CN113702519A - 一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到一种评价中药化学成分药效活性的方法，具体涉及一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法。包括以下步骤：(1)通过建立裸花紫珠提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选出匹配数大于2的特征峰为相关峰；(2)根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和抗炎效果建立相应的谱效关系；(3)利用所建立的谱效关系评价裸花紫珠的抗炎效果。可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有抗炎作用的化学成分，进行活性成分筛选，为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。

Description

一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法
技术领域
本发明涉及到一种评价中药化学成分药效活性的方法，具体涉及一种具有抗炎作用的裸 花紫珠有效成分的评价方法。
背景技术
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)为马鞭草科紫珠属植物，裸花紫珠叶为药 用，全年均可采收，是一种常用的海南地区的传统民族药，由于其生长在海南黎族地区，故 也称为黎药。裸花紫珠其化学成分主要为黄酮类、苯乙醇苷类、萜类及挥发油类等，具有消 炎、解毒、收敛、止血的功能，用于化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、 创伤出血等。据《本草拾遗》记载裸花紫珠能解诸毒物，痈疽，喉痹，毒肿，下瘘，蛇虺虫 螫，狂犬毒，并煮汁服；亦煮汁洗疮肿，除血长肤。
中药谱效关系是在中医理论指导下，将中药指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行 关联，建立以化学分析与生物活性评价相结合的综合评价体系，有助于揭示中药药效的物质 基础，已成为中药有效成分预测和质量评价的方法之一。
中药指纹图谱能够揭示中药的化学成分，在整体上评价中药的质量，具有特征性、专属 性、稳定性和完整性等特点。但指纹图谱的研究与建立只是对中药化学成分的稳定性和可控 性实现改进，而没有与中药的药效建立直接的内在联系。谱效关系的研究建立在指纹图谱的 基础上，指纹图谱提供了复杂体系的化学成分信息，药理学研究提供了其活性信息，谱效关 系的研究使二者有效结合，更可靠地揭示中药药效的物质基础。目前谱效关系的研究方法有 相关性分析、回归分析、主成分分析、灰色关联度分析、聚类分析和典型相关分析。
如中国专利申请CN111458447A公开了一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法。包括有 以下步骤：(1)枸杞药材HPLC指纹图谱建立；(2)枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究；(3)枸杞 指纹图谱与药效指标谱效关系的建立；(4)基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质 量。本发明具有将枸杞的指纹图谱与其抗疲劳及提高免疫进行谱效相关性研究，获得可通过 其指纹图谱以直接预测其抗疲劳及提高免疫活性，从而用于判断枸杞质量优劣的有益效果。
中国专利申请CN102980952A公开了一种根据蜂胶指纹图谱预测其抗氧化活性的质量控 制方法，其是采用HPLC建立蜂胶指纹图谱，以高锰酸钾褪色时间、DPPH自由基清除率、 磷钼酸结合率、羟基自由基清除率评价其抗氧化活性。通过分析蜂胶指纹图谱色谱及光谱特 征确定25个特征峰及5个特征峰组。采用多项式拟合建立了根据蜂胶指纹图谱预测其抗氧化 活性的数学模型。根据指纹图谱特征峰(组)，仅采用本发明所提供的数学模型，不用做抗氧 化试验即可直接判定蜂胶药材抗氧化活性的强弱，确定其质量的优劣。
虽然现有技术中存在基于谱效关系的药物有效成分检测方法，但是药物的种类、有效成 分的提取方法及谱效关系的建立均对质量检测的结果具有较大的影响，并非所有的药物有效 成分的检测均适用谱效关系的评价方法，需要根据具体药物选择合适的评价过程，才能较为 准确的判断药效物质。
本发明旨在以裸花紫珠不同提取部位的HPLC指纹图谱为基础，通过双变量相关分析和 回归分析，考察裸花紫珠发挥抗炎作用药效活性的谱效关系，建立裸花紫珠抗炎作用的物质 评价方法。该方法能够准确的判定裸花紫珠中抗炎作用的药效物质，该评价方法比较简单、 快速。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法。 可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有抗炎作用的化学成分，进行活性成分筛选，为裸花紫 珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，包括以下步骤：
(1)通过建立裸花紫珠提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选 出匹配数大于2的特征峰为相关峰；
(2)根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和抗炎效果建立相应的谱效关系；
(3)利用所建立的谱效关系评价裸花紫珠的抗炎效果。
优选地，所述裸花紫珠提取物的制备方法为：
