CN101851261B - 杠板归药材及其制剂中有效成分的对照品制法及含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杠板归药材及其制剂中有效成分的对照品制备方法及含量测定方法，含量测定方法是采用高效液相色谱法，在同样色谱条件下对杠板归药材及其制剂中所含的槲皮素-3-O- β-D-葡萄糖醛酸等成分进行含量测定。与现有技术相比，本发明通过建立杠板归药材及其制剂中槲皮素-3-O- β-D-葡萄糖醛酸等成分的含量测定方法，完善了杠板归药材及其制剂的质量检测标准，弥补了现有质量控制技术的不足，使杠板归药材及其制剂的质量控制技术更为科学、合理；本发明所述含量测定方法的精密度高，重现性好，稳定性好，回收率高，测量结果准确，可有效控制杠板归药材及其制剂的质量，从而确保其临床应用的安全性和有效性。

Description

杠板归药材及其制剂中有效成分的对照品制法及含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种杠板归药材及其制剂中有效成分的对照品制备方法及含量测定方法，属于对药材及其制剂进行质量控制的技术领域。

背景技术

我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量标准和科学的检测手段，难以有效地控制其内在质量，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。加强中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。

杠板归为蓼科蓼属植物杠板归Polygonum perfoliatum Linn.的干燥全草；生于山谷、灌木丛中或水沟旁；主产于贵州、江苏、浙江、福建、江西、广东、广西、四川、湖南。夏季开花时采割，晒干。别名：河白草、蛇倒退、梨头刺、蛇不过等。杠板归为常用中药材，也是常用苗药；其味酸、苦，性平；有清热解毒、利湿消肿、散瘀止血之功效，常用于治疗疔疮痈肿、丹毒、瘫腮、乳腺炎、聤耳、喉蛾、感冒发热、肺热咳嗽、百日咳、瘰疬、痔疾、鱼口便毒、泻痢、黄疸、臌胀、水肿、淋浊、带下、疟疾、风火赤眼、跌打肿痛、吐血、便血、蛇虫咬伤。众所周知，杠板归药材成分复杂，主要包括以下几类：生物碱、苦味素、苯并色原酮类、萜类、黄酮、香豆精、木脂素、甾类化合物、挥发油和有机酸类。研究表明，杠板归的多种化学成分有各种具体的药理作用。但其质量控制方法文献报道很少，仅在《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版中以咖啡酸为对照进行了薄层色谱鉴别研究。《中国药典》2010年版収载了杠板归药材，该标准中通过测定槲皮素的含量来进行杠板归药材质量控制，但是槲皮素的专属性不强，很多植物药材中均含有槲皮素，因此，为了使杠板归的临床应用更加安全、有效、科学、合理，必须加强其质量控制，制定更合理的质量控制方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种杠板归药材及其制剂中有效成分的对照品制备方法及含量测定方法。本发明通过对杠板归中具有生物活性的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等成分的含量进行定量研究，完善了杠板归药材及其制剂的质量检测标准，弥补了现有质量控制技术的不足，使杠板归药材及其制剂的质量检测方法更为科学、合理。

本发明是这样实现的：杠板归药材中有效成分的对照品制备方法：将杠板归药材干燥、粉碎，用75%乙醇回流提取2～3次，蒸去溶剂得浸膏，浸膏用水分散，然后用乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯部分反复进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇=30:1部分提取液浓缩得对香豆酸甲酯对照品；氯仿-甲醇=20:1部分提取液浓缩得5-羟甲基糠醛对照品；正丁醇部分反复进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇=10:1部分提取液浓缩、先后得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品；氯仿-甲醇=5:1部分提取液浓缩得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品；氯仿-甲醇=2:1部分提取液浓缩得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品。

杠板归药材及其制剂中有效成分的含量测定方法为：采用高效液相色谱法，在同样色谱条件下对杠板归药材及其制剂中所含的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和山奈酚和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯和/或芦丁和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和/或阿魏酸甲酯和/或七叶内酯和/或对香豆酸甲酯和/或5-羟甲基糠醛进行含量测定。

