经过大量的工艺筛选实验，利用溶剂法对新疆一枝蒿进行提取，并对其主要有效部位进行纯化富集工艺研究，得到主要有效成分含量较高的有效部位，并分离鉴定其中单体化学成分，包括紫花牡荆素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素等化合物，得到了具有明显的抗氧化、抗病毒的药理活性的提取物，同时建立了结合指纹图谱法和含量测定法的模式控制不同批次的新疆一枝蒿质量。

实施例1新疆一枝蒿提取工艺的优选

1.1单因素考察

采用乙醇为提取溶媒，对乙醇浓度、提取时间、料液比和提取次数4个单因素分别进行考察，以槲皮素为考察指标。最终确定的提取率较高的回流提取方法为75vol.％乙醇，回流提取2h，提取2次，最佳料液比为20：1(ml/g)。

1.2效应面法优选提取工艺

在单因素实验的基础上，确定Box-Behnken效应面法的自变量，以新疆一枝蒿槲皮素峰面积为响应值，以乙醇浓度、提取时间、料液比为影响因素进行三因素三水平的效应面设计，因素水平见表1。以槲皮素峰面积作为响应值，对试验结果进行回归分析，以确定新疆一枝蒿中黄酮槲皮素的提取最佳工艺。效应面实验设计及结果见表2。

表1新疆一枝蒿提取工艺效应面优化试验因素水平

表2新疆一枝蒿提取工艺效应面优化试验安排

1.3回归模型有效性及显著性分析

通过Design-expert8.0.6软件对表2的效应面结果进行回归拟合分析，对回归模型进行方差分析，并检验回归方程系数的显著性，如表3所示。

表3回归模型方差分析

注：R2＝0.9706，R2Adj＝0.9329，p＜0.01为极显著，p＜0.05为显著，p＞0.05为不显著

根据方差模型分析结果(表3)可知，仅有乙醇浓度呈现极显著水平，而料液比以及二次项中的提取时间与料液比交互作用呈现显著水平，其余乙醇浓度与料液比及乙醇浓度与提取时间两种组合因素的交互作用不显著。模型P值小于或等于0.01％(P＜＝0.0001)，该模型可信度水平大于或等于99.99％，说明该模型有效；R2＝0.9706，即该回归模型可解释97.06％的变化，说明该模型与实际实验具有良好的拟合度，失拟项不显著(P＞0.05)以及调整系数R2Adj＝0.9329也表明模型拟合程度较好，且总变异中只有6.71％不能用此模型解释。此外，根据F值可知，对新疆一枝蒿中总黄酮(槲皮素)提取产生影响的因素大小依次为乙醇浓度＞料液比＞提取时间。乙醇浓度对于黄酮提取的影响可能是因为黄酮难溶或不易溶于水。

通过Design-Expert8.0.6软件对实验结果进行二元多次回归拟合，对表3的数据进行方差分析后得到二元回归方程如下：

一枝蒿中槲皮素的峰面积(R1)＝4.056E+006+5.643E+005*A-42881.7*B-2.549E+005*C+1.337E+005*A*B-21201.00*A*C-4.308E+005*B*C-1.420E+006*A^2-8.222E+005*B^2-1.005E+006*C^2

1.4效应面法分析及最佳工艺结果

根据回归方程得出不同因子的效应面和等高线结果见图1～3。二维等高线图和3D效应面图可以将回归模型生动的表现出来。从上图可以较明显的分析出多个自变量对效应值的影响，而且还可以分析出效应值对不同自变量变化的敏感程度。在效应面图中，曲面越陡峭，则该因素对效应值的影响越显著，曲面越平滑，则该因素对效应值的影响越不显著。同时，针对三个自变量因素的效应面法分析中，在控制其中一个自变量因素不变的前提下，两个有交互的两个自变量对效应值的影响也可以从效应面图的曲面上看出。等高线图与效应面图相对应，等高线图随着效应面图的变化而变化，其曲线越接近中心，则对应的效应值也就越大。等高线图形状接近圆形，表明两个自变量间的交互效应较弱，若等高线的形状接近椭圆形，表明两个自变量间交互作用较强。