S1：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量水；回流提取，过滤，减压干燥，制得 水提取物；
S2：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的60％乙醇；回流提取，过滤，减压干 燥，制得60％醇提取物，用水溶解后过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收，干燥，得60％醇提-水洗提取物；
再用40％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥，得60％醇提-40％醇洗提取物；
再用60％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥，得60％醇提-60％醇洗提取物；
S3：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的95％乙醇；回流提取，过滤，减压干 燥，制得95％醇提取物。
优选地，S1、S2、S3中所述回流提取的时间均为1-5h，优选为2h；
优选地，S1、S2、S3中所述提取的次数均为1-3次。
优选地，具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分评价方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相当于生药量1g的水提物、60％醇提取物、60％醇提-水洗提取物、60％ 醇提-40％醇洗提取物、60％醇提-60％醇洗提取物、95％醇提取物；分别置于具塞茄形瓶中， 加入50％甲醇50mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)使用高效液相色谱(HPLC)对供试品溶液进行测定，建立裸花紫珠供试品的HPLC 指纹图谱；
(3)通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大 于2的特征峰，提取特征峰数据；
(4)使用角叉菜胶混悬液建立大鼠炎症模型进行抗炎实验，检测各提取物的抗炎效果；
(5)将步骤(3)中所提取的特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分 析并代入谱效数学模型中进行计算，并根据所得的结果评价裸花紫珠抗炎作用的药效物质基 础。
优选地，步骤(2)中，所述高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱采用十八烷基键合硅胶 填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min， 乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min； 检测器：二极管阵列检测器；检测波长：330nm；柱温：35℃；进样量：10μL。
优选地，所述匹配数大于2的特征峰的保留时间分别为：2.729min、2.895min、3.718min、5.250min、5.722min、6.137min、7.083min、8.363min、9.791min、11.586min、12.796min、 13.909min、14.952min、17.689min、18.495min、19.630min、20.189min、20.919min、22.779min、 23.333min、24.149min、25.018min。
优选的，步骤(3)中所筛选的相关峰峰面积与抗炎药效数据之间进行双变量相关分析和 正交偏最小二乘法分析，并通过多元线性回归建立谱效方程，从而判断裸花紫珠抗炎作用的 物质基础；其中相关色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32与大鼠的足肿胀度呈现出显著相关性，且为负相关关系；
所述色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32的保留时间分别为2.729min、2.895min、5.250min、5.722min、6.137min、7.083min、8.363min、9.791min、13.909min、14.952min、 17.689min、23.333min的色谱峰；
其中，指认色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32分别为梓醇、咖啡 酸、原儿茶酸、原儿茶醛、连翘脂苷E、原儿茶醛同分异构体、连翘脂苷B、芦丁、Alyssonoside、 异毛蕊花糖苷、2′-连翘脂苷B、异鼠李素。
优选地，将色谱峰10、色谱峰12、色谱峰14、色谱峰15和色谱峰16分别引入谱效数学模型中，其中X10代表保留时间为5.722min色谱峰峰面积，X12代表保留时间为6.137min色谱峰峰面积，X14代表保留时间为7.083min色谱峰峰面积，X15代表保留时间为8.363min色谱峰峰面积，X16代表保留时间为9.791min色谱峰峰面积；Y1代表1h时裸花紫珠对大鼠 的抗炎效率，Y3代表3h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，Y4代表4h时裸花紫珠对大鼠的抗炎 效率，Y5代表5h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，Y6代表6h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率， 其中，
Y1＝2.443-0.004*X15，P＝0.012<0.05，R2＝0.830；
Y3＝3.839-0.014*X10，P＝0.004<0.05，R2＝0.004；