所述含量测定方法是以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和山奈酚对照品和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品和/或芦丁对照品和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品和/或阿魏酸甲酯对照品和/或七叶内酯对照品和/或对香豆酸甲酯对照品和/或5-羟甲基糠醛对照品为对照，以乙腈或甲醇∶质量浓度0.001%～5%的甲酸、乙酸或磷酸水溶液=10～50∶90～50为流动相的高效液相色谱法。（其中山奈酚对照品、芦丁对照品、阿魏酸甲酯对照品和七叶内酯对照品可从市场上购买，也可以按照现有技术自行制备；其余对照品均为申请人按前述对照品制备方法自行制备。）

具体的含量测定方法为：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇∶质量浓度0.001%～5%的甲酸、乙酸或磷酸水溶液=10～50∶90～50为流动相；柱温为20～35℃；检测波长为240～270nm或340～390nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和山奈酚对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、芦丁对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品、阿魏酸甲酯对照品、七叶内酯对照品、对香豆酸甲酯对照品、5-羟甲基糠醛对照品中的至少一种，加甲醇制成每1mL含0.01～2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材或其制剂粉末0.1～1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶或三角瓶中，精密加入30～90%乙醇溶液20～50mL，称定重量，回流提取1～3次，每次0.5～2小时，滤过，取滤液挥干，残渣加甲醇溶解，定容至5～50mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的含量测定方法为：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈∶质量浓度0.2%的乙酸水溶液=10～50∶90～50为流动相梯度洗脱；流速1.0mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为254nm、340nm、370nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和山奈酚对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、芦丁对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品、阿魏酸甲酯对照品、七叶内酯对照品、对香豆酸甲酯对照品、5-羟甲基糠醛对照品中的至少一种，加甲醇制成每1mL含0.01～2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材粉末或其制剂1.0g，精密称定，置100mL三角瓶中，精密加入70%乙醇溶液50mL，称定重量，在80℃水浴中回流提取2小时，冷却至室温，补足重量，取续滤液25mL，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，过微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

前述流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的相变化为：开始时，乙腈相10%，乙酸水溶液相90%；第10min 时，乙腈相15%，乙酸水溶液相85%，稳定15min；第40min 时，乙腈相25%，乙酸水溶液相75%；第55min时，乙腈相35%，乙酸水溶液相65%；第75min时，乙腈相50%，乙酸水溶液相50%。

杠板归药材及其制剂中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法为：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇∶质量浓度0.02%～0.06%的磷酸水溶液=40～50∶60～50为流动相；流速1.0mL·min^-1；柱温为25～35℃；检测波长为254～265nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.01～0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材中粉或其制剂0.1～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%～90%乙醇溶液25～50mL，称定重量，加热回流提取2～3次，每次0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至5～50mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

杠板归按干燥品计算，含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸C₂₁H₁₈O₁₃重量不得少于0.50%。

杠板归（Polygonum perfoliatum L.）药材收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版，该标准对杠板归的性状、茎叶的显微鉴别进行了描述，同时采用咖啡酸为对照品，建立了杠板归的薄层色谱鉴别方法。这些方法均是从定性的角度建立的，已经不能满足杠板归应用发展的需要；《中国药典》2010年版収载了杠板归药材，该标准中通过测定槲皮素的含量来进行杠板归药材的质量控制，但是槲皮素的专属性不强，很多植物药材中均含有槲皮素，为此，本发明人对其质量标准进行了提升研究。

通过查阅国内外文献资料发现：杠板归的化学成分研究报道很少，活性成分不明确，为此，发明人对杠板归的不同极性提取物进行了生物活性筛选试验，筛选出了杠板归药材发挥功效的生物活性部位；在生物活性筛选的基础上，对生物活性部位开展了系统的化学成分研究，研究结果表明：黄酮类化合物是其主要化学成分。黄酮类化合物具有抗氧化、清除氧自由基作用；调节心血管系统作用；抗炎免疫及抗衰老等作用。为了更有效地控制药材质量，本发明人对杠板归药材中分离得到的化合物进行了生物活性筛选试验，筛选出了具有很好抗炎、抗病毒活性的化合物—槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸，作为杠板归药材的主要含量测定指标成分；同时山奈酚、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯、芦丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸甲酯、七叶内酯、对香豆酸甲酯、5-羟甲基糠醛也可作为含量测定指标成分。

