CN1969953A - 金银花、黄芩、其提取物及含其提取物的制剂的质量控制方法 - Google Patents
金银花、黄芩、其提取物及含其提取物的制剂的质量控制方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种金银花药材、黄芩药材，其提取物及包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的质量控制方法。通过利用高温液相色谱法建立了金银花药材、金银花提取物、黄芩药材、黄芩提取物以及包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的从原料到最终制剂的一系列的指纹图谱并对其之间的相关性进行了考察，从而建立了一种采用指纹图谱对从原材料到中间体直至最终制剂成品的质量进行控制的方法，确保了产品工艺和产品质量的稳定、均一，同时也提供了一种有效的产品检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种原药材、其提取物及包含提取物的制剂的质量控制方法，更具体地说是涉及一种金银花药材、黄芩药材、其提取物及包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的质量控制方法。
技术背景
金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、红花腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、凉散风热之功效，主要用于痈肿、疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、温病发热等；黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒之功效，主要用于肺热咳嗽、高热烦渴、痈肿疮毒等。二味配伍而成的银黄制剂是现代临床用于治疗风热犯肺而致发热、咳嗽、咽痛等症的优选药物。
目前对银黄制剂及其所用初始原料金银花和黄芩来说，大多是以绿原酸或黄芩苷的有无或多少来判定其质量优劣，而金银花、黄芩的品种，产地、采收季节等均会影响药材及其提取物的各成分含量，进而影响到制剂的质量，此种方法不能更加准确地反映药材或其提取物、制剂的整体质量状况，因此存在很大的缺陷。如《中国药典》及卫生部版标准记载的金银花、黄芩及其提取物和制剂的质量控制方法均采用鉴别和一种或两种物质含量测定的方法来控制其质量是否合格，而对其它的成分未做规定。
中药指纹图谱是指某种中药材及其制剂中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药有效成分绝大多数没有十分明确的情况下，指纹图谱的建立对于有效控制中药材及其提取物和制剂的质量具有重要的意义。目前，有关金银花、黄芩指纹图谱的研究已有报道，而包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的指纹图谱尚未见报道，其相关性研究也尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过建立金银花药材、黄芩药材，金银花提取物、黄芩提取物、包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的一系列指纹图谱来进行质量控制的方法，该质量控制方法对原材料、中间体和最终的制剂都适用，因此是一种可以进行全面质量控制的方法。
本发明涉及一种金银花药材、黄芩药材，其提取物及包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的质量控制方法，该方法包括：
(1)对照品指纹图谱的建立
对照品溶液的制备：
绿原酸对照品溶液的制备：称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释至所需刻度，即得；
黄芩苷对照品溶液的制备：称取黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至所需浓度，即得；
对照品指纹图谱的测定：
吸取上述对照品溶液注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到对照品的指纹图谱；
色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用梯度洗脱，流速0.5-1.2ml/分，流动相组成A：乙腈，B：0.05-0.5％磷酸；检测波长300-345nm；分析时间30-60分；理论板数以绿原酸计应不低于2000；
(2)供试品指纹图谱的测定：
供试品溶液的制备：
精密称取金银花药材适量，加水回流提取，提取液放冷至室温后过滤，取适量滤液加水稀释至所需浓度，即得；
精密称取金银花提取物适量，加水溶解并稀释至所需浓度，即得；
精密称取黄芩药材适量，加水回流提取，提取液放冷至室温后过滤，取适量滤液加水稀释至所需浓度，即得；
精密称取黄芩提取物适量，加甲醇溶解并稀释至所需浓度，即得；
称取注射用银黄粉末适量或取银黄注射液适量，加水溶解并稀释至所需浓度，即得；
分别吸取上述五种供试品溶液注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到供试品的指纹图谱；
色谱条件：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用梯度洗脱，流速0.5-1.2ml/分，流动相组成A：乙腈，B：0.05-0.5％磷酸；检测波长300-345nm；分析时间30-60分；理论板数以绿原酸计应不低于2000；
(3)将对照品的峰设定为参照峰，将其它物质的峰和参照物的峰相比，以其它物质的保留时间和峰面积与参照峰的保留时间和峰面积比较，计算其相对峰面积和相对保留时间，以此进行从原料到制剂的质量控制。