Y4＝3.819-0.024*X12，P＝0.003<0.05，R2＝0.913；
Y5＝3.862-0.012*X16，P＝0.022<0.05，R2＝0.776；
Y6＝3.855-0.003*X14，P＝0.000<0.05，R2＝0.964。
优选地，步骤(5)中判断裸花紫珠抗炎作用的物质基础的方法为：特征峰峰面积与药效 数据之间相关性具有显著差异P<0.05的特征峰以及被引入谱效方程的特征峰是裸花紫珠抗炎 作用的物质基础。
优选地，活性成分色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32是裸花紫珠 发挥体内外抗炎作用的物质基础。
优选地，步骤(6)中还包括对多组裸花紫珠提取物相关峰进行主成分分析，筛选对组分 之间极性变化和抗炎效果差异有较大影响的提取物相关峰组分；所述主成分分析方法中，保 留主成分个数计贡献率不低于80％；
C.保留的主成分的特征值必须大于1；
D.再经过KMO检验和Bartlett检验。
优选地，步骤(5)中，还包括进一步利用聚类分析对主成分分析进行验证。
优选地，步骤(5)中，对筛选出的可能物质基础中的部分化合物进行抗炎实验验证。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明利用化学模式识别方法将裸花紫珠提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的 变化和药效的变化建立了相关性，并明确裸花紫珠发挥抗炎作用的成分为主要为苯乙醇苷类、 黄酮类和酚酸类化合物，其次为环烯醚萜类化合物。
(2)本发明建立了基于谱效关系的裸花紫珠发挥抗炎作用的化学成分评价方法，明确了 裸花紫珠中与抗炎药效活性较为密切的化学成分，为裸花紫珠的抗炎作用药效物质基础研究 提供依据，同时采用指纹图谱和数学模型结合的方式避免第三方因素的干扰，避免了动物个 体偏差，能够快捷明确的确定裸花紫珠提取物的抗炎效果评价。
(3)本发明可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有抗炎作用的化学成分及活性成分筛选， 为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
附图说明
图1为本发明的裸花紫珠样品提取物HPLC指纹图谱；
图2为本发明的裸花紫珠不同极性提取物匹配后HPLC指纹图谱；
图3为保留时间为2.729min的色谱峰的紫外扫描图；
图4为保留时间为2.895min的色谱峰的紫外扫描图；
图5为保留时间为5.250min的色谱峰的紫外扫描图；
图6为保留时间为5.722min的色谱峰的紫外扫描图；
图7为保留时间为6.137min的色谱峰的紫外扫描图；
图8为保留时间为7.083min的色谱峰的紫外扫描图；
图9为保留时间为8.363min的色谱峰的紫外扫描图；
图10为保留时间为9.791min的色谱峰的紫外扫描图；
图11为保留时间为13.909min的色谱峰的紫外扫描图；
图12为保留时间为14.952min的色谱峰的紫外扫描图；
图13为保留时间为17.689min的色谱峰的紫外扫描图；
图14为保留时间为23.333min的色谱峰的紫外扫描图；
图15为保留时间为2.729min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图16为保留时间为2.895min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图17为保留时间为5.250min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图18为保留时间为5.722min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图19为保留时间为6.137min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图20为保留时间为7.083min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图21为保留时间为8.363min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图22为保留时间为9.791min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图23为保留时间为13.909min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图24为保留时间为14.952min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图25为保留时间为17.689min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图26为保留时间为23.333min的色谱峰的峰面积与抗炎效果的线性关系图；
图27为本发明OPLS分析结果图；其中，A为提取物散点图，B为特征峰散点图，C为色谱 峰直观图，D为VIP值图；其中，S1代表提取物1，S2代表提取物2，S3代表提取物3，S4 代表提取物4，S5代表提取物5，S6代表提取物6。
图28为本发明聚类分析结果图。
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本 发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂 和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例
1.试验仪器和材料
1.1仪器