根据杠板归所含的主要活性成分之一槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的特点，采用高效液相色谱法进行含量测定，并对含量测定进行了方法学研究。

以下是本发明人对杠板归药材及其制剂中有效成分的含量测定方法进行试验研究并优选的过程：

一、质量控制指标的选择

本发明人在研究过程中对杠板归药材的指纹图谱进行了研究，发现槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸为指纹图谱中量最大的色谱峰，色谱图见图1和图2。

发明人采用植物化学的手段从杠板归药材中分离出了指纹图谱中量最大的化合物—槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸，并对其进行了结构鉴定，以下为具体的波谱数据：

黄色粉末(氯仿和甲醇)，分子式为C₂₁H₁₈O₁₃，样品溶液点在薄层硅胶板上喷三氯化铝后在紫外灯下呈黄色荧光，Molish反应阳性。ESI-MS m/z: 979.2[2M+Na]⁺, 501.0[M+Na]⁺, 955.2[2M-H]^-, 477.0[M-H]^-, 301.0[M-H-glcA]^-。¹H-NMR(400MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 12.31(1H, s, 5-OH), 7.86(1H, s, H-2′), 7.45(1H, d, J=8.4Hz, H-6′), 6.82(1H, d, J=8.0Hz, H-5′), 6.30(1H, s, H-8), 6.11(1H, s, H-6), 5.21(1H, d, J=7.6Hz, H-1′′). ¹³C-NMR(100MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 177.6(C-4), 173.0.1(C-6′′), 165.6(C-7), 161.0(C-5), 157.0(C-9), 156.6(C-2), 148.7(C-4′), 145.0(C-3′), 134.0(C-3), 121.5(C-6′), 120.8(C-1′), 117.2(C-5′), 115.5(C-2′), 103.5(C-10), 102.5(C-1′′), 99.2(C-6), 94.0(C-8), 76.5(C-5′′), 74.5(C-4′′), 74.0(C-3′′), 71.9(C-2′′)，确定为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸。

二、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的生物活性试验

采用对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响和对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响进行研究：

（一）对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

1、试验方法

取小鼠40只，随机分成4组,分别为阳性药（阿司匹林）组、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸高剂量组、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸低剂量组及生理盐水组。灌胃给药每天1次，连续给药8天，末次给药后30min以2%伊文思蓝生理盐水溶液尾静脉注射0.1mL/10g体重，同时腹腔注射0.6%醋酸0.2mL/只，20min后脱颈处死，以生理盐水5mL冲洗腹腔，取其冲洗液，离心5min（转速1000转/min），取上清液，用可见紫外分光光度计读取光密度OD值（波长为590nm）进行组间统计学处理。

注：与空白对照组比较*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001。

由表中数据可知：各组腹腔冲洗液光密度值与对照组相比均有不同程度降低，通过方差分析表明：各试验组之间有显著性差异，由t检验可知：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸高剂量组、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸低剂量组与对照组相比均有显著性差异，说明各组均有不同程度的抗炎作用。

（二）对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响：

取小鼠40只，随机分成4组,分别为阳性药（阿司匹林）组、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸高剂量组、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸低剂量组及生理盐水组。按体重0.2mL/10g灌胃给药每天1次，连续给药7天，末次给药45min后，于小鼠右耳两面涂二甲苯40μL/只，左耳不涂为正常耳。15min后将左、右两耳片切下，以8mm打孔器取下左、右耳片，立即用扭力天平称重（mg），计算左右耳肿胀度（右耳重－左耳重之差）及抑制率[抑制率=（对照组耳廓肿胀度－给药组耳廓肿胀度）×100%／对照组耳廓肿胀度]。结果见表3、表4，可见各组之间有显著性差异。