本发明所述色谱条件的所述梯度洗脱条件进一步如下：
0分钟时，流动相A为0-5％的乙腈，流动相B为100-95％的0.05-0.5％磷酸；
5分钟时，流动相A为0-5％的乙腈，流动相B为100-95％的0.05-0.5％磷酸；
25分钟时，流动相A为30-45％的乙腈，流动相B为70-55％的0.05-0.5％磷酸；
30分钟时，流动相A为0-5％的乙腈，流动相B为100-95％的0.05-0.5％磷酸。
本发明所选的波长为327nm。
本发明中，其中当供试品溶液为金银花药材时，以绿原酸峰的保留时间进行计算，相对保留时间为0.844的峰为5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.024的峰为4-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.099的峰为咖啡酸，相对保留时间为1.372的峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.422的峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.467的峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸；以绿原酸峰的峰面积进行计算，供试品中所含3，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.395-0.593，所含3，4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.145-0.241。
本发明中，其中当供试品溶液为金银花提取物时，以绿原酸峰的保留时间进行计算，相对保留时间为0.854的峰为5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.034的峰为4-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.111的峰为咖啡酸，相对保留时间为1.382的峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.427的峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.466的峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸。
进一步以绿原酸峰的峰面积进行计算，供试品中所含5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.347-0.645，所含4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.352-0.653，所含咖啡酸的峰的相对峰面积为1.529-2.294，所含4，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.583-0.972，所含3，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.410-0.762，所含3，4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.847-1.412。
本发明中，其中当供试品溶液为黄芩药材时，标定了3个峰，以黄芩苷峰的保留时间进行计算，其余两个峰的相对保留时间分别为0.808和1.081。
本发明中，其中当供试品溶液为黄芩提取物时，标定了2个峰，以黄芩苷峰的保留时间进行计算，另一个峰的相对保留时间为0.837。
本发明中，其中当供试品溶液为含金银花提取物和黄芩提取物的制剂时，以绿原酸峰的保留时间进行计算，相对保留时间为0.858的峰为5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.032的峰为4-O-啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.111的峰为咖啡酸，相对保留时间为1.380的峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.426的峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.467的峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸；相对保留时间为1.592的峰为黄芩苷。
进一步以绿原酸峰的峰面积进行计算，供试品中所含5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.645-1.198，所含4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.596-1.108，所含咖啡酸的峰的相对峰面积为1.754-2.923，所含4，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.843-1.567，所含3，4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的且相对峰面积为0.985-1.930，所含黄芩苷的峰的相对峰面积为6.307-9.461。
本发明中，还对金银花药材和提取物、黄芩药材和黄芩提取物及其制剂指纹图谱的相关性进行了研究：
分别将金银花药材和提取物及制剂、黄芩药材和黄芩提取物及制剂指纹图谱相比较，通过各指纹图谱中共有峰的数目以及各共有峰间彼此对应关系情况来考察金银花、黄芩及其提取物和制剂指纹图谱的相关性。制剂中前七个峰来自金银花，金银花药材和提取物中峰为一一对应，在处理过程中各峰之间相互转换使药材、提取物和制剂中各峰面积比不同。制剂中8号峰(黄芩苷)来自于黄芩。4个指纹图谱均与制剂之间对应关系良好。本发明具有以下优点：