1260型高效液相色谱仪；SPSS 22.0统计分析软件；SIMCA 14.1分析软件；FA1004电 子天平；测厚仪；96孔黑板；进口枪头；Synergy H1酶标仪。
1.2材料
裸花紫珠叶样品：采自海南白沙。阿莫西林胶囊购自澳美制药厂；氯化钠购自南京化学 试剂有限公司；醋酸地塞米松片购自浙江仙琚制药股份有限公司；角叉菜胶购自Sigma-Aldrich 公司；Cox Fluorescent Inhibitor Screening Assay Kit购自美国Cayman。
对照品：毛蕊花糖苷和连翘脂苷B对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷 对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；异毛蕊花糖苷对照品上海医药工业研究院中药研 究部实验室提供，所有对照品质量分数均≥98％。
HPLC用乙腈和磷酸为色谱纯，水为自制重蒸水，其余试剂为分析纯。
1.3实验动物
SD大鼠由南通大学实验动物中心提供，全价营养颗粒饲料饲养，自由饮水，室温22℃±2℃，湿度55％～65％。
2.制备裸花紫珠不同极性部位
2.1取裸花紫珠药材粉碎过4号筛，精密称取3份，每份2kg；
取其中1份，置于圆底烧瓶中，加入10倍量体积的水，回流提取2h，提取两次，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥水提取物1。
取其中1份，置于圆底烧瓶中，加入10倍量体积的60％乙醇，回流提取2h，提取两次， 滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥60％醇提物，称为提取物2。
取其中1份，置于圆底烧瓶中，加入10倍量体积的95％乙醇，回流提取2h，提取两次， 滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥95％醇提物，称为提取物3。
2.2取提取物2加水溶解，过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液，减压回收至干，即得60％醇提-水洗提取物，称为提取物4；
再改以40％乙醇继续洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干，得60％醇提-40％醇 洗提取物，称为提取物5；
再改以60％乙醇继续洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干得60％醇提-60％醇洗 提取物，称为提取物6。
3.建立裸花紫珠不同极性提取物的HPLC指纹图谱
3.1供试品溶液的制备
分别取相当于生药量1g的上述提取物1、2、3、4、5、6，精密称定，置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，制得供试品溶液a(提取物1的 溶液)、b(提取物2的溶液)、c(提取物3的溶液)、d(提取物4的溶液)、e(提取物5的 溶液)、f(提取物6的溶液)，(此处把a-f统称为供试品1)。
取裸花紫珠药材60℃真空干燥，粉碎过4号筛，粉末约1g，精密称定，置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50％甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品2。
3.2裸花紫珠指纹图谱的建立：采用高效液相色谱法对以上所得样品进行指纹图谱测定； 色谱条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈； 采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶 液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：UV-DAD；检测波长：330nm； 柱温：35℃；进样量：10μL；
3.3通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大于 2的特征峰，提取特征峰数据：22个匹配数大于2的共有峰的保留时间分别为：2.729min、 2.895min、3.718min、5.250min、5.722min、6.137min、7.083min、8.363min、9.791min、11.586min、 12.796min、13.909min、14.952min、17.689min、18.495min、19.630min、20.189min、20.919min、22.779min、23.333min、24.149min、25.018min。图谱见附图1、2。
3.4方法学考察
3.4.1精密度考察：取裸花紫珠药材粉末1g，精密称定，按“3.1”中供试品溶液2的方法， 制备供试品溶液，按“3.2”中色谱条件连续进样6次，测得各指纹峰的相对保留时间RSD< 0.2％，相对峰面积RSD<1.8％，表明该方法的精密度良好。
3.4.2重复性考察：分别取6份裸花紫珠药材粉末各1g，精密称定，按“3.1”项中供试品溶 液2的方法，制备供试品溶液6份，按“3.2”项色谱条件，依次进样，测得各指纹峰的相对保 留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<2.3％，表明该方法的重复性良好。
3.4.3稳定性考察：取裸花紫珠药材粉末1g，精密称定，按“3.1”项中供试品溶液2的方 法，制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，在0、2、4、6、12和24h分别进样，测得各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<2.7％，表明供试品溶液在24h内稳定。