注：与空白对照组比较*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001。

由上述试验可知，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸具有较好的抗炎生物活性，选择槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸作为含量测定指标具有较强的科学性和合理性。

三、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等成分含量测定方法的建立

1.仪器与试药

高效液相色谱仪：Aglient 1100高效液相色谱仪（四元泵，DAD检测器，自动进样器）；CTO-10Asvp柱温箱（美国）；十万分之一天平（梅特勒 托利多）。

色谱甲醇；水（重蒸水，临用前制备）；磷酸等（分析醇）；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（申请人按本发明所述方法自制），通过波谱解析技术(IR、1H-NMR、13C-NMR、MS)分析，鉴定其结构，通过DAD检测器检测其纯度为98.91%，符合含量测定要求；杠板归药材（28个不同产地）。

2.色谱条件 

色谱柱：Lichrosher5-C18 column（4.6×250mm，5??m）柱，甲醇-0.05%磷酸（43：57）为流动相，流速为1mL??min^-1,检测波长258nm，柱温30℃。进样量为20μL。

3.提取条件的优化

对提取效率有影响的因素包括溶剂、提取方法、提取时间、提取温度、溶剂的用量等进行了优化研究。

首先对提取溶剂进行了研究，用乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇、20%乙醇、水，得到的峰面积分别为4565.5、5541.4、5400.5、4934.9、4362.65、1812.2。80%的乙醇提取的峰面积最大，所以选择80%乙醇作为提取溶剂。

其次，对回流和超声两种提取方式进行考察，发现回流提取率明显高于超声提取。然后对提取温度单因素考察，考察不同的温度50、60、70、80、90℃，提取率分别为1.197、1.209、1.275、1.308、1.282。所以选择了80℃作为提取温度。

为了优化下一步的提取条件，设计了正交试验对溶剂用量、提取次数、提取时间进行考察，正交表和方差分析表如下：

^a F0.05（3.，2=19.16, * P＞0.05

从上面的分析结果看出，A因素对实验的结果影响显著，而其他因素对实验的结果影响不显著。所以溶剂用量选择为30mL。根据R值，四个因素的影响顺序是A＞B＞C＞D，所以其他因素与水平选择为提取次数2次，时间为1次。

4.系统适应性试验  分别精密吸取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品溶液、杠板归药材供试品溶液和试剂空白溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的保留时间约为11～13分钟，本试验条件下槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸与其他组分峰的分离度大于1.5，阴性无干扰，理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计均高于3000，故规定理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计不低于3000，色谱图见图3。

5.检测波长的选择  在液相色谱仪上，于200～400nm范围内进行全波扫描，结果显示：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的最大吸收波长为258nm，故选定258nm为杠板归中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的检测波长。

6.槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的纯度检查  经过面积归一化法计算，其纯度为98.91%。

7.线性关系的考察  精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸5.94mg对照品于50mL容量瓶中,加甲醇制成浓度为0.1188mg/mL的对照品储备液。取该储备液0.5、1.5、2.5、4、6、8mL，分别加甲醇定容至10mL，分别制备得到0.0019、0.0038、0.00594、0.01782、0.0297、0.04752、0．09504、0.1188μg/μL 9个不同浓度的溶液，分别精密吸取该对照品系列溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并以对照品的进样量X（μg/ul）为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程：y=43694x-19.744, ?? =0.9999，结果表明，槲皮素在0.038-2.376μg范围内线性关系良好。以信噪比10:1为标准，定量限为16.28ng。

8.精密度试验

日内精密度  吸取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品液20 ??L，按上述色谱条件,连续进样6次,测定峰面积，计算平均相对标准偏差结果：RSD %为1.75 %，说明该方法具有良好的精密度。

日间精密度  吸取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品液20 ??L，按上述色谱条件,每天进两次，连续测三天，计算平均相对标准偏差结果：RSD %为1.67 %，说明该方法具有良好的精密度。