1.本发明在建立含有金银花和黄芩的指纹图谱的过程中，确证了各共有峰的化学成分，分别为：5-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-O-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷，并对其峰面积比进行了研究，保证了制剂的化学组成稳定性和使用安全性，而现有技术中，在采用指纹图谱进行质量控制的过程中并没有对所有共有峰的化学成分进行测定。
2.本发明应用指纹图谱技术不仅监测和控制了反映包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的整体质量状况，同时进一步控制了原料质量及整个生产工艺流程的稳定性，从而提供了一种从原料到成品的全面质量控制方法，确保了制剂疗效的一致性，弥补了以往技术中只涉及某一方面的缺点。
3.本发明采用高效液相色谱方法进行检测，方法简便、稳定、精密度高、重现性好，较之于其他检测方法如：气相色谱法、高效毛细管电泳法等更为实用，大大节约了成本和时间，其检测波长选择327nm，也是因为在该波长出峰较多，反应的信息较完全。
4.本发明采用高效液相色谱对金银花、黄芩药材及其提取物和制剂进行指纹图谱及其相关性研究，与以往只通过绿原酸或黄芩苷的有无或多少来判定药材或其提取物、制剂的质量优劣相比较，更为科学准确。
5.本发明包括了以金银花和黄芩组方的制剂指纹图谱研究，通过制剂中共有峰的数目、相对保留时间以及相对峰面积比值来控制制剂的质量，确保制剂质量的均一性、稳定性，使中药制剂在应用过程中更加安全、可控，减少因中药制剂成分复杂不清而引起的各种潜在危险。
6.本发明在对金银花、黄芩药材指纹图谱的建立中，供试品溶液的制备所采用的提取溶剂为水，较之于其他提取溶剂如：甲醇、乙醇、无水乙醇等更为贴近生产实际，使药材、中间体和成品之间的相关性得到更好的体现，工艺过程的控制更简单、易行。
7.本发明通过对金银花及其提取物、黄芩药材及黄芩苷和制剂指纹图谱的相关性考察，结果表明金银花、黄芩药材及其提取物和制剂指纹图谱相关性很好，应用其相关性考察可有效控制金银花、黄芩药材及其提取物和制剂的质量状况。
附图说明
图1显示了本发明的金银花药材的指纹图谱，其中从左到右分别是共有峰1至7号峰。分别为5-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-O-咖啡酰奎宁酸。
图2显示了本发明的黄芩药材的指纹图谱，其中从左到右分别是共有峰1至3号峰。
图3显示了本发明的金银花提取物的指纹图谱，其中从左到右分别是共有峰1至7号峰。分别为5-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-O-咖啡酰奎宁酸。
图4显示了本发明的黄芩提取物(黄芩苷)的指纹图谱，其中从左到右分别是共有峰1至2号峰。
图5显示了本发明的制剂的指纹图谱，其中从左到右分别是共有峰1至8号峰。分别为5-O-咖啡酰奎宁酸、绿原酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、4，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-O-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷。
具体实施方式
实施例一、金银花药材指纹图谱
1、色谱条件
laballiance高效液相色谱仪；seriesIII二元泵；UV6000LP检测器；Ezchrom Elite工作站。
绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所提供，批号：11075-200212)；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：KromasilC18(Ф4.6×250mm，5um)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸；采用梯度洗脱，洗脱程序见下表；检测波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10ul。
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 052530 | 55355 | 95956595 |
2、对照品溶液的制备：取绿原酸对照品5mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、供试品溶液的制备：精密称取金银花药材适量，加水回流提取，提取液放冷至室温后过滤，取1ml续滤液置于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
4、测定法：分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
5、结果：结合指纹图谱的技术要求进行分析。共标定出7个共有峰；以2号峰(绿原酸峰)为参照物峰(S)，各共有峰的相对保留时间分别为0.844(1)，1.000(2)，1.024(3)，1.09 9(4)，1.372(5)，1.422(6)，1.464(7)。并规定相对保留时间为1.422和1.464的峰的相对峰面积比值为0.395～0.593(6)，0.145～0.241(7)。金银花药材各共有峰相对保留时间、相对峰面积比值结果分别见下表。
金银花药材各共有峰相对保留时间