图1表示固定料液比为0水平，乙醇浓度(55vol.％-95vol.％)与提取时间(1.5h-2.5h)交互作用的等高线和3D图。从图1A中的等高线可以看出，乙醇浓度和提取时间对槲皮素峰面积的影响的交互作用不十分显著，因为等高线接近圆形。但两者相比较，乙醇浓度对槲皮素峰面积的影响比提取时间大。从图1B的效应面图中可知，乙醇浓度和提取时间对槲皮素峰面积的影响很显著，因为曲面很陡峭。随着提取时间的增加，槲皮素峰面积呈现先上升后下降的趋势，但整体较为平稳，相对变化较小。随着乙醇浓度的逐渐增大，槲皮素峰面积也呈现先升高后下降的趋势，但上升幅度较大，下降幅度不大，相对变化明显。通过对比再次说明乙醇浓度对槲皮素峰面积的影响比提取时间大。

图2表示固定提取时间为0水平，乙醇浓度(55vol.％-95vol.％)与料液比(15-25ml/g)交互作用的等高线和3D图。从图2A中的等高线可以看出，乙醇浓度和料液比对槲皮素峰面积的影响的交互作用较为显著，因为等高线呈椭圆形。乙醇浓度对槲皮素峰面积的影响比料液比大。从图2B的效应面图中可知，乙醇浓度和料液比对槲皮素峰面积的影响很显著，因为曲面很陡峭。随着料液比的增加，槲皮素峰面积呈现先上升后下降的趋势，但相对而言整体较为平稳，相对变化较小。随着乙醇浓度的逐渐增大，槲皮素峰面积也呈现先升高后下降的趋势，但前期上升幅度较大，后期下降幅度却不大，相对变化明显。通过对比再次说明乙醇浓度对槲皮素峰面积的影响同样比料液比大。

图3表示固定乙醇浓度为0水平，提取时间(1.5h-2.5h)与料液比(15-25ml/g)交互作用的等高线和3D图。从图3A中的等高线可以看出，提取时间和料液比对槲皮素峰面积的影响的交互作用较为显著，因为等高线呈椭圆形。而且相对于图1A及图2A的等高线而言，图3A的等高线最接近椭圆，说明提取时间和料液比的交互作用相对于其他两种组合因素的交互作用更显著。从图3B的效应面图中可知，提取时间和料液比对槲皮素峰面积的影响并不显著，因为曲面很平坦。随着料液比的增加，槲皮素峰面积呈现上升的趋势，只是开始的时候上升比较快，后来比较缓慢。但相对而言整体较为平稳，相对变化较小。同样的，随着提取时间的逐渐增大，槲皮素峰面积也呈现升高的趋势，但前期上升幅度较大，后期幅度较小，总体而言也较为平稳。

通过软件Design-Expert 8.0.6软件分析得新疆一枝蒿中黄酮槲皮素的最佳提取工艺条件是乙醇浓度为79.02％，提取时间为2.01h，料液比为19.33。在此条件下，槲皮素的峰面积的预测值为4.12942E+006。考虑实际情况，选取最佳提取工艺为乙醇浓度为79vol.％、提取时间为2h、料液比为19∶1(ml/g)，在此条件下，经实验验证一枝蒿中槲皮素的峰面积为4.03273E+006，实际值与理论值基本一致。