4.对不同极性提取物进行药效学实验
4.1试剂配制：醋酸地塞米松片：取10片，加75mL蒸馏水溶解为0.1mg.mL-1(现配现用)；裸花紫珠颗粒剂：取10袋颗粒剂，加75mL蒸馏水溶解为0.4g.mL-1；提取物1～6分 别精密称取5g、6g、5g、6g、3g、0.5g浸膏粉分别加90mL、84mL、96mL、106mL、 105mL、138mL蒸馏水溶解为0.2g.mL-1。以上所有试剂均为临床人用剂量(4g.kg-1)的20 倍，均按1mL.100g-1灌胃给药。
4.2抗炎效果检测：取体重180-220g SD大鼠90只，正常饲养3天后，雌雄各半，随机均分9组(n＝10)，分别为：空白对照组、阳性对照药醋酸地塞米松片组、阳性对照药裸花紫珠颗粒组、提取物1组、提取物2组、提取物3组、提取物4组、提取5组、提取物6组。 以上各组大鼠分别灌胃给药7天，末次给药0.5h后，分别在大鼠左后肢足跖皮下注射1％角 叉菜胶混悬液0.1mL每只，致炎后，每隔1h用测厚仪测量足跖厚度，连续6次，计算肿胀 抑制率，实验结果如下表1和表2所示。
表1不同裸花紫珠提取物对角叉菜致大鼠足跖肿胀的影响(x±s)
Figure BDA0003210519030000101
与空白组比较*P<0.05，**P<0.01
表2不同裸花紫珠提取物对角叉菜致大鼠足跖肿胀的抑制率的影响
Figure BDA0003210519030000102
5.谱效相关性分析
5.1方法
5.1.1双变量相关分析
以量化峰面积为自变量，药效指标为因变量，采用SPSS22.0统计软件的双变量相关分析 方法进行数据处理，得到指纹图谱中各相关峰与药效的皮尔森相关系数。
5.1.2偏正交最小二乘法分析
把色谱峰变量(X)和药效数据变量(Y)导入SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares，OPLS)分析，得到色谱峰变量与抗炎药效之间的相关联系。
5.1.3多元线性回归分析
以量化峰面积为自变量，药效指标为因变量，用SPSS 22.0对数据进行线性回归分析， 采用逐步引入法进行模型拟合。
5.1.4PCA分析及ward聚类分析
通过SPSS 22.0PCA分析对裸花紫珠的6种不同提取物的22个相关峰进行PCA分析，从而寻找出相关峰对6种提取物组分组间差异有较大影响且较大累计贡献率的指标，使谱效 关系评价更准确，并且通过ward聚类分析验证PCA分析结果。
5.2结果
5.2.1双变量相关分析结果
如下表3所示，结果显示色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32与大 鼠的足肿胀度呈现出显著相关性，且为负相关关系，相关散点图见附图15～26。结合前期裸 花紫湖化学成分分析，指认色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32分别为 梓醇、咖啡酸、原儿茶酸、原儿茶醛、连翘脂苷E、原儿茶醛同分异构体、连翘脂苷B、芦 丁、Alyssonoside、异毛蕊花糖苷、2′-连翘脂苷B、异鼠李素。同时提供了鉴定出成分的二级 裂解相关数据，如下表4所示。
表3相关峰峰面积与大鼠足肿胀度之间的双变量相关分析结果
Figure BDA0003210519030000111
Figure BDA0003210519030000121
*P<0.05，**P<0.01
表4鉴定出成分的质谱数据
Figure BDA0003210519030000122
Figure BDA0003210519030000131
5.2.2 OPLS分析结果
结果如下图27所示。图27A Score Scatter Plot(提取物散点图)分析结果与药理实验结果联 系分析，从图中可清楚看到药效最好的提取物1单独分布在一个区域，药效次之的提取物2、 3分布在一个区域，提取物5药效与提取物2和3差异不大虽分布在另一区域但与提取物2 和3相距较近，药效最差的提取物4和6分布在同一区域且大部分重合。图27BLoading Scatter Plot图(特征峰散点图)表征了所有X变量对Y变量的影响，即各色谱峰对不同时间段大鼠 足肿胀度的影响。X变量若与Y变量在同一象限为正相关，若在相对象限为负相关，且X变 量离原点越远表示相关越好。从图中可以看出除了6h与2h出现部分正相关外，其余时间点 均为负相关且相关性较高，对于6h和2h出现的正相关具体原因还有待研究。图27C Coefficient P verview Plot图(色谱峰直观图)直观展示了不同时间段内各个色谱峰对大鼠足 肿胀度的影响，柱高表示相关系数，X轴上方为正相关，下方为负相关。图27D VIP值图是 OPLS分析中常用的评价变量贡献度大小的常用表达之一，通常VIP>1的X变量如图中标红 部分对于Y变量的影响是显著的，具有统计学意义，具有显著贡献的色峰峰分别为1、2、9、 10、12、14、15、16、21、22、24、32，与双变量分析结果一致。
5.2.3多元线性回归分析结果
如下表5所示，可以发现色谱峰10、12、14、15和16分别以不同程度被引入抗炎谱效方程，且建立的所有谱效方程P值均小于0.05。说明模型能较好的评价裸花紫珠色谱峰与抗炎药理活性之间的关系。
表5数学模型建立结果
Figure BDA0003210519030000141
综合以上两种分析法的分析结果，基本能够确定裸花紫珠发挥抗炎作用的成分为主要为 苯乙醇苷类、黄酮类和酚酸类化合物，其次为环烯醚萜类化合物。色谱峰1(梓醇)、2(咖 啡酸)、9(原儿茶酸)、10(原儿茶醛)、12(连翘脂苷E)、14(原儿茶醛同分异构体)、15(连翘脂苷B)、16(芦丁)、21(Alyssonoside)、22(异毛蕊花糖苷)、24(2′-乙酰基连翘脂 苷B)、32(异鼠李素)是裸花紫珠发挥抗炎药效的物质基础。
5.2.4PCA分析及ward聚类分析结果
