CN106645489B - 采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法 - Google Patents

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Abstract

采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，其特征在于，采用廉价易得的原儿茶酸作为内参物进行一测多评，建立原儿茶酸与大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素之间的相对校正因子，通过校正因子计算大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量，采用液相色谱法进行测定。本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本，可以有效检测出大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素四种成分的含量。

Description

采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法
技术领域
本发明涉及一种质量检测方法，具体涉及一种采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法。
背景技术
大叶金花草出自《广西中药志》。
大叶金花草多年生草本，高可达65厘米。根茎坚硬而短，横走，密被赤褐色钻状鳞片。叶近生，叶柄长达25厘米，禾秆色，光亮，直立；叶近革质，无毛；3～4回羽状分裂，披针形，长20～40厘米，宽5～12厘米；下部羽片卵状技针形，斜展，长5～10厘米，宽2～5厘米；小羽片矩圆形或披针形；末回裂片楔形，先端截形，有牙齿，基部楔形，下延，叶脉下面明显，2叉状分枝。孢子囊群顶生，每裂片上1～2枚，囊群盖灰棕色，半杯形，宽与叶缘等长，向外开裂。
拉丁植物动物矿物名：Sphenomeris chinensis(L.)Maxon[Adiantum chusanumL.;Stenoloma chusana(L.)Ching]。
拉丁文名：Herba Stenolomae。
功效分类：清热解毒药；利湿药。
科属分类：鳞始蕨科。
别名：野黄连、水黄连、牙齿芒、擎天蕨、雪仙草、扫雪花、蜢蚱参、上树细辛草、青蕨、金花草、大金花草、乌韭、石发、地柏枝、雉鸡尾、小鸡尾草、细叶狼箕、花叶凤尾草、乌竹、墙柏、细叶凤凰尾、土黄连、孔雀尾、万能解毒草、苦黄连。
性味：微苦；寒；无毒。
归经：肝经；肺经；大肠经。
功能：清热解毒；利湿止血。
主治：感冒发热；咳嗽；咽喉肿痛；肠炎；痢疾；肝炎；湿热带下；痈疮肿毒；痄腮；口疮；烫火伤；毒蛇、狂犬咬伤；皮肤湿疹；吐血；尿血；便血；外伤出血。
用法用量：内服：煎汤，15-30g；或绞汁。外用：适量，捣敷；或研末外敷；或煎汤洗。
生态环境：生于海拔200-1900m的林下、路边或空旷处。
药材基源：为鳞始蕨科植物乌蕨的全草或根茎。
采收储藏：夏、秋季挖取带根茎的全草，去杂质，洗净，鲜用或晒干。
大叶金花草广泛的分布于西南及江苏、安徽、浙江、江西、福建 、台湾、湖北、湖南、广东、广西、西藏、陕西、四川等地，具有清热解毒、利湿、止血的功效、主治感冒发热、咳嗽、咽喉肿痛、肠炎、痢疾 、肝炎、湿热带下、痈疮肿毒、痄腮 、口疮、烫火伤、毒伤、狂犬咬伤、皮肤湿疹 、吐血、尿血、便血 、外伤出血，具有广谱的的抗菌活性和解毒作用。民间用于治疗胃癌、肠癌 、食物中毒和农药中毒，有“万能解毒药”之称。其化学成分主要有有机酸类和黄酮类。牡荆素又名牡荆苷，为大叶金花草的有效成分之一，具有防癌抗肿瘤、抗炎、解痉、降压等作用。
由于植物化学成分的复杂性，多指标含量测定已经成为植物来源药物质量控制的共识。目前，越来越多的国内外植物药标准将多指标含量测定收录其中。然而，在多指标含量测定方法实施的过程中，对照品消耗量大，检测操作难度高，严重制约了该方法的推广应用。
为解决以上问题，人们积极寻找替代性方法。研究人员发现，不同物质在紫外检测器中的响应-浓度比的比值是一个常数，并将该常数定义为相对校正因子。在样品检测过程中，使用外标法测定 A 化合物的峰面积并获得其含量，同时测定 B 化合物的峰面积，便可以根据以上信息和 A/B 物质间相对校正因子，计算获得 B 化合物的含量。该替代对照品法被命名为一测多评法。
由于大大减少了对照品的用量，并降低了检测试验的操作难度，一测多评质量控制方法得到迅速的推广和应用。目前，美国药典约有 20 余个品种，欧洲药典约有 10 余个品种，中国药典有1个品种(黄连)，使用该方法对植物来源药物进行多指标含量测定，且数目仍在不断增加。