实施例2新疆一枝蒿有效部位的富集纯化工艺

本实施例应用溶剂法和大孔吸附树脂法对实施例1中新疆一枝蒿粗提取物的富集纯化工艺、影响因素和方法学进行了实验研究，初步建立新疆一枝蒿中总黄酮类有效部位的纯化工艺条件。采用紫外分光光度法，考察多种型号大孔吸附树脂对总黄酮的富集纯化能力及相关因素的影响，筛选出AB-8大孔吸附树脂纯化工艺条件及其影响因素，采用响应面方法优化经Design-Expert 8.0.5软件分析，基本条件为上样量＞洗脱剂体积＞洗脱剂浓度，平行实验验证初步实验结果所得平均总黄酮回收率为76.33％，优化得到的最佳工艺在实际实验中得到验证，为后续建立完整规范的富集纯化工艺提供基础。

2.1标准曲线的建立

以槲皮素为标准品建立标准曲线(如图4所示)，回归方程：Y＝76.364X+0.0247，相关系数r＝0.9986，线性范围为0.008mg/ml～0.032mg/ml，紫外分光光度法(λ＝374nm)。

2.2富集纯化工艺的初步建立及其响应面分析

优选AB-8树脂作为新疆一枝蒿总黄酮的吸附树脂。将粗提取物溶于水后，本实施例对上样量(A，ml)、洗脱液(乙醇)体积(B，ml)、洗脱液浓度(C，％)三个单因素进行考察(参见表4)，最终确定各因素的最优条件及次优条件，以总黄酮回收率为因变量，对响应面设计结果进行评价(参见表5)。

表4响应面试验因素及编码水平

其中，BV是树脂床体积，即树脂柱内装载树脂的体积。

表5响应面设计实验及结果

采用Design-Expert.8.0.5版对实验数据进行分析，经多项回归得到二次回归方程，如下：R1＝76.52+4.07A+0.67B+0.63C-0.70AB+I.17AC+0.010BC-14.16A2-1.67B2-0.77C2，对试验结果进行统计分析得到方差结果(参见表6和图5-7)。

表6响应面试验结果方差分析表

注：^**，P＜0.0001，差异极显著；*，0.0001＜P＜0.05，差异显著。

本实施例对新疆一枝蒿总黄酮富集工艺条件进行了验证，结合模型方程、响应面图象分析和Design-Expert软件分析，得到最优富集工艺为，A＝0.162，B＝0.168，C＝0.526，经3组平行实验，得到的总黄酮回收率平均值为76.33％，说明该工艺有效，可进行下一步工艺的确立、重复和放大研究。

实施例3 HPLC指纹图谱和含量测定研究结合的质量控制模式

本实施例的实验阶段所使用的新疆一枝蒿药材来源如表7所示。

表7新疆一枝蒿药材来源

以下是新疆一枝蒿指纹图谱的建立方法。

3.1液相色谱条件

色谱柱：Hydrosphere C18(250×4.6mm1.D.S-5μm.12nm)

流动相：(A)0.2％甲酸水溶液-(B)乙腈

梯度洗脱条件：0～10min 10％B～30％B(体积浓度，下同)；10～45min30％B～45％B；45～60min 45％B～95％B；60～75min 95％B～95％B

流速：0.8ml/min

柱温：30℃

进样量：20uL

检测波长：254nm

3.2色谱条件优化

采用3.1.1中的色谱条件，对色谱柱、流动相、波长、流速、和柱温5个条件分别进行了考察，最终确定色谱柱为Hydrosphere C18(250×4.6mm1.D.S-5μm.12nm)色谱柱，流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶液，波长为254nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃作为本发明指纹图的色谱柱条件。

3.3提取条件的优化

采用3.1.1中的色谱条件，对提取方法、提取溶剂、回流时间、回流次数5个条件采用正交设计法进行了考察，综合考虑安全及提取效率等问题，最终确定以回流提取法作为提取方法，乙醇为提取溶剂，体积浓度为75％，加热回流2h，提取两次合并滤液作为本发明指纹图谱的药材提取条件。