分析结果如表6所示，保留主成分个数累计贡献率>80％、特征值>1、经过KMO(越接近1越适合PCA分析)和Bartlett检验(P<0.01)的成分。
表6主成分分析结果
Figure BDA0003210519030000142
从上述主成分分析能够确定3个主要成分，其中第一主成分贡献率69.028％，第二主成 分贡献率20.598％，第三主成分贡献率7.223％，三个主成分的累计贡献率为96.849％，即这 三个主成分累计解释了总变异的96.849％。另外，通过成分矩阵，如下表7所示，可以看到 成分1应该是以木犀草苷、毛蕊花糖苷及异毛蕊花糖苷为主的黄酮类化合物和苯乙醇苷类化 合物，成分2应该是以峰2(咖啡酸)、5为主的酚酸类小分子化合物，成分3应该是以峰1 (梓醇)为主的环烯醚萜类化合物。再结合Score Scatter plot分析结果，可认为提取物1、2、 3及5中含有大量黄酮类化合物、苯乙醇苷类化合物以及酚酸类化合物，其中三者的含量或 比例不同造成药效结果的差异，提取物4和6中含有大量环烯醚萜类化合物以及其他化合物， 故药效较差。
表7成分矩阵结果
Figure BDA0003210519030000151
随后利用SPSS 22.0软件中的ward法聚类分析法对主成分分析进行验证，分析结果如图 28所示。药效较好的提取物1、3、2、5聚成一类，药效较差的提取物4和6聚为一类，图中显示结果与PCA分析结果基本一致，说明PCA分析结果可靠。
对环氧化酶(COX)抗炎活性的验证
对裸花紫珠的6中不同提取物以及其中3个(2′-乙酰基连翘脂苷B、连翘脂苷B和Alyssonoside)筛选出的物质基础化学成分进行对环氧化酶(COX)抗炎活性的验证，根据试剂盒说明书，配制不同浓度梯度的待测样品，检测加入样品后荧光强度的改变，从而得到不同样品对COX-1和COX-2的抑制率和IC50。计算公式为：
Figure BDA0003210519030000161
结果显示裸花紫珠不同提取工艺及其活性化合物2′-乙酰基连翘脂苷B、连翘脂苷B及 Alyssonoside对环氧合酶(COX)的催化前列腺素生物合成具有活性作用，抑制COX-2的作 用比COX-1强。提取物4作用较弱，提取物5和提取物3显示较强的作用，如下表8所示。IC50检测结果显示2′-乙酰基连翘酯苷B和连翘酯苷B具有很强活性，似乎明显优于提取物，Alyssonoside活性与提取物效果相近，而提取物又明显优于裸花紫珠颗粒，如下表9所示。
表8环氧合酶(COX-1和COX-2)抑制结果
Figure BDA0003210519030000162
表9 IC50对环氧合酶(COX-1和COX-2)的影响
Figure BDA0003210519030000171
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本 发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范 围内。

Claims (13)

1.一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，包括以下步骤：
(1)通过建立裸花紫珠提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选出匹配数大于2的特征峰为相关峰；
(2)根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和抗炎效果建立相应的谱效关系；
(3)利用所建立的谱效关系评价裸花紫珠的抗炎效果。
2.如权利要求1所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，所述裸花紫珠提取物的制备方法为：
S1：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量水；回流提取，过滤，减压干燥，制得水提取物；
S2：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的60％乙醇；回流提取，过滤，减压干燥，制得60％醇提取物，用水溶解后过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收，干燥，得60％醇提-水洗提取物；
再用40％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥，得60％醇提-40％醇洗提取物；
再用60％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥，得60％醇提-60％醇洗提取物；
S3：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的95％乙醇；回流提取，过滤，减压干燥，制得95％醇提取物。
3.如权利要求2所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，S1、S2、S3中所述回流提取的时间均为1-5h，优选为2h；S1、S2、S3中所述提取的次数均为1-3次，优选为2次。
4.如权利要求2所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分评价方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相当于生药量1g的水提物、60％醇提取物、60％醇提-水洗提取物、60％醇提-40％醇洗提取物、60％醇提-60％醇洗提取物、95％醇提取物；分别置于具塞茄形瓶中，加入50％甲醇50mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)使用高效液相色谱对供试品溶液进行测定，建立裸花紫珠供试品的HPLC指纹图谱；