原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素是大叶金花草中的主要成分，目前还没有文献公开将一测多评方法用于其中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种高实用性、操作简单、节约成本的针对大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素四种成分的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，采用廉价易得的原儿茶酸作为内参物进行一测多评，建立原儿茶酸与大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素之间的相对校正因子，通过校正因子计算大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量，采用液相色谱法进行测定，具体方法如下：
（1）材料准备：供试品的大叶金花草全采自广西，经广西中医药大学药用植物园鉴定为陵齿蕨科植物乌蕨Stenoloma chusanaum Ching的全草；将供试品磨成粉末，过2号筛备用；
（2）对照品溶液的制备：
原儿茶醛：精密称取，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0498mg/ml的对照溶液；
原儿茶酸：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0538mg/ml的对照溶液；
牡荆素：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0573mg/ml的对照溶液；
荭草苷：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0503mg/ml的对照溶液；
取上述对照品各1mL混合摇匀，作为混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：
称取供试品粉末0.3g，置于50ml锥形瓶中，加入65%乙醇30ml超声30min，滤过，挥干溶剂得残留物，残留物用10%乙腈定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml～5ml容量瓶中，再用10%乙腈稀释至刻度线即得供试品溶液；
（4）色谱条件及系统适用性试验：
色谱柱：Diamonsil C18；
流动相：B泵：乙腈；D泵：0.4%磷酸；
梯度洗脱程序：
0～10min，B泵：10%→15%，D泵:90%→85%；
10～40min，B泵：15%→20%，D泵:85%→80%；
40～45min，B泵：20%→25%，D泵:80%→75%；
45～55min，B泵：25%→30%，D泵:75%→70%；
55～70min，B泵：30%→30%，D泵:70%→70%；
检测波长：210nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
理论塔板数按原儿茶酸计算不低于15000；
（5）测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL，注入液相色谱仪，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的峰值，通过与原儿茶酸的相对校正因子计算原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量。
所述液相色谱仪为PE200系列高效液相色谱仪，选择耐受压力为0-6200psi或0-42MPa。
取步骤（2）混合对照品溶液，分别进样3、6、10、12、15µL测定，以原儿茶酸为内标，分别计算原儿茶醛、荭草苷、牡荆素的相对校正因子fR, ，采用Diamonsil C18色谱柱分别考察Agilent 1260、Waters2695-2998液相色谱系统对fR的影响，上述四个成分的相对标准偏差RSD＜3%，从中确定原儿茶醛、荭草苷、牡荆素的相对校正因子fR为各实验所得数据的平均值，分别是0.82、0.55、0.60。
本发明的有益效果为：
1、本发明选用原儿茶酸作为内参物进行QAMS（一测多评法），原儿茶酸价廉容易得到，从而可以节省时间成本、劳动成本，而且方法快速、准确，能更全面的知晓大叶金花草质量；
2、针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本，可以有效检测出大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素四种成分的含量；
