CN113702557A - 一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法 - Google Patents

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CN113702557A CN202110923218.4A CN202110923218A CN113702557A CN 113702557 A CN113702557 A CN 113702557A CN 202110923218 A CN202110923218 A CN 202110923218A CN 113702557 A CN113702557 A CN 113702557A
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Abstract

本发明涉及到一种评价中药化学成分药效活性的方法，具体涉及一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法。包括以下步骤：(1)通过建立裸花紫珠提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选出匹配数大于2的特征峰为相关峰；(2)根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和止血凝血效果建立相应的谱效关系；(3)利用所建立的谱效关系评价裸花紫珠的止血凝血效果。该方法可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有止血凝血作用的化学成分，进行活性成分筛选，为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。

Description

一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法
技术领域
本发明涉及到一种评价中药化学成分药效活性的方法，具体涉及一种具有止血凝血作用 的裸花紫珠有效成分的评价方法。
背景技术
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)为马鞭草科紫珠属植物，裸花紫珠叶为药 用，全年均可采收，是一种常用的海南地区的传统民族药，由于其生长在海南黎族地区，故 也称为黎药。裸花紫珠其化学成分主要为黄酮类、苯乙醇苷类、萜类及挥发油类等，具有消 炎、解毒、收敛、止血的功能，用于化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、 创伤出血等。据《本草拾遗》记载裸花紫珠能解诸毒物，痈疽，喉痹，毒肿，下瘘，蛇虺虫 螫，狂犬毒，并煮汁服；亦煮汁洗疮肿，除血长肤。
中药谱效关系是在中医理论指导下，将中药指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行 关联，建立以化学分析与生物活性评价相结合的综合评价体系，有助于揭示中药药效的物质 基础，已成为中药有效成分预测和质量评价的方法之一。
中药指纹图谱能够揭示中药的化学成分，在整体上评价中药的质量，具有特征性、专属 性、稳定性和完整性等特点。但指纹图谱的研究与建立只是对中药化学成分的稳定性和可控 性实现改进，而没有与中药的药效建立直接的内在联系。谱效关系的研究建立在指纹图谱的 基础上，指纹图谱提供了复杂体系的化学成分信息，药理学研究提供了其活性信息，谱效关 系的研究使二者有效结合，更可靠地揭示中药药效的物质基础。目前谱效关系的研究方法有 相关性分析、回归分析、主成分分析、灰色关联度分析、聚类分析和典型相关分析。
如中国专利申请CN111458447A公开了一种基于谱效关系的枸杞质量检测方法。包括有 以下步骤：(1)枸杞药材HPLC指纹图谱建立；(2)枸杞抗疲劳及提高免疫的药效研究；(3)枸杞 指纹图谱与药效指标谱效关系的建立；(4)基于枸杞的谱效关系建立质量评价标准检测枸杞质 量。本发明具有将枸杞的指纹图谱与其抗疲劳及提高免疫进行谱效相关性研究，获得可通过 其指纹图谱以直接预测其抗疲劳及提高免疫活性，从而用于判断枸杞质量优劣的有益效果。
中国专利申请CN111443153A公开了一种基于谱效关系的金银花质量检测方法。(1)金银 花HPLC指纹图谱的建立：(2)金银花抗炎作用研究：(3)金银花指纹图谱与抗炎谱效关系的建 立：(4)基于金银花的谱效关系建立质量评价标准检测金银花质量。本发明具有将金银花的指 纹图谱与其抗炎作用进行谱效相关性研究，获得可通过其指纹图谱以直接预测其抗炎活性， 从而用于判断金银花质量优劣的特点。
虽然现有技术中存在基于谱效关系的药物有效成分检测方法，但是药物的种类、有效成 分的提取方法及谱效关系的建立均对质量检测的结果具有较大的影响，并非所有的药物有效 成分的检测均适用谱效关系的评价方法，需要根据具体药物选择合适的评价过程，才能较为 准确的判断药效物质。
本发明旨在以裸花紫珠不同提取部位的HPLC指纹图谱为基础，通过双变量相关分析和 回归分析，考察裸花紫珠发挥止血凝血药效活性的谱效关系，建立裸花紫珠止血凝血作用物 质评价方法。该方法能够准确的判定裸花紫珠中对小鼠的止血凝血作用的药效物质，该评价 方法比较简单、快速。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价 方法，可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有止血凝血作用的化学成分，进行活性成分筛选， 为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，包括以下步骤：
(1)通过建立裸花紫珠提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选 出匹配数大于2的特征峰为相关峰；