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)34567 | 0.8431.0001.0241.0991.3731.4221.465 | 0.8441.0001.0231.1011.3711.4191.461 | 0.8441.0001.0261.1001.3701.4251.463 | 0.8451.0001.0251.0971.3681.4211.467 | 0.8431.0001.0201.0981.3731.4191.465 | 0.8441.0001.0241.1021.3761.4241.462 | 0.8431.0001.0231.0961.3691.4221.464 | 0.8451.0001.0261.1011.3751.4181.466 | 0.8431.0001.0241.1031.3741.4231.463 | 0.8441.0001.0231.0971.3721.4241.464 | 0.8441.0001.0241.0991.3721.4221.464 |
金银花药材各共有峰相对峰面积比值
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)34567 | 0.0351.0000.0420.0230.0450.4920.182 | 0.0371.0000.0380.0290.0410.4750.213 | 0.0281.0000.0350.0210.0390.5230.173 | 0.0341.0000.0430.0190.0370.4830.186 | 0.0261.0000.0470.0180.0420.4660.204 | 0.0381.0000.0360.0250.0440.5120.195 | 0.0361.0000.0450.0270.0470.5270.218 | 0.0311.0000.0390.0200.0380.4780.181 | 0.0271.0000.0340.0170.0400.4850.198 | 0.0291.0000.0440.0240.0430.4960.183 | 0.0321.0000.0400.0220.0420.4940.193 |
6、指纹图谱精密度考察
按照指纹图谱精密度考察要求，以第1批金银花药材为供试品，连续进样6次，分别计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值，RSD(％)不超过3％。
7、指纹图谱重现性考察
以第1批金银花药材为供试品，按照指纹图谱重现性规定方法进行操作，分别计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值，RSD(％)不超过3％。
8、指纹图谱稳定性试验
按照指纹图谱稳定性测定方法操作，以第1批金银花药材为供试品，考察24小时溶液的稳定性，分别计算共有峰相对保留时间及相对峰面积比值，RSD(％)不超过3％，供试品溶液24小时内稳定。
以上试验表明，该测定方法稳定、可靠，指纹图谱相对稳定。
实施例二、金银花提取物指纹图谱
1、色谱条件
laballiance高效液相色谱仪；seriesIII二元泵；UV6000LP检测器；Ezchrom Elite工作站。
绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所提供，批号：11075-200212)；金银花提取物(自制)；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：Kromasil C18(Ф4.6×250mm，5um)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸；采用梯度洗脱，洗脱程序见下表；检测波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10ul。
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 052530 | 55355 | 95956595 |
2、对照品溶液的制备：取绿原酸对照品5mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、供试品溶液的制备：精密称取金银花提取物10mg，置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
4、测定法：分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
5、结果：结合指纹图谱的技术要求进行分析。标定出7个共有峰；以2号峰(绿原酸峰)为参照物峰(S)，各共有峰的相对保留时间分别为0.854(1)，1.000(2)，1.034(3)，1.111(4)，1.382(5)，1.427(6)，1.466(7)。各共有峰的相对峰面积比值为0.347～0.645(1)，0.352～0.653(3)，1.529～2.294(4)，0.583～0.972(5)，0.410～0.762(6)，0.847～1.412(7)。金银花提取物各共有峰相对保留时间、相对峰面积比值分别见下表。
金银花提取物各共有峰相对保留时间统计结果
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)34567 | 0.8571.0001.0321.1121.3781.4261.465 | 0.8541.0001.0341.1111.3831.4281.461 | 0.8521.0001.0351.1101.3871.4281.463 | 0.8531.0001.0331.1091.3791.4291.467 | 0.8511.0001.0361.1081.3841.4271.465 | 0.8541.0001.0351.1101.3851.4301.462 | 0.8551.0001.0311.1131.3871.4251.464 | 0.8571.0001.0321.1141.3791.4271.466 | 0.8531.0001.0341.1131.3801.4281.463 | 0.8511.0001.0331.1091.3821.4241.464 | 0.8541.0001.0341.1111.3821.4271.466 |