3、通过比较一测多评法和外标法的结果差异，利用Spss20.0软件对Pearson相关系数进行比较，两种方法所得含量结果相近，计算两种方法的相对误差，结果绝对值＜0.3%，说明一测多评所得的含量计算结果与外标法所得结果相似，在不同的实验条件下，各成分之间的校正因子重现性好（RSD＜3%），能够有效进行大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素四种成分的含量测定；
4、在对照缺乏的情况下，本发明的方法可以应用于大叶金花草的质量评价，同时测定金花草中4个化合物的方法简便、快捷，为建立金花草药材的质量评价提供依据；
5、构建了大叶金花草的一测多评检测方法，由此可以更好更全面的控制大叶金花草的质量，同时规避由多成含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性，耐用性好。
附图说明
图1为采用水回流提取(乙酸乙酯萃取)对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图2为采用水超声提取(乙酸乙酯萃取)对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图3为采用65%乙醇超声提取(乙酸乙酯萃取)对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图4为采用65%乙醇超声提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图5为采用乙酸乙酯超声提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图6为采用水冷浸法提取对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图7为采用40%乙醇超声提取(乙酸乙酯萃取)对供试品进行HPLC分析得到的指纹图谱；
图8为原儿茶酸线性关系考察图；
图9为原儿茶醛线性关系考察图；
图10为荭草苷线性关系考察图；
图11为牡荆素线性关系考察图；
图12采用一测多评法与外标法测定结果比较金花草中四种物质含量测定结果（n=3）图。
具体实施方式
采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，采用廉价易得的原儿茶酸作为内参物进行一测多评，建立原儿茶酸与大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素之间的相对校正因子，通过校正因子计算大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量，采用液相色谱法进行测定，具体方法如下：
（1）材料准备：供试品的大叶金花草全采自广西，经广西中医药大学药用植物园鉴定为陵齿蕨科植物乌蕨Stenoloma chusanaum Ching的全草；将供试品磨成粉末，过2号筛备用；
（2）对照品溶液的制备：
原儿茶醛：精密称取，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0498mg/ml的对照溶液；
原儿茶酸：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0538mg/ml的对照溶液；
牡荆素：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0573mg/ml的对照溶液；
荭草苷：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0503mg/ml的对照溶液；
取上述对照品各1mL混合摇匀，作为混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：
称取供试品粉末0.3g，置于50ml锥形瓶中，加入65%乙醇30ml超声30min，滤过，挥干溶剂得残留物，残留物用10%乙腈定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml～5ml容量瓶中，再用10%乙腈稀释至刻度线即得供试品溶液；
（4）色谱条件及系统适用性试验：用Diamonsil C18色谱柱；乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相按以下梯度运行条件洗脱，流速：1.0mL/min，柱温：25℃，检测波长：210nm；理论塔板数按原儿茶酸计算不低于15000，流动相条件见表1：
表1 大叶金花草高效液相流动相条件
时间 （min） 乙腈/% 0.4%磷酸（%）
0～10 10→15 90→85
10～40 15→20 85→70
40～45 20→25 70→75
45～55 25→30 75→70
55～70 30→30 70→70