9.重复性试验  取同一批杠板归药材中粉各0.1g，共6份，按本发明所述含量测定方法中供试品溶液的制备方法制备供试液。精密吸取供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按本发明所述色谱条件测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰面积积分值，计算含量，求相对标准偏差。结果表明，此方法测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的重现性良好，RSD=2.0%。

10.稳定性试验  取同一批杠板归药材中粉0.1g，按本发明所述含量测定方法中供试品溶液的制备方法制备供试液，在室温下分别于0，2，4，8，12，24h精密吸取20??L进样，测定槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰面积，求相对标准偏差。结果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸至少在24小时内基本稳定，RSD=2.53%。

11.准确度试验  采用加样回收法，取已知含量的样品（牛郎关大兴田）,精密称定,分别精密加入一定量的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸,按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液,按上述测定方法进行测定,计算回收率,结果见表9：

12.耐用性试验

取同一批杠板归药材中粉0.1g，共3份，按本发明所述方法处理样品，得供试品溶液，备用，进行以下色谱条件的对比考查研究：流动相组成及比例变化、不同色谱柱比较、不同柱温比较、不同流速比较、不同检测波长比较，考查结果见表10-15。

13.样品测定  按本发明所述方法制备供试品和对照品溶液，分别进样，记录色谱图，计算槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量，结果见表16。

与现有技术相比，本发明通过建立杠板归药材及其制剂中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等成分的含量测定方法，完善了杠板归药材及其制剂的质量检测标准，弥补了现有质量控制技术的不足，使杠板归药材及其制剂的质量控制技术更为科学、合理；本发明所述含量测定方法的精密度高，重现性好，稳定性好，回收率高，测量结果准确，可有效控制杠板归药材及其制剂的质量，从而确保其临床应用的安全性和有效性。

附图说明：

图1是杠板归中有效成分的对照品制备工艺流程图；

图2是杠板归药材的指纹图谱完整图；

图3是杠板归药材的指纹图谱放大图；

图4是杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸测定系统适应性图谱。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

本发明的实施例1：杠板归药材中有效成分的对照品制备方法（参见图1）：将杠板归药材干燥、粉碎，用75%乙醇回流提取3次，蒸去溶剂得浸膏，浸膏用水分散，然后用乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯部分反复进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇=30:1部分提取液浓缩得对香豆酸甲酯对照品；氯仿-甲醇=20:1部分提取液浓缩得5-羟甲基糠醛对照品；正丁醇部分反复进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇=10:1部分提取液浓缩、先后得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品；氯仿-甲醇=5:1部分提取液浓缩得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品；氯仿-甲醇=2:1部分提取液浓缩得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品。

本发明的实施例2：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇-质量浓度0.05%磷酸水溶液（43∶57）为流动相；流速1.0mL·min^-1；柱温为30℃；检测波长为258nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（实施例1所制得）适量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材中粉0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇溶液25mL，称定重量，加热回流提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

杠板归按干燥品计算，含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸C₂₁H₁₈O₁₃重量不得少于0.50%。

本发明的实施例3：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.06%磷酸水溶液（40∶60）为流动相；流速1.0mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为260nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（申请人自制）适量，加甲醇制成每1mL含0.01mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材中粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液30mL，称定重量，加热回流提取2次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至25mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

杠板归按干燥品计算，含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸C₂₁H₁₈O1₃重量不得少于0.50%。

本发明的实施例4：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05%磷酸水溶液（50∶50）为流动相；流速1.0mL·min^-1；柱温为35℃；检测波长为265nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（申请人自制）适量，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材中粉0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇溶液40mL，称定重量，加热回流提取3次，每次0.5小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至5mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

杠板归按干燥品计算，含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸C₂₁H₁₈O₁₃重量不得少于0.50%。

本发明的实施例5：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02%磷酸水溶液（45∶55）为流动相；柱温为30℃；检测波长为254nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（申请人自制）适量，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材中粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90%乙醇溶液50mL，称定重量，加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至50mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