金银花提取物各共有峰相对峰面积比值统计结果
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)34567 | 0.4951.0000.4991.9200.7800.5861.128 | 0.4981.0000.5021.8980.7680.5861.126 | 0.4961.0000.5071.9170.7850.5911.135 | 0.4941.0000.5031.8960.7820.5881.124 | 0.4911.0000.5081.8970.7750.5921.133 | 0.5011.0000.5011.9150.7810.5841.127 | 0.5031.0000.4971.9230.7830.5871.136 | 0.4971.0000.5091.9210.7790.5901.131 | 0.4961.0000.5041.9240.7690.5921.130 | 0.4931.0000.4981.9130.7760.5871.129 | 0.4961.0000.5031.9120.7780.5881.130 |
该方法的精密度、重现性均符合指纹图谱技术要求，样品溶液在24小时内稳定。
实施例三、黄芩药材指纹图谱
1、色谱条件
高效液相色谱仪：lab alliance seriesIII二元泵；UV6000LP检测器；Ezchrom Elite工作站。
黄芩苷(中国药品生物制品鉴定所提供，批号：11015-200212)；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：Kromasil C18(Ф4.6×250mm，5um)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸；采用梯度洗脱，洗脱程序见下表；检测波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10ul。
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 052530 | 55355 | 95956595 |
2、对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品6mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、供试品溶液的制备：精密称取黄芩药材适量，加水回流提取，提取液放冷至室温后过滤，取1ml续滤液置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
4、测定法：分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，
5.结果：结合指纹图谱的技术要求进行分析。标定出3个共有峰；以2号峰(黄芩苷峰)为参照物峰(S)，各共有峰的相对保留时间分别为0.808(1)，1.000(2)，1.081(3)。除黄芩苷峰外，各共有峰占总峰面积均小于10％，故对相对峰面积比值不作规定。黄芩药材各共有峰相对保留时间、相对峰面积比值结果分别见下表
黄芩药材各共有峰相对保留时间
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)3 | 0.8081.0001.083 | 0.8101.0001.078 | 0.8031.0001.081 | 0.8061.0001.079 | 0.7981.0001.085 | 0.8131.0001.084 | 0.8081.0001.076 | 0.8151.0001.087 | 0.8061.0001.077 | 0.8121.0001.080 | 0.8081.0001.081 |
黄芩药材各共有峰相对峰面积比值
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)3 | 0.0281.0000.061 | 0.0241.0000.053 | 0.0271.0000.057 | 0.0311.0000.060 | 0.0221.0000.051 | 0.0191.0000.054 | 0.0251.0000.049 | 0.0301.0000.063 | 0.0341.0000.064 | 0.0331.0000.059 | 0.0271.0000.057 |
该方法的精密度、重现性均符合指纹图谱技术要求，样品溶液在24小时内稳定。
实施例四、黄芩提取物指纹图谱
1、色谱条件
高效液相色谱仪：lab alliance seriesIII二元泵；UV6000LP检测器；Ezchrom Elite工作站。
黄芩苷对照品(中国药品生物制品鉴定所提供，批号：11015-200212)；黄芩苷(自制)；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：Kromasil C18(Ф4.6×250mm，5um)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸；采用梯度洗脱，洗脱程序见下表；检测波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10ul。
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 052530 | 55355 | 95956595 |
2、对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品6mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、供试品溶液的制备：精密称取黄芩苷7mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