（5）测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL，注入液相色谱仪，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的峰值，通过与原儿茶酸的相对校正因子计算原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量。
提取方法和提取溶剂的确定
由于荭草苷和牡荆素属于黄酮苷类，具有一定的水溶性，可溶于热水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等；原儿茶酸溶于水、乙醇、乙醚；原儿茶醛易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、热水和冷水，不溶于苯和氯仿等溶剂，故可以用于提取以上物质的溶剂有：水、乙醇、乙酸乙酯。常用的溶剂提取方法有：煎煮、回流、超声、冷浸等。本实验对提取方法进行了如下比较：取04号大叶金花草药材粉末0.3g(共7份)，分别采用水回流提取，乙酸乙酯萃取；水超声提取，乙酸乙酯萃取；65%乙醇超声提取，乙酸乙酯萃取；65%乙醇超声提取；乙酸乙酯超声提取；水冷浸法提取；40%乙醇超声提取，乙酸乙酯萃取(均为20ml溶剂，超声和回流均为30min，冷浸为3h，萃取均为40ml乙酸乙酯，萃取两次，每次20ml)。超声功率为200W，频率40kHz。过滤，将溶液浓缩至干，10%乙腈溶解，定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml至5ml容量瓶中，再用10%乙腈稀释至刻度线。进高效液相仪检测前，先用相应滤头滤过，进行HPLC分析，：用Diamonsil C18色谱柱；乙腈-磷酸盐缓冲液为流动相按以下梯度运行条件洗脱，流速：1.0mL/min，柱温：25℃，检测波长：210nm；理论塔板数按原儿茶酸计算不低于15000，流动相条件见表1。结果如下（图1-7）。
结果表明：方法牡荆素没有出峰，方法基线不平，峰形不好，对照物质没有完全出峰，方法、牡荆素峰太小，易受噪音干扰，方法、、对照物质皆出峰，基线较好，通过比较四种对照物质的峰面积，方法65%乙醇超声提取的方法四种对照物质峰面积皆大于其它方法，基线平稳，故选择该法对药材进行提取。
表2 方法、、号4种物质面积
最佳吸收波长的确定
四种对照物质的扫描光谱显示，在210nm附近皆有最大吸收,因此，检测波长定为210nm。
比较了0.5%、0.4%和0.3%的磷酸，三种浓度下四个对照品峰的分离度和对称因子，综合考虑两因素，以及高浓度磷酸溶液对色谱柱的伤害，最后选择0.4%的磷酸溶液为流动相，如表3。
表3 不同磷酸浓度分离效果
柱温考察
比较了35℃、25℃和15℃三个柱温下四个对照品峰的分离度和对称因子，综合考虑两因素，最后选择25℃未检测温度，如表4。
表4 不同柱温下分离情况
原儿茶酸线性关系考察
取浓度为0.2150mg/mL的原儿茶酸对照，用50％乙醇分别稀释成0.0215 mg/mL、0.0043 mg/mL、0.0022mg/mL和0.0011 mg/mL的不同浓度原儿茶酸标准溶液，分别取10µL进样分析。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。结果显示原儿茶酸标准曲线方程为Y=72003X+61.485，r2=0.9994，由此说明在0.0011mg/mL～0.2150 mg/mL范围内线性关系良好，见图8。
2.4.1.2 原儿茶醛线性关系考察
取浓度为0.1993mg/mL的原儿茶醛对照，用50％乙醇分别稀释成0.0199 mg/mL、0.0040 mg/mL、0.0020 mg/mL和0.0010 mg/mL的不同浓度原儿茶醛标准溶液，分别取10µL进样分析。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。结果显示原儿茶醛标准曲线方程为Y=56924X+27.845，r2=0.9996，由此说明在0.0010mg/mL～0.1993 mg/mL范围内线性关系良好，见图9。
2.4.1.3 荭草苷线性关系考察
取浓度为0.2290mg/mL的荭草苷对照，用50％乙醇分别稀释成0.0229 mg/mL、0.0046 mg/mL、0.0023 mg/mL和0.0011 mg/mL的不同浓度荭草苷标准溶液，分别取10µL进样分析。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。结果显示荭草苷标准曲线方程为Y=44958X-19.379，r2=1，由此说明在0.0011mg/mL～0.2290mg/mL范围内线性关系良好，见图10。
2.4.1.4 牡荆素线性关系考察