(3)通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大于2的特征峰，提取特征峰数据；
(4)使用角叉菜胶混悬液建立大鼠炎症模型进行抗炎实验，检测各提取物的抗炎效果；
(5)将步骤(3)中所提取的特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分析并代入谱效数学模型中进行计算，并根据所得的结果评价裸花紫珠抗炎作用的药效物质基础。
5.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：330nm；柱温：35℃；进样量：10μL。
6.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，所述匹配数大于2的特征峰的保留时间分别为：2.729min、2.895min、3.718min、5.250min、5.722min、6.137min、7.083min、8.363min、9.791min、11.586min、12.796min、13.909min、14.952min、17.689min、18.495min、19.630min、20.189min、20.919min、22.779min、23.333min、24.149min、25.018min。
7.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(3)中所筛选的相关峰峰面积与抗炎药效数据之间进行双变量相关分析和正交偏最小二乘法分析，并通过多元线性回归建立谱效方程，从而判断裸花紫珠抗炎作用的物质基础；其中相关色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32与大鼠的足肿胀度呈现出显著相关性，且为负相关关系；
所述色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32的保留时间分别为2.729min、2.895min、5.250min、5.722min、6.137min、7.083min、8.363min、9.791min、13.909min、14.952min、17.689min、23.333min的色谱峰；
其中，指认色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32分别为梓醇、咖啡酸、原儿茶酸、原儿茶醛、连翘脂苷E、原儿茶醛同分异构体、连翘脂苷B、芦丁、Alyssonoside、异毛蕊花糖苷、2′-连翘脂苷B、异鼠李素。
8.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，将色谱峰10、色谱峰12、色谱峰14、色谱峰15和色谱峰16分别引入谱效数学模型中，其中X10代表保留时间为5.722min色谱峰峰面积，X12代表保留时间为6.137min色谱峰峰面积，X14代表保留时间为7.083min色谱峰峰面积，X15代表保留时间为8.363min色谱峰峰面积，X16代表保留时间为9.791min色谱峰峰面积；Y1代表1h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，Y3代表3h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，Y4代表4h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，Y5代表5h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，Y6代表6h时裸花紫珠对大鼠的抗炎效率，其中，
Y1＝2.443-0.004*X15，P＝0.012<0.05，R2＝0.830；
Y3＝3.839-0.014*X10，P＝0.004<0.05，R2＝0.004；
Y4＝3.819-0.024*X12，P＝0.003<0.05，R2＝0.913；
Y5＝3.862-0.012*X16，P＝0.022<0.05，R2＝0.776；
Y6＝3.855-0.003*X14，P＝0.000<0.05，R2＝0.964。
9.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(5)中判断裸花紫珠抗炎作用的物质基础的方法为：特征峰峰面积与药效数据之间相关性具有显著差异P<0.05的特征峰以及被引入谱效方程的特征峰是裸花紫珠抗炎作用的物质基础。
10.如权利要求7所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，活性成分色谱峰1、2、9、10、12、14、15、16、21、22、24、32是裸花紫珠发挥体内外抗炎作用的物质基础。
11.如权利要求10所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(6)中还包括对多组裸花紫珠提取物相关峰进行主成分分析，筛选对组分之间极性变化和抗炎效果差异有较大影响的提取物相关峰组分；所述主成分分析方法中，保留主成分个数计贡献率不低于80％；
A.保留的主成分的特征值必须大于1；
B.再经过KMO检验和Bartlett检验。
12.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(5)中，还包括进一步利用聚类分析对主成分分析进行验证。
13.如权利要求4所述的具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(5)中，对筛选出的化合物进行抗炎实验验证。
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