4、测定法：分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
5、结果：结合指纹图谱的技术要求进行分析。标定出2个共有峰；以2号峰(黄芩苷峰)为参照物峰(S)，各共有峰的相对保留时间分别为0.837(1)，1.000(2)。1号峰峰面积小于5％，故对其相对峰面积比值不做要求。黄芩苷各共有峰相对保留时间、相对峰面积比值分别见下表。
黄芩苷各共有峰相对保留时间统计结果
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S) | 0.8361.000 | 0.8371.000 | 0.8391.000 | 0.8411.000 | 0.8351.000 | 0.8401.000 | 0.8371.000 | 0.8331.000 | 0.8341.000 | 0.8381.000 | 0.8371.000 |
黄芩苷各共有峰相对峰面积比值统计结果
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S) | 0.01941.000 | 0.01861.000 | 0.01891.000 | 0.01871.000 | 0.01921.000 | 0.01851.000 | 0.01881.000 | 0.01961.000 | 0.01931.000 | 0.01911.000 | 0.01901.000 |
该方法的精密度、重现性均符合指纹图谱技术要求，样品溶液在24小时内稳定。
实施例五、含有金银花提取物和黄芩提取物的制剂的指纹图谱
1、色谱条件
高效液相色谱仪：lab alliance seriesIII二元泵；UV6000LP检测器；Ezchrom Elite工作站。
绿原酸、黄芩苷、咖啡酸对照品为中国药品生物制品鉴定所提供；4-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3，4-O-咖啡酰奎宁酸、3，5-O-咖啡酰奎宁酸、4，5-O-咖啡酰奎宁酸对照品为自制，纯度均在98％以上；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：Kromasil C18(Ф4.6×250mm，5um)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸；采用梯度洗脱，洗脱程序见下表；检测波长：327nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10ul。
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 052530 | 55355 | 95956595 |
2、对照品溶液的制备：取各个对照品5mg，精密称定，分别置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、供试品溶液的制备：
取注射用银黄粉末(自制)10mg置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
取银黄注射液(自制)0.5ml于200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
4、测定法：分别精密吸取供试品溶液及参照物溶液各10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
5、结果：结合指纹图谱的技术要求进行分析。标定出8个共有峰。确定1号峰为5-O-咖啡酰奎宁酸；2号峰为绿原酸；3号峰为4-O-咖啡酰奎宁酸；4号峰为咖啡酸；5号峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸；6号峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸；7号峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸；8号峰为黄芩苷。以2号峰(绿原酸峰)为参照物峰(S)，各共有峰的相对保留时间分别为0.858(1)，1.000(2)，1.032(3)，1.111(4)，1.380(5)，1.426(6)，1.467(7)，1.592(8)；各共有峰的相对峰面积比值为0.645～1.198(1)，0.596～1.108(3)，1.754～2.923(4)，0.843～0.1.567(5)，0.985～1.930(7)，6.307～9.461(8)。
注射用银黄(冻干)各共有峰相对保留时间、相对峰面积比值分别见下表。
制剂各共有峰相对保留时间
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)345678 | 0.8481.0001.0331.1061.3671.4151.4581.586 | 0.8641.0001.0321.1161.3911.4371.4791.607 | 0.8631.0001.0321.1101.3841.4271.4651.583 | 0.8541.0001.0341.1071.3681.4261.4591.601 | 0.8621.0001.0311.1111.3791.4231.4631.587 | 0.8471.0001.0331.1091.3871.4191.4741.584 | 0.8611.0001.0321.1121.3861.4331.4691.589 | 0.8631.0001.0301.1151.3721.4211.4711.597 | 0.8571.0001.0331.1111.3851.4241.4671.591 | 0.8621.0001.0341.1131.3811.4321.4651.593 | 0.8581.0001.0321.1111.3801.4261.4671.592 |