(2)根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和止血凝血效果建立相应的谱效关系；
(3)利用所建立的谱效关系评价裸花紫珠的止血凝血效果。
优选地，所述裸花紫珠提取物的制备方法为：
S1：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量水；回流提取，过滤，减压干燥，制得 水提取物；
S2：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的60％乙醇；回流提取，过滤，减压干 燥，制得60％醇提取物，用水溶解后过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收，干燥，得60％醇提-水洗提取物；
再用40％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥，得60％醇提-40％醇洗提取物；
再用60％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥，得60％醇提-60％醇洗提取物；
S3：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的95％乙醇；回流提取，过滤，减压干 燥，制得95％醇提取物。
优选地，S1、S2、S3中所述回流提取的时间均为1-5h，优选为2h；
优选地，S1、S2、S3中所述提取的次数均为1-3次，优选为2次。
优选地，具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分评价方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相当于生药量1g的水提取物、60％醇提取物、60％醇提-水洗提取物、60％ 醇提-40％醇洗提取物、60％醇提-60％醇洗提取物、95％醇提取物；分别置于具塞茄形瓶中， 加入50％甲醇50mL，溶解，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)使用高效液相色谱(HPLC)对供试品溶液进行测定，建立裸花紫珠供试品的HPLC 指纹图谱；
(3)通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大 于2的特征峰，提取特征峰数据；
(4)对小鼠灌服水提取物、60％醇提取物、60％醇提-水洗提取物、60％醇提-40％醇洗提 取物、60％醇提-60％醇洗提取物、95％醇提取物；每天灌服，持续7天，检测各提取物对小 鼠止血时间和凝血时间的影响，获得药效活性数据；
(5)将所提取的特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分析并代入谱效 数学模型中进行计算，并根据所得的结果评价裸花紫珠止血凝血作用的药效物质基础。
优选地，步骤(2)中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈；采用梯 度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶液： 18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：330nm； 柱温：35℃；进样量：10μL。
优选地，步骤(3)中，所述匹配数大于2的特征峰的保留时间分别为：2.729min，2.911min， 3.738min，5.246min，5.775min，6.137min，7.079min，8.363min，9.790min，11.586min，12.810min， 13.717min，14.992min，17.755min，18.584min，20.298min，21.021min，22.862min，24.218min， 25.078min。
优选地，对(3)中所提取的相关峰的峰面积与止血凝血药效数据之间进行相关性分析， 并通过多元线性回归建立谱效方程，从而判断裸花紫珠止血凝血作用的物质基础；
其中，色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和29与小鼠的止血时间与凝血时 间呈较好的负相关关系；
所述色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和29的保留时间分别为9.790min，11.586min，12.810min，17.755min，18.584min，20.298min，21.021min，22.862min，24.218min， 25.078min；
其中，指认峰13为芦丁、峰15为毛蕊花糖苷、峰16为木犀草苷、峰21为2’-乙酰基金石蚕苷、峰22为2’-乙酰基毛蕊花糖苷、峰24为Alyssonoside、峰25为木犀草素、峰26 为槲皮素、峰28为芹菜素、峰29为异鼠李素。
优选地，将峰21和峰25分别引入谱效数学模型中，X21代表保留时间为17.755min色谱 峰峰面积，X25代表保留时间为21.021min色谱峰峰面积；Y止血、Y凝血代表裸花紫珠的止血凝血作用效率。
Y止血＝91.433-0.200*X21；R2＝0.993；
Y凝血＝70.387-0.622*X25；R2＝0.968。
优选地，裸花紫珠止血凝血作用的物质基础是峰面积与药效数据之间相关性具有显著差 异P<0.05的特征峰以及被引入谱效方程的特征峰。
优选地，裸花紫珠发挥止血凝血作用的物质基础为活性成分色谱峰13、15、16、21、22、 24、25、26、28和29；
优选地，所述发挥止血凝血作用的活性化合物为色谱峰为21和25的物质。