3.4对照品及供试品溶液的制备

3.4.1供试品溶液的配制

将新疆一枝蒿药材干燥后粉碎，取药材粉末15g，加300ml75vol.％甲醇加热回流提取2h，过滤，提取2次合并滤液。将得到的滤液置于旋转蒸发仪上挥干溶剂，得到样品浸膏。精密称取0.5g浸膏，溶解于甲醇并加入50ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，制得供试品溶液。

3.4.2对照品溶液的配制

准确称取0.1mg标准品，用甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得浓度为0.01mg·ml-1的标准溶液。

3.5指纹图谱方法学验证

对建立的指纹图谱色谱方法进行方法学考察，分别考察专属性、精密度、重复性和稳定性。实验结果表明，本发明建立的指纹图谱色谱方法专属性强，精密度高，重复性好，方法稳定，是合格的色谱方法。

3.6指纹图谱相似度评价

将上述各批新疆一枝蒿药材按照“3.4.1供试品溶液的配制”制备成供试品溶液，吸取20μL样品注入高效液相色谱仪，并按照“3.1液相色谱条件”中色谱条件进行分析，记录各批新疆一枝蒿的色谱图。将色谱数据(AIA格式)导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)，首先选定参比图谱及参比峰，设定匹配参数，采用中位数的方法进行相似度比对，获得新疆一枝蒿的对照指纹图谱见图8，并将各批新疆一枝蒿的谱图进行自动匹配，得到相似度计算结果见表8，各个样品的叠加色谱图见图9。

表8指纹图谱相似度结果

3.7新疆一枝蒿指纹图谱中主要峰的指认

通过与标准品的比对，最终确定了5个主要色谱峰，分别为：t_R为27.114的槲皮素、t_R为27.586的木犀草素、t_R为34.085的一枝蒿酮酸、t_R为51.022的紫花牡荆素与t_R为51.942的洋艾素。

3.8标准曲线法测定S11、S12、S18批次新疆一枝蒿中木犀草素的含量

3.8.1对照品溶液的制备

见“3.4对照品及供试品溶液的制备”中对照品溶液制备部分。

3.8.2供试品溶液的制备

见“3.4对照品及供试品溶液的制备”中供试品溶液制备部分。

3.8.3色谱条件

色谱柱：Hydrosphere C18(250×4.6mml.D.S-5μm.12nm)

流动相：(A)0.2％甲酸水溶液-(B)乙腈

梯度洗脱条件：0～15min 45％～70％B；15～30min 70％B；30～40min 70％～45％B

流速：0.8ml/min

柱温：30℃

进样量：20μL

检测波长：254nm

3.8.4线性关系的考察

按上述实验条件梯度进样，绘制标准曲线，得标准曲线方程为：y＝54089000x-53504，R²＝0.9931，结果表明，在0.01～0.05mg·ml^-1范围内，木犀草素峰面积与进样量具有良好的线性关系。标准曲线如图10所示。

3.8.5方法学考察

对建立的标准曲线色谱方法进行方法学考察，分别考察精密度、重复性、稳定性和加样回收率。实验结果表明，本发明建立的标准曲线色谱方法精密度高，重复性好，方法稳定，是合格的色谱方法。

3.8.6待测液中木犀草素含量的测定

S11、S12、S18三个产地的新疆一枝蒿中木犀草素含量测定结果见表9。其含量分别为新疆0.04691mg·ml^-1，RSD＝0.15％；安徽0.03479mg·ml^-1，RSD＝0.19％；东北0.02734mg·ml^-1，RSD＝0.58％。

表9木犀草素含量测定

实验结果显示，本发明建立的结合HPLC指纹图谱和含量测定的模式可以对不同批次的新疆一枝蒿药材进行质量控制。

实施例4新疆一枝蒿的有效成分分离

如图11所示，在实施例中，新疆一枝蒿的有效成分分离方法包括：

(1)干燥植物全草用体积浓度为79％的乙醇，料液比为19.33，加热回流提取2小时，同样的方法提取2次，合并提取液，回收溶剂乙醇，得到新疆一枝蒿的乙醇提取物，浓缩至大约1.2kg，得到新疆一枝蒿粗提取物或新疆一枝蒿总提取物浸膏；