取浓度为0.2013mg/mL的原儿茶醛对照，用50％乙醇分别稀释成0.0201mg/mL、0.0040 mg/mL、0.0020 mg/mL和0.0010 mg/mL的不同浓度牡荆素标准溶液，分别取10µL进样分析。以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。结果显示牡荆素标准曲线方程为Y=54075X+2.343，r2=1，由此说明在0.0010mg/mL～0.2013mg/mL范围内线性关系良好，见图11。
稳定性试验
取04号样品的供试品溶液，于制备后0h、3h、6h、9h和12h分别进样10µL，分别测定原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的峰面积，计算原儿茶酸RSD=0.99%、原儿茶醛RSD=1.59%、荭草苷RSD=1.61%、牡荆素RSD=1.17%，表明样品在12h以内稳定。
专属性
样品在相应对照品的保留时间附近出峰，且分离度和对称因子符合含量测定相关要求；空白进样检测表明溶剂对四种物质检测没有影响；延长冲洗至100min，在70min后没有峰出现。
加样回收率试验
精密称取已知含量的04号粉末（过20目，原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷、牡荆素含量分别为1.07mg/g、0.31 mg/g、0.59 mg/g、0.97 mg/g）0.3g共6份，分别置50ml锥形瓶中，精密加入浓度为0.2150mg/ml的原儿茶酸对照品溶液2ml、浓度为0.1993mg/ml的原儿茶醛对照品0.5ml、浓度为0.2290mg/ml的荭草苷对照品1ml以及浓度为0.2013mg/ml的牡荆素对照品溶液0.5ml，按“2.1.2”项下方法制备所需溶液，按“2.2”项色谱条件，分别进样10µL，测定样品中四种物质的含量，计算平均加样回收率（n=6）和RSD，结果见表5-。
表5 加样回收率试验数据表（原儿茶酸）
表6 加样回收率试验数据表（原儿茶醛）
表7 加样回收率试验数据表（荭草苷）
表8 加样回收率试验数据表（牡荆素）
待测组分fR的计算
取混合对照品溶液，分别进样3、6、10、12、15µL测定，以原儿茶酸为内标，分别计算原儿茶醛、荭草苷、牡荆素的fR，结果见表9。
表9 四种成分的fR（n=3）
fR的重现性考察
采用Agilent 1260分别考察3种不同色谱柱（Phenomenex Gemini 5µm C18、依利特SinoChrom OBS-BP 5µm和Agilent TC-C18）对校正因子重现性进行考察；采用DiamonsilC18色谱柱分别考察了Agilent 1260、Waters2695-2998液相色谱系统对fR的影响，结果4个成分的校正因子重现性良好（RSD＜3%）。结果见表10。
表10 fR重现性考察（n=3）
fR的确定
依据《一测多评法建立的技术指南》和上述实验结果，最终确定原儿茶醛、荭草苷、牡荆素的fR为各实验所得数据的平均值，分别是0.82、0.55、0.60。
待测成分色谱峰的定位
计算上述不同色谱仪器和不同色谱柱中各待测成分与原儿茶酸的相对保留时间，对其余3个待测成分进行定位。计算结果表明相对保留时间的波动较小(RSD＜1%)，结果见表11。
表11 各成分的相对保留时间（n=3）
一测多评法与外标法测定结果比较
对25批广西产金花草按照前述方法制备供试品溶液，每个产地样品制备三份，按前述色谱条件进行测定，以一测多评法和外标法计算样品的含量（参见图12）。结果显示广西各地产金花草药材全草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的范围分别为0.43～1.50 mg/g、0.20～0.68 mg/g、0.37～0.92 mg/g和0.12～0.97 mg/g；叶中四个化合物含量范围分别为0.31～1.15 mg/g、0.17～0.52 mg/g、0.27～0.97 mg/g和0.18～0.54 mg/g；金花草药材根及根茎中四个化合物含量范围分别为0.17～0.59 mg/g、0.04～0.14 mg/g、0.28～0.67 mg/g和0.08～0.10 mg/g；此结果显示地下部分四种物质含量范围低于地上部分。
结论
原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素是大叶金花草中的主要成分，有研究分别指出了其的药理作用，因此选择它们作为大叶金花草药材质量评价的指标成分。本实验选用原儿茶酸作为内参物进行QAMS（一测多评法）是由于原儿茶酸作为水（醇）提物，是大叶金花草中主要的有效成分，在大叶金花草中含量较高，且该对照品价廉容易得到。
为比较一测多评法和外标法的结果差异，利用Spss20.0软件对Pearson相关系数进行比较，原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的相关系数分别为0.997、0.998和0.999，可见两种方法所得含量结果相近，计算两种方法的相对误差，结果绝对值＜0.3%，说明一测多评所得的含量计算结果与外标法所得结果相似，在不同的实验条件下，各成分之间的校正因子重现性好（RSD＜3%），说明在对照缺乏的情况下，一测多评法可以应用于大叶金花草的质量评价，同时测定金花草中4个化合物的方法简便、快捷，本实验结果为建立金花草药材的质量评价提供依据。