优选地，步骤(5)中，还包括对多组裸花紫珠提取物相关峰进行主成分分析，筛选对组 分之间极性变化和收敛效果差异有较大影响的提取物相关峰组分；所述主成分分析方法中：
保留主成分个数计贡献率不低于80％；
保留的主成分的特征值必须大于1；
再经过KMO检验和Bartlett检验。
优选地，步骤(5)中，还包括进一步利用聚类分析对主成分分析进行验证。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明利用化学模式识别方法将裸花紫珠提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的 变化和药效的变化建立了相关性，并明确裸花紫珠中对小鼠的止血凝血作用的药效物质基础 主要是苯乙醇苷类化合物和黄酮类化合物。
(2)本发明建立了基于谱效关系的裸花紫珠化学成分评价方法，明确了裸花紫珠中与止 血凝血药效活性较为密切相关的化学成分，为裸花紫珠的止血凝血作用药效物质基础研究提 供依据，同时采用指纹图谱和数学模型结合的方式避免第三方因素的干扰，避免了动物个体 偏差，能够快捷明确的确定裸花紫珠提取物的止血凝血效果评价。
(3)本发明可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有止血凝血作用的化学成分及活性成分 筛选，为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
附图说明
图1为本发明的裸花紫珠样品提取物HPLC指纹图谱；
图2为本发明的裸花紫珠不同极性提取物匹配后HPLC指纹图谱；
图3为保留时间为9.790min的色谱峰的紫外扫描图；
图4为保留时间为11.586min的色谱峰的紫外扫描图；
图5为保留时间为12.810min的色谱峰的紫外扫描图；
图6为保留时间为17.755min的色谱峰的紫外扫描图；
图7为保留时间为18.584min的色谱峰的紫外扫描图；
图8为保留时间为20.298min的色谱峰的紫外扫描图；
图9为保留时间为21.021min的色谱峰的紫外扫描图；
图10为保留时间为22.862min的色谱峰的紫外扫描图；
图11为保留时间为24.218min的色谱峰的紫外扫描图；
图12为保留时间为25.078min的色谱峰的紫外扫描图；
图13为保留时间为9.790min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图14为保留时间为11.586min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图15为保留时间为12.810min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图16为保留时间为17.755min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图17为保留时间为18.584min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图18为保留时间为20.298min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图19为保留时间为21.021min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图20为保留时间为22.862min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图21为保留时间为24.218min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图22为保留时间为25.078min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图23为裸花紫珠不同提取物的PCA主成分分析图；
图24为主成分的ward法聚类分析验证图。
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本 发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂 和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例
1.试验仪器和材料
1.1仪器
1260型高效液相色谱仪；SPSS 22.0软件进行统计分析。FA1004电子天平。
1.2材料
裸花紫珠叶样品：采自海南白沙。阿莫西林胶囊购自澳美制药厂；伊文思蓝购自上海惠 诚生物科技有限公司。
对照品：毛蕊花糖苷和连翘脂苷B对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷 对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；异毛蕊花糖苷对照品上海医药工业研究院中药研 究部实验室提供，所有对照品质量分数均≥98％。
HPLC用乙腈和磷酸为色谱纯，水为自制重蒸水，其余试剂为分析纯。
1.3实验动物
ICR小鼠，雌雄各半，18-22g，由江苏南通大学提供，以全价营养颗粒饲料饲养，自由 饮水，室温22±2℃，湿度55％-65％。
2.制备裸花紫珠不同极性部位
2.1取裸花紫珠粉碎过4号筛，精密称取3份，每份2kg；
取其中一份，置于圆底烧瓶中，加入10倍量体积的水，回流提取2h，提取两次，滤过， 合并两次提取的滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥水提取物1；
取其中一份，置于圆底烧瓶中，加入10倍量体积的60％乙醇，回流提取2h，提取两次， 滤过，合并两次提取的滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥60％醇提取物2；