(2)新疆一枝蒿粗提取物加水悬浮，加石油醚萃取，得到石油醚萃取液和水层A，石油醚萃取液回收溶剂后得到石油醚萃取物TP(126/1200g)，水层A加入乙酸乙酯(约1∶1)体积萃取至少1次，得到乙酸乙酯萃取液和水层B，乙酸乙酯萃取液回收溶剂后得到乙酸乙酯萃取物TE(230/1200g)，水层B加入正丁醇(约1∶1)体积萃取至少1次，得到正丁醇萃取液和水层C，正丁醇萃取液回收溶剂后得到正丁醇萃取物TN(90/1200g)，水层C加入氯仿(约1∶1)体积萃取至少1次，得到氯仿萃取液和水层，氯仿萃取液回收溶剂后得到氯仿萃取物TC(145/1200g)。其中乙酸乙酯萃取物TE即为本发明的新疆一枝蒿提取物。

(3)将得到的乙酸乙酯萃取物(TE)采用Si-gel(硅胶柱色谱)(色谱溶剂系统为Pet.-EtOAc 5∶2、7∶3、2∶1、6∶4、7∶5、1∶1、5∶6、5∶7、5∶8；EtOAc-MeOH 100∶1；CHCl3-MeOH 70∶1～10∶1)和Sephadex LH-20、MCI20P(凝胶柱色谱)得到Fr.I～Fr.VII，将Fr.II(色谱溶剂系统为CHCl3-MeOH 70：1～10：1)、Fr.III(色谱溶剂系统为CHCl3-MeOH 60：1～10：1)、Fr.IV(色谱溶剂系统为CHCl3-MeOH 30∶1～10∶1)、Fr.V(色谱溶剂系统为CHCl3-MeOH 30∶1～10∶1)继续纯化，采用Si-gel(硅胶柱色谱)和Sephadex LH-20、MCI20P(凝胶柱色谱)的方法进行进一步的分离精制，将分离得到的单体化合物经物理常数测定，应用UV、MS、1H-NMR和13C-NMR等现代波谱方法和技术对其结构进行鉴定，分离得到的7个化合物的结构分别为：木犀草素(Luteolin，ARE231)、槲皮素(Quercetin，ARE341)、紫花牡荆素(Casticin，ARE411)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin 7-O-D-glucoside，ARE521)、一枝蒿酮酸(Rupestonic acid，ARE522)、β-谷甾醇(β-Sitosterol，ARE221)、胡萝卜苷(Daucosterol，ARE431)，如表10所示。

表10化合物列表与结构

实施例5新疆一枝蒿的药学功能和活性评价

本发明还对新疆一枝蒿多个组分部位和分离得到的单体化合物分别进行了体外抗氧化活性(体外DPPH法)筛选实验和体外抗病毒活性(MDCK细胞/流感病毒)筛选实验，明确新疆一枝蒿的有效部位。

5.1DPPH法体外抗氧化活性筛选实验结果

DPPH试液浓度为1mg溶于20mL溶剂(95％乙醇)中，λ 519nm处测A值(1.2-1.3之间最佳)。供试品组分和单体化合物溶剂用(MeOH和DMSO)。

清除率(抑制率)的计算公式：

试验结果如表11和12所示。

表11 VC标准品DPPH清除率

表12组分和单体化合物DPPH清除率

5.2体外抗病毒活性(MDCK细胞/流感病毒)筛选实验结果

采用体外MDCK细胞培养流感病毒活性筛选实验，首先考察新疆一枝蒿提取物和单体化合物对MDCK细胞的细胞毒作用，再进行抗流感病毒活性筛选，实验结果如表13和14所示。