杠板归按干燥品计算，含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸C₂₁H₁₈O₁₃重量不得少于0.50%。

本发明的实施例6：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等10种成分的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈∶质量浓度0.2%的乙酸水溶液=10～50∶90～50为流动相梯度洗脱（梯度洗脱过程中，洗脱液的相变化为：开始时，乙腈相10%，乙酸水溶液相90%；第10min时，乙腈相15%，乙酸水溶液相85%，稳定15min；第40min 时，乙腈相25%，乙酸水溶液相75%；第55min时，乙腈相35%，乙酸水溶液相65%；第75min时，乙腈相50%，乙酸水溶液相50%）；流速1.0mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为254nm、340nm、370nm；理论板数应不低于3000； 

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和山奈酚对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、芦丁对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品、阿魏酸甲酯对照品、七叶内酯对照品、对香豆酸甲酯对照品、5-羟甲基糠醛对照品，加甲醇制成每1mL含0.08mg的溶液，即得；（其中山奈酚对照品、芦丁对照品、阿魏酸甲酯对照品和七叶内酯对照品可从市场上购买，也可以按照现有技术自行制备；其余对照品均为申请人按本发明所述对照品制备方法自行制备。）

供试品溶液的制备：取杠板归药材粉末1.0g，精密称定，置100mL三角瓶中，精密加入70%乙醇溶液50mL，称定重量，在80℃水浴中回流提取2小时，冷却至室温，补足重量，取续滤液25mL，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，过微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明的实施例7：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等6种成分的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈∶质量浓度0.2%的乙酸水溶液=10～50∶90～50为流动相梯度洗脱（梯度洗脱过程中，洗脱液的相变化为：开始时，乙腈相10%，乙酸水溶液相90%；第10min时，乙腈相15%，乙酸水溶液相85%，稳定15min；第40min 时，乙腈相25%，乙酸水溶液相75%；第55min时，乙腈相35%，乙酸水溶液相65%；第75min时，乙腈相50%，乙酸水溶液相50%）；流速1.0mL·min^-1；柱温为30℃；检测波长为254nm、340nm、370nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（申请人自制）和山奈酚对照品（购买）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品（申请人自制）、芦丁对照品（购买）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品（申请人自制）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品（申请人自制），加甲醇制成每1mL含0.15mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材粉末1.0g，精密称定，置100mL三角瓶中，精密加入80%乙醇溶液40mL，称定重量，在80℃水浴中回流提取2小时，冷却至室温，补足重量，取续滤液25mL，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至20mL，摇匀，过微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明的实施例8：杠板归药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等3种成分的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈∶质量浓度0.005%的甲酸水溶液=30∶70为流动相；柱温为20℃；检测波长为340～370nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，即得；（三种对照品均为申请人自制）

供试品溶液的制备：取杠板归药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇溶液30mL，称定重量，回流提取3次，每次0.5小时，滤过，取滤液挥干，残渣加甲醇溶解，定容至40mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明的实施例9：杠板归复方制剂（由稻秀100-150g、杠板归100-500g、苦参100-200g、连翘100-300g、当归100-250g、黄柏100-150g和红土茯苓100-200g制成）中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸等3种成分的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈∶质量浓度0.005%的甲酸水溶液=30∶70为流动相；柱温为20℃；检测波长为340～370nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，即得；（三种对照品均为申请人自制）

供试品溶液的制备：取杠板归复方制剂（由稻秀100-150g、杠板归100-500g、苦参100-200g、连翘100-300g、当归100-250g、黄柏100-150g和红土茯苓100-200g制成）粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇溶液30mL，称定重量，回流提取3次，每次0.5小时，滤过，取滤液挥干，残渣加甲醇溶解，定容至40mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明的实施例10：杠板归复方制剂（由金荞麦100-300g、紫花地丁100-300g、莪术100-150g、败酱草100-300g、杠板归100-300g、大血藤100-300g和一枝黄花100-300g等制成）中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇-质量浓度0.05%磷酸水溶液（43∶57）为流动相；流速1.0mL·min^-1；柱温为30℃；检测波长为258nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品（实施例1所制得）适量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归复方制剂（由金荞麦100-300g、紫花地丁100-300g、莪术100-150g、败酱草100-300g、杠板归100-300g、大血藤100-300g和一枝黄花100-300g等制成）0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇溶液25mL，称定重量，加热回流提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