取其中一份，置于圆底烧瓶中，加入10倍量体积的95％乙醇，回流提取2h，提取两次， 滤过，合并两次提取的滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥95％醇提取物3。
2.2取提取物2加水溶解，过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液，减压回收至干，即得60％醇提-水洗提取物，称为提取物4；
再改以40％乙醇继续洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干，得60％醇提-40％醇 洗提取物，称为提取物5；
再改以60％乙醇继续洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干得60％醇提-60％醇洗 提取物，称为提取物6。
3.建立裸花紫珠不同极性提取物的HPLC指纹图谱
3.1供试品溶液的制备
分别取相当于生药量1g的提取物1、2、3、4、5、6，精密称定，分别置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液a(提取物1的 溶液)、b(提取物2的溶液)、c(提取物3的溶液)、d(提取物4的溶液)、e(提取物5的 溶液)、f(提取物6的溶液)，(这里把a-f统称为供试品1)。
取裸花紫珠药材60℃真空干燥，粉碎过4号筛，粉末约1g，精密称定，置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50％甲醇 补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品2。
3.2裸花紫珠指纹图谱的建立：采用高效液相色谱法对以上所得样品进行指纹图谱测定； 色谱条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈； 采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸 溶液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：UV-DAD；检测波长：330nm； 柱温：35℃；进样量：10μL；
3.3通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大 于2的特征峰，提取特征峰数据：21个匹配数大于2的共有峰的保留时间分别为：2.729min， 2.911min，3.738min，5.246min，5.775min，6.137min，7.079min，8.363min，9.790min，11.586min， 12.810min，13.717min，14.992min，17.755min，18.584min，20.298min，21.021min，22.862min， 24.218min，25.078min。
3.4方法学考察
3.4.1精密度考察：取裸花紫珠药材粉末1g，精密称定，按“3.1”中供试品溶液2的方 法，制备供试品溶液，按“3.2”中色谱条件连续进样6次，测得各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<1.8％，表明该方法的精密度良好。
3.4.2重复性考察：分别取6份裸花紫珠药材粉末各1g，精密称定，按“3.1”项中供试 品溶液2的方法，制备供试品溶液6份，按“3.2”项色谱条件，依次进样，测得各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<2.3％，表明该方法的重复性良好。
3.4.3稳定性考察：取裸花紫珠药材粉末1g，精密称定，按“3.1”项中供试品溶液2的 方法，制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，在0、2、4、6、12和24h分别进样，测得 各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<2.7％，表明供试品溶液在24h内 稳定。
4.对不同极性提取物进行药效学实验
4.1取体重为18～22g的小鼠180只，雌雄各半，随机均分18组(n＝10)，分别编号为： 空白对照组ab、阳性对照药肾上腺色腙片组ab、阳性对照药裸花紫珠颗粒组ab、提取物1 组ab、提取物2组ab、提取物3组ab、提取物4组ab、提取物5组ab、提取物6组ab。
4.2实验室条件下喂养小鼠一周后，按等生药量(0.2ml/10g)每天分别灌胃给药1次，持 续7天(空白对照组用生理盐水灌胃，其它组以相应药物灌胃)，于第7天末次灌胃30min 后，将a组以利剪将小鼠尾尖0.5cm处横断，待血液自然流出后计时，每隔15s用滤纸吸去 血滴1次，直至血液自然停止，记录止血时间。将b组采用玻片法，用眼科弯镊迅速摘去一 侧眼球，在玻片两端各滴1滴血，血滴直径约5mm，每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向内轻轻挑动1次，以有血丝挑起时间为凝血时间，另1滴血供复检用，与对照组进行显著性比较。结果如下表1所示。
表1小鼠止血凝血时间结果表
Figure BDA0003208214860000091
注：与空白组比较，*p<0.05,**p<0.01。
5.谱效相关性分析
5.1方法
5.1.1双变量相关分析
以量化峰面积为自变量，药效指标为因变量，采用SPSS22.0统计软件的双变量相关分析 方法进行数据处理，得到指纹图谱中各相关峰与药效的皮尔森相关系数。
5.1.2多元线性回归分析
以量化峰面积为自变量，药效指标为因变量，用SPSS 22.0对数据进行线性回归分析， 采用逐步引入法进行模型拟合。
5.1.3 PCA分析及ward聚类分析