表13样品对MDCK细胞的细胞毒性检测结果

表14体外抗流感病毒实验结果

结论：3#、4#和样品在100μg/ml浓度下能有效抑制流感细胞病变效应CPE的产生，3#和4#样品分别为新疆一枝蒿的氯仿提取物部位和乙酸乙酯提取物部位。10#样品在200μg/ml浓度下能抑制流感CPE的产生。

实验结果表明，本发明所提供的新疆一枝蒿提取物有效部位及单体化合物中，氯仿和乙酸乙酯部位和单体化合物一枝蒿酮酸具有明显的抗病毒活性。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新疆一枝蒿提取物的制备方法，包括：

(1)将新疆一枝蒿药材用乙醇加热回流提取，收集提取液并回收溶剂后得到新疆一枝蒿粗提取物；

(2)将所述新疆一枝蒿粗提取物加水悬浮，依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿萃取，分别收集石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和氯仿萃取液，回收溶剂后石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物，其中乙酸乙酯萃取物即为所述新疆一枝蒿提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述乙醇的体积浓度为75-85％，优选为79％，加热回流提取时间为1.5-2.5h，优选为2h，乙醇与新疆一枝蒿药材的比例为15-25ml乙醇/g药材，优选为19ml乙醇/g药材，加热回流提取至少为两次。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿与水层的体积比为1∶1，优选地，所述乙酸乙酯萃取物通过色谱分离得到单体化合物，优选地，所述色谱包括硅胶柱色谱和凝胶柱色谱。

4.一种利用所述权利要求1-3中任一项所述制备方法制备的新疆一枝蒿提取物。

5.根据权利要求4所述的新疆一枝蒿提取物，其特征在于：所述新疆一枝蒿提取物包括黄酮类化合物、倍半萜酮酸类化合物和甾醇类化合物，进一步地，所述黄酮类化合物包括紫花牡荆素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素，所述倍半萜酮酸类化合物包括一枝蒿酮酸，所述甾醇类化合物包括胡萝卜苷和β-谷甾醇。

6.一种利用权利要求4或5所述新疆一枝蒿提取物制备的抗氧化剂或抗病毒剂。

7.权利要求4或5所述新疆一枝蒿提取物在制备抗氧化剂或抗病毒剂中的用途。

8.一种新疆一枝蒿HPLC指纹图谱的建立方法，包括：

(1)将不同批次的新疆一枝蒿道地药材粉碎，将药材粉末加入甲醇加热回流提取，将得到的滤液挥干溶剂，得到样品浸膏，将样品浸膏溶解于甲醇制得供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪，获得不同批次的新疆一枝蒿标准指纹图谱；

(3)通过标准品比对的方法，确定新疆一枝蒿指纹图谱的主要色谱峰，包括t_R为27.114的槲皮素、t_R为27.586的木犀草素、t_R为34.085的一枝蒿酮酸、t_R为51.022的紫花牡荆素与t_R为51.942的洋艾素。

9.根据权利要求8所述的建立方法，其特征在于：步骤(1)中甲醇的体积浓度为55-95％，优选75％，甲醇与药材粉末的比例为15-25ml甲醇/g药材粉末，加热回流提取时间为1.5-2.5h，优选2h，加热回流提取2次；优选地，步骤(2)中的色谱条件为：色谱柱为Hydrosphere C18，流动相为(A)0.2％甲酸水溶液-(B)乙腈，波长为254nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃，进样量为20μL，优选地，梯度洗脱条件为0～10min 10％B～30％B；10～45min 30％B～45％B；45～60min 45％B～95％B；60～75min 95％B～95％B。

10.一种利用权利要求8所述方法构建的指纹图谱在新疆一枝蒿质量控制中的应用，优选地，所述应用还包括利用通过高效液相色谱法建立的标准曲线测定不同批次新疆一枝蒿中木犀草素的含量，优选地，木犀草素的梯度洗脱条件为(A)0.2％甲酸水溶液-(B)乙腈，0～15min 45％～70％B；15～30min 70％B；30～40min 70％～45％B。