制剂各共有峰相对峰面积比值
| 共有峰号批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 均值 |
| 12(S)345678 | 0.9081.0000.8532.3721.2240.6561.4137.924 | 0.9281.0000.8372.2991.1810.6531.3867.707 | 0.9281.0000.8662.3441.2080.6471.4248.023 | 0.9311.0000.8592.3231.2140.6611.3967.843 | 0.9331.0000.8482.3081.2070.6581.3917.865 | 0.9091.0000.8512.3611.1910.6491.4197.791 | 0.9161.0000.8592.3211.1860.6601.4267.839 | 0.9131.0000.8632.3311.2270.6511.4097.874 | 0.9181.0000.8392.3641.2010.6541.4017.961 | 0.9271.0000.8472.3581.2030.6481.4118.011 | 0.9211.0000.8522.3381.2040.6541.4087.884 |
该方法的精密度、重现性均符合指纹图谱技术要求，样品溶液在24小时内稳定。
实施例六、金银花、黄芩药材及其提取物和制剂指纹图谱相关性考察
1、金银花药材及其提取物和制剂指纹图谱相关性考察
通过对金银花药材及其提取物和制剂指纹图谱相关性考察，结果发现金银花药材指纹图谱中的1号峰、2号峰(绿原酸峰)、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰分别与金银花提取物指纹图谱中的1号峰、2号峰(绿原酸峰)、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰相对应；金银花药材指纹图谱中的1号峰、2号峰(绿原酸峰)、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰分别与金银花制剂指纹图谱中的1号峰、2号峰(绿原酸峰)、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰相对应；金银花提取物指纹图谱中的1号峰、2号峰(绿原酸峰)、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰分别与金银花制剂指纹图谱中1号峰、2号峰(绿原酸峰)、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰相对应。结果表明金银花药材及其提取物和制剂指纹图谱相关性很好。
2、黄芩药材及黄芩苷和制剂指纹图谱相关性考察
通过对黄芩药材及其提取物和制剂指纹图谱相关性考察，结果发现黄芩药材指纹图谱中的1号峰、2号峰(黄芩苷峰)分别与黄芩苷指纹图谱中1号峰、2号峰(黄芩苷峰)相对应；黄芩药材指纹图谱中的2号峰(黄芩苷峰)与制剂指纹图谱中的8号峰(黄芩苷峰)相对应；黄芩苷指纹图谱中的2号峰(黄芩苷峰)与制剂指纹图谱中的2号峰(黄芩苷峰)相对应。结果表明黄芩药材及黄芩苷和制剂指纹图谱相关性很好。
上述指纹图谱及其相关性考察均可用于控制药材及其提取物和制剂的质量。
实施例七
取金银花/或黄芩，按“发明内容”中“金银花药材指纹图谱、黄芩药材指纹图谱”中的方法进行检测，符合该指纹图谱中的规定。
实施例八
取金银花提取物/或黄芩苷，按“发明内容”中“金银花提取物指纹图谱、黄芩提取物指纹图谱”中的方法进行检测，符合该指纹图谱中的规定。
实施例九
取含有金银花和/或黄芩的制剂指纹图谱，按“发明内容”中“含有金银花和/或黄芩的制剂指纹图谱”中的方法进行检测，符合该指纹图谱中的规定。
取实施例七、八中的指纹图谱和制剂指纹图谱照实施例6进行分析，相关性良好。
Claims (10)
1、一种金银花药材、黄芩药材，其提取物以及包含金银花提取物和黄芩提取物的制剂的质量控制方法，该方法包括：
(1)对照品指纹图谱的建立
对照品溶液的制备：
绿原酸对照品溶液的制备：称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解并稀释至所需刻度，即得；
黄芩苷对照品溶液的制备：称取黄芩苷对照品适量，加甲醇溶解并稀释至所需浓度，即得；
对照品指纹图谱的测定：
吸取上述对照品溶液注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到对照品的指纹图谱；
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用梯度洗脱，流速0.5-1.2ml/分，流动相组成A：乙腈，B：0.05-0.5％磷酸；检测波长300-345nm；
分析时间30-60分；理论板数以绿原酸计应不低于2000；
(2)供试品指纹图谱的测定：
供试品溶液的制备：
精密称取金银花药材适量，加水回流提取，提取液放冷至室温后过滤，取适量滤液加水稀释至所需浓度，即得；
精密称取金银花提取物适量，加水溶解并稀释至所需浓度，即得；
精密称取黄芩药材适量，加水回流提取，提取液放冷至室温后过滤，取适量滤液加水稀释至所需浓度，即得；
精密称取黄芩提取物适量，加甲醇溶解并稀释至所需浓度，即得；
称取注射用银黄粉末适量或取银黄注射液适量，加水溶解并稀释至所需浓度，即得；
分别吸取上述五种供试品溶液注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定，得到供试品的指纹图谱；
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用梯度洗脱，流速0.5-1.2ml/分，流动相组成A：乙腈，B：0.05-0.5％磷酸；检测波长300-345nm；