对于不同采收时间：比较第08号和09号样品，对于同一个产地的大叶金花草，冬季采收四种成分含量是春季的约2倍见表12。
对于不同用药部位：对于同一批药材，比较10号和11号，12号和13号，14号和15号，对原儿茶醛和牡荆素根及根茎的含量更高，而原儿茶酸和荭草苷地上部分含量高于根及根茎，见表13。
表12 大叶金花草不同采收时间含量测定结果
表13 大叶金花草不同部位含量测定结果

Claims (3)

1.采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，其特征在于，采用原儿茶酸作为内参物进行一测多评，建立原儿茶酸与大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素之间的相对校正因子，通过校正因子计算大叶金花草中原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量，采用液相色谱法进行测定，具体方法如下：
（1）材料准备：供试品的大叶金花草全采自广西，经广西中医药大学药用植物园鉴定为陵齿蕨科植物乌蕨Stenoloma chusanaum Ching的全草；将供试品磨成粉末，过2号筛备用；
（2）对照品溶液的制备：
原儿茶醛：精密称取，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0498mg/ml的对照溶液；
原儿茶酸：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0538mg/ml的对照溶液；
牡荆素：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0573mg/ml的对照溶液；
荭草苷：五氧化二磷减压干燥24h，精密称定，用50%乙醇溶解，制成浓度为0.0503mg/ml的对照溶液；
取上述对照品各1mL混合摇匀，作为混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：
称取供试品粉末0.3g，置于50ml锥形瓶中，加入65%乙醇30ml超声30min，滤过，挥干溶剂得残留物，残留物用10%乙腈定容至5ml容量瓶中，用移液管从容量瓶中移取1ml～5ml容量瓶中，再用10%乙腈稀释至刻度线即得供试品溶液；
（4）色谱条件及系统适用性试验：
色谱柱：Diamonsil C18；
流动相：B泵：乙腈；D泵：0.4%磷酸；
梯度洗脱程序：
0～10min，B泵：10%→15%，D泵:90%→85%；
10～40min，B泵：15%→20%，D泵:85%→80%；
40～45min，B泵：20%→25%，D泵:80%→75%；
45～55min，B泵：25%→30%，D泵:75%→70%；
55～70min，B泵：30%→30%，D泵:70%→70%；
检测波长：210nm；
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
理论塔板数按原儿茶酸计算不低于15000；
（5）测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10µL，注入液相色谱仪，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的峰值，通过与原儿茶酸的相对校正因子计算原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素的含量。
2.根据权利要求1所述采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，其特征在于，所述液相色谱仪为PE200系列高效液相色谱仪，选择耐受压力为0-6200psi或0-42MPa。
3.根据权利要求1所述采用一测多评法测定大叶金花草成分的方法，其特征在于，取步骤（2）混合对照品溶液，分别进样3、6、10、12、15µL测定，以原儿茶酸为内标，分别计算原儿茶醛、荭草苷、牡荆素的相对校正因子fR，采用Diamonsil C18色谱柱分别考察Agilent1260、Waters2695-2998液相色谱系统对fR的影响，原儿茶酸、原儿茶醛、荭草苷和牡荆素四个成分的相对标准偏差RSD＜3%，从中确定原儿茶醛、荭草苷、牡荆素的相对校正因子fR为各实验所得数据的平均值，分别是0.82、0.55、0.60。
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