通过SPSS 22.0PCA分析对裸花紫珠的6种不同提取物的21个相关峰进行PCA分析，从而寻找出相关峰对6种提取物组分组间差异有较大影响且较大累计贡献率的指标，使谱效 关系评价更准确，并且通过ward聚类分析验证PCA分析结果。
5.2结果
5.2.1双变量相关分析结果
如下表2所示，相关色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和29与小鼠的止血 时间与凝血时间呈较好的负相关关系。即保留时间为9.790min，11.586min，12.810min，17.755min，18.584min，20.298min，21.021min，22.862min，24.218min，25.078min。并且指认峰13为芦丁、峰15为毛蕊花糖苷、峰16为木犀草苷、峰21为2’-
乙酰基金石蚕苷、峰22为2’-乙酰基毛蕊花糖苷、峰24为Alyssonoside、峰25为木犀 草素、峰26为槲皮素、峰28为芹菜素、峰29为异鼠李素。质谱数据详见表3。
Figure BDA0003208214860000111
Figure BDA0003208214860000121
表3鉴定出成分的质谱数据
Figure BDA0003208214860000131
5.2.2多元线性回归分析结果
如下表4，可以发现色谱峰21、25分别与其止血凝血作用的两个指标止血时间和凝血时 间二者所建立的模型相关系数较高，R2均大于0.90说明止血时间及凝血时间的改变90％以上 能够通过自变量解释，P值均小于0.05具有统计学意义，说明模型能较好的评价裸花紫珠色 谱峰与止血凝血药理活性之间的关系。
表4数学模型建立结果
Figure BDA0003208214860000132
综合以上两种分析法的分析结果，基本能够确定裸花紫珠发挥止血凝血作用的成分为苯 乙醇苷类化合物和黄酮类化合物。活性成分色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和 29是裸花紫珠发挥止血凝血作用的物质基础，其中色谱峰13为芦丁、峰15为毛蕊花糖苷、 峰16为木犀草苷、峰21为2’-乙酰基金石蚕苷、峰22为2’-乙酰基毛蕊花糖苷、峰24为Alyssonoside、峰25为木犀草素、峰26为槲皮素、峰28为芹菜素、峰29为异鼠李素。
5.2.3 PCA分析及ward聚类分析结果
分析结果如表5所示，保留主成分个数累计贡献率>80％、特征值>1、经过KMO(越接近1越适合PCA分析)和Bartlett检验(P<0.01)的成分。
表5主成分分析结果
Figure BDA0003208214860000141
对主成分确定数量的方法主要基于三点,1)要保留的主成分个数累计贡献率不得低于 80％；2)保留的主成分特征值必须大于1；3)经过KMO检验(越接近1越适合PCA因子 分析)和Bartlett检验(显著性<0.01)。总共可以确定2个主成分。其中，第1主成分贡献率 为64.988％；第2主成分贡献率为22.002％。2个主成分的累积贡献率达到86.991％，符合主成分确定要求。利用SPSS 22.0主成分分析实现6种提取物的PCA荷载成分图分析，如附图24所示，从图中可以看到提取物4和6聚为一类，提取物1、3、2、5聚成一类，同时可明 显看到提取物4、6对主成分2有显著影响，提取物2有略微影响；提取物1、3对主成分1 有显著影响，提取物5有略微影响。
随后利用SPSS 22.0软件中的ward法聚类分析法对主成分分析进行验证，如附图24所 示，提取物4和6聚为一类，提取物1、3、2、5聚成一类，图中显示结果与PCA分析结果 基本一致，说明PCA分析结果可靠。结合各提取物的21个相关峰峰面积和pearson相关分析 结果，可确认成分1是苯乙醇苷类化合物及黄酮类化合物，成分2是酚酸类化合物。提取物 4、6及2中含有较多酚酸类成分，提取物1、3及5中含有较多黄酮类及苯乙醇苷类成分。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本 发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范 围内。

Claims (13)

1.一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，包括以下步骤：
(1)通过建立裸花紫珠提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选出匹配数大于2的特征峰为相关峰；
(2)根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和止血凝血效果建立相应的谱效关系；
(3)利用所建立的谱效关系评价裸花紫珠的止血凝血效果。
2.如权利要求1所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，所述裸花紫珠提取物的制备方法为：
S1：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量水；回流提取，过滤，减压干燥，制得水提取物；
S2：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的60％乙醇；回流提取，过滤，减压干燥，制得60％醇提取物，用水溶解后过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收，干燥，得60％醇提-水洗提取物；
再用40％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收，干燥，得60％醇提-40％醇洗提取物；
再用60％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收，干燥，得60％醇提-60％醇洗提取物；