分析时间30-60分；理论板数以绿原酸计应不低于2000；
(3)将对照品的峰设定为参照峰，将其它物质的峰和参照物的峰相比，以其它物质的保留时间和峰面积与参照峰的保留时间和峰面积比较，计算其相对峰面积和相对保留时间，以此进行从原料到制剂的质量控制。
2、如权利要求1所述的质量控制方法，其中色谱条件中的所述梯度洗脱条件如下：
0分钟时，流动相A为0-5％的乙腈，流动相B为100-95％的0.05-0.5％磷酸；
5分钟时，流动相A为0-5％的乙腈，流动相B为100-95％的0.05-0.5％磷酸；
25分钟时，流动相A为30-45％的乙腈，流动相B为70-55％的0.05-0.5％磷酸；
30分钟时，流动相A为0-5％的乙腈，流动相B为100-95％的0.05-0.5％磷酸。
3、如权利要求1或2所述的质量控制方法，其中所选波长为327nm。
4、如权利要求1所述的质量控制方法，其中当供试品溶液为金银花药材时，以绿原酸峰的保留时间进行计算，相对保留时间为0.844的峰为5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.024的峰为4-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.099的峰为咖啡酸，相对保留时间为1.372的峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.422的峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.467的峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸；以绿原酸峰的峰面积进行计算，供试品中所含3，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.395-0.593，所含3，4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.145-0.241。
5、如权利要求1所述的质量控制方法，其中当供试品溶液为金银花提取物时，以绿原酸峰的保留时间进行计算，相对保留时间为0.854的峰为5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.034的峰为4-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.111的峰为咖啡酸，相对保留时间为1.382的峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.427的峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.466的峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸。
6.如权利要求5所述的质量控制方法，其进一步以绿原酸峰的峰面积进行计算，供试品中所含5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.347-0.645，所含4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.352-0.653，所含咖啡酸的峰的相对峰面积为1.529-2.294，所含4，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.583-0.972，所含3，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.410-0.762，所含3，4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.847-1.412。
7、如权利要求1所述的质量控制方法，其中当供试品溶液为黄芩药材时，标定了3个峰，以黄芩苷峰的保留时间进行计算，其余两个峰的相对保留时间分别为0.808和1.081。
8、如权利要求1所述的质量控制方法，其中当供试品溶液为黄芩提取物时，标定了2个峰，以黄芩苷峰的保留时间进行计算，另一个峰的相对保留时间为0.837。
9、如权利要求1所述的质量控制方法，其中当供试品溶液为含金银花提取物和黄芩提取物的制剂时，以绿原酸峰的保留时间进行计算，相对保留时间为0.858的峰为5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.032的峰为4-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.111的峰为咖啡酸，相对保留时间为1.380的峰为4，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.426的峰为3，5-O-咖啡酰奎宁酸，相对保留时间为1.467的峰为3，4-O-咖啡酰奎宁酸；相对保留时间为1.592的峰为黄芩苷。
10.如权利要求1所述的质量控制方法，其进一步以绿原酸峰的峰面积进行计算，供试品中所含5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.645-1.198，所含4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.596-1.108，所含咖啡酸的峰的相对峰面积为1.754-2.923，所含4，5-O-咖啡酰奎宁酸的峰的相对峰面积为0.843-1.567，所含3，4-O-咖啡酰奎宁酸的峰的且相对峰面积为0.98 5-1.930，所含黄芩苷的峰的相对峰面积为6.307-9.461。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20070530 |