Claims (5)

1.杠板归药材中有效成分的对照品制备方法，其特征在于：将杠板归药材干燥、粉碎，用75%乙醇回流提取2～3次，蒸去溶剂得浸膏，浸膏用水分散，然后用乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯部分反复进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇=30:1部分提取液浓缩得对香豆酸甲酯对照品；氯仿-甲醇=20:1部分提取液浓缩得5-羟甲基糠醛对照品；正丁醇部分反复进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，氯仿-甲醇=10:1部分提取液浓缩、先后得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品；氯仿-甲醇=5:1部分提取液浓缩得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品；氯仿-甲醇=2:1部分提取液浓缩得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品。

2.杠板归药材及其制剂中有效成分的含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，在同样色谱条件下对杠板归药材及其制剂中所含的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和山奈酚和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯和/或芦丁和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯和/或槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和/或阿魏酸甲酯和/或七叶内酯和/或对香豆酸甲酯和/或5-羟甲基糠醛进行含量测定；具体方法为：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇∶质量浓度0.001%～5%的甲酸、乙酸或磷酸水溶液=10～50∶90～50为流动相；柱温为20～35℃；检测波长为240～270nm或340～390nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和山奈酚对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、芦丁对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品、阿魏酸甲酯对照品、七叶内酯对照品、对香豆酸甲酯对照品、5-羟甲基糠醛对照品中的至少一种，加甲醇制成每1mL含0.01～2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材粉末或其制剂0.1～1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶或三角瓶中，精密加入30～90%乙醇溶液20～50mL，称定重量，回流提取1～3次，每次0.5～2小时，滤过，取滤液挥干，残渣加甲醇溶解，定容至5～50mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

3.按照权利要求2所述杠板归药材及其制剂中有效成分的含量测定方法，其特征在于：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈∶质量浓度0.2%的乙酸水溶液=10～50∶90～50为流动相梯度洗脱；流速1.0mL·min^-1；柱温为25℃；检测波长为254nm、340nm、370nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取适量槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品和山奈酚对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸正丁酯对照品、芦丁对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品、阿魏酸甲酯对照品、七叶内酯对照品、对香豆酸甲酯对照品、5-羟甲基糠醛对照品中的至少一种，加甲醇制成每1mL含0.01～2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材粉末或其制剂1.0g，精密称定，置100mL三角瓶中，精密加入70%乙醇溶液50mL，称定重量，在80℃水浴中回流提取2小时，冷却至室温，补足重量，取续滤液25mL，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，过微孔滤膜，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.按照权利要求3所述杠板归药材及其制剂中有效成分的含量测定方法，其特征在于：流动相梯度洗脱过程中，洗脱液的相变化为：开始时，乙腈相10%，乙酸水溶液相90%；第10min 时，乙腈相15%，乙酸水溶液相85%，稳定15min；第40min 时，乙腈相25%，乙酸水溶液相75%；第55min时，乙腈相35%，乙酸水溶液相65%；第75min时，乙腈相50%，乙酸水溶液相50%。

5.按照权利要求2所述杠板归药材及其制剂中有效成分的含量测定方法，其特征在于：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸的含量测定方法为：照《中国药典》2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以甲醇∶质量浓度0.02%～0.06%的磷酸水溶液=40～50∶60～50为流动相；流速1.0mL·min^-1；柱温为25～35℃；检测波长为254～265nm；理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.01～0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取杠板归药材中粉或其制剂0.1～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%～90%乙醇溶液25～50mL，称定重量，加热回流提取2～3次，每次0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，挥干，残渣加甲醇溶解，定容至5～50mL，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

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