S3：取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，加入5-10倍量的95％乙醇；回流提取，过滤，减压干燥，制得95％醇提取物。
3.如权利要求2所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，S1、S2、S3中所述回流提取的时间均为1-5h，优选为2h；S1、S2、S3中所述提取的次数均为1-3次，优选为2次。
4.如权利要求2所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分评价方法，包括以下步骤：
(1)分别称取相当于生药量1g的水提取物、60％醇提取物、60％醇提-水洗提取物、60％醇提-40％醇洗提取物、60％醇提-60％醇洗提取物、95％醇提取物；分别置于具塞茄形瓶中，加入50％甲醇50mL，溶解，滤过，取续滤液，得供试品溶液；
(2)使用高效液相色谱(HPLC)对供试品溶液进行测定，建立裸花紫珠供试品的HPLC指纹图谱；
(3)通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大于2的特征峰，提取特征峰数据；
(4)对小鼠灌服水提取物、60％醇提取物、60％醇提-水洗提取物、60％醇提-40％醇洗提取物、60％醇提-60％醇洗提取物、95％醇提取物；检测各提取物对小鼠止血时间和凝血时间的影响，获得药效活性数据；
(5)将所提取的特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分析并代入谱效数学模型中进行计算，并根据所得的结果评价裸花紫珠止血凝血作用的药效物质基础。
5.如权利要求4所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：330nm；柱温：35℃；进样量：10μL。
6.如权利要求4所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(3)中所述匹配数大于2的特征峰的保留时间分别为：2.729min，2.911min，3.738min，5.246min，5.775min，6.137min，7.079min，8.363min，9.790min，11.586min，12.810min，13.717min，14.992min，17.755min，18.584min，20.298min，21.021min，22.862min，24.218min，25.078min。
7.如权利要求4所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，对(3)中所提取的相关峰的峰面积与止血凝血药效数据之间进行相关性分析，并通过多元线性回归建立谱效方程，从而判断裸花紫珠止血凝血作用的物质基础；
其中，色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和29与小鼠的止血时间与凝血时间呈较好的负相关关系；
所述色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和29的保留时间分别为9.790min，11.586min，12.810min，17.755min，18.584min，20.298min，21.021min，22.862min，24.218min，25.078min；
其中，指认峰13为芦丁、峰15为毛蕊花糖苷、峰16为木犀草苷、峰21为2’-乙酰基金石蚕苷、峰22为2’-乙酰基毛蕊花糖苷、峰24为Alyssonoside、峰25为木犀草素、峰26为槲皮素、峰28为芹菜素、峰29为异鼠李素。
8.如权利要求7所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，将峰21和峰25分别引入谱效数学模型中，X21代表保留时间为17.755min色谱峰峰面积，X25代表保留时间为21.021min色谱峰峰面积；Y止血、Y凝血代表裸花紫珠的止血凝血作用效率，其中，
Y止血＝91.433-0.200*X21；R2＝0.993；
Y凝血＝70.387-0.622*X25；R2＝0.968。
9.如权利要求7所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，裸花紫珠止血凝血作用的物质基础是峰面积与药效数据之间相关性具有显著差异P<0.05的特征峰以及被引入谱效方程的特征峰。
10.如权利要求7所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，裸花紫珠发挥止血凝血作用的物质基础为活性成分色谱峰13、15、16、21、22、24、25、26、28和29。
11.如权利要求10所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，所述发挥止血凝血作用的活性化合物为色谱峰为21和25的物质。
12.如权利要求7所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(5)中，还包括对多组裸花紫珠提取物相关峰进行主成分分析，筛选对组分之间极性变化和收敛效果差异有较大影响的提取物相关峰组分；所述主成分分析方法中：
保留主成分个数计贡献率不低于80％；
保留的主成分的特征值必须大于1；
再经过KMO检验和Bartlett检验。
13.如权利要求7所述的具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法，其特征在于，步骤(5)中，还包括进一步利用聚类分析对主成分分析进行验证。
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