CN106501397A - 骨疏康制剂hplc指纹图谱的建立方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种采取高效液相色谱构建骨疏康指纹图谱的方法及其标准指纹图谱，包括建立标准对照指纹图谱、测定待检样品指纹图谱、将标准对照指纹图谱和待检样品指纹图谱进行比对。本发明所建立的骨疏康指纹图谱能有效的表征其质量，有利于全面监控产品的质量；本发明建立的骨疏康指纹图谱中含有10个共有峰，建立的指纹图谱技术含量高，避免了骨疏康制剂质量控制的单一性和片面性，保证了药品的安全、有效、质量可控性。

Description

骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法与用途

技术领域

本发明涉及一种中药制剂指纹图谱的构建方法，尤其是骨疏康制剂高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于天然产物分析技术领域。

背景技术

骨疏康颗粒、骨疏康胶囊是由多种天然中药材经精工制作而成的中医复方制剂，具有补肾益气，活血壮骨的功效，临床用于肾虚，气血不足所致的中老年骨质疏松症。自骨疏康制剂上市以来，因其治疗效果好，见效快，价格便宜，受到了广大患者的好评。其主要成分包括淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪、丹参、木耳、黄瓜子，现代药理研究已证明其含有多种生物活性物质。现有骨疏康制剂的质量标准仅对其主要成分淫羊藿苷进行定量检测，对于成分复杂、有效成分尚不十分明确的中成药来说，单靠测定某种有效成分解决质量检测和产品批次间质量差异的问题是远远不够的。

为提高测定骨疏康制剂的有效成分及其含量的准确性，发明人对骨疏康制剂的质量控制技术做了更加深入的研究，采用目前国际公认的同时具备实用性和科学性的天然植物制品指纹图谱技术，通过高效液相色谱法(HPLC)对骨疏康制剂进行指纹图谱的研究，建立标准指纹图谱，达到准确反映骨疏康产品中所含化学成分的种类与数量的目的，进而对其中有效成分进行科学的鉴别和测定的目的。目前，尚无骨疏康制剂指纹图谱研究工作的报道。

本发明提供一种检测更加准确、操作更加便捷、快速的骨疏康指纹图谱的测定方法。弥补了现有骨疏康产品质量控制技术的不足，使其质量控制更加完善和科学，达到控制骨疏康产品质量和监控药品安全生产的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种骨疏康制剂指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，弥补现有骨疏康产品质量控制技术的不足，使其质量控制更加完善和科学，达到控制骨疏康产品质量和监控药品安全生产的目的。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

1)骨疏康制剂供试品溶液的配制：精密称定本品1.0g，研细，加甲醇20ml加热回流1小时，放冷，滤过得滤液和滤饼，滤饼用10ml甲醇分2次洗涤，合并滤液及洗涤液蒸干得一次蒸干物，一次蒸干物再用20ml三氯甲烷分2次振摇提取，合并两次三氯甲烷提取液后蒸干得二次蒸干物，二次蒸干物用甲醇定容至10ml量瓶中，采取0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

2)测定：取10个不同批次的骨疏康制剂，按照1)所述步骤制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，比较11批骨疏康制剂的高效液相色谱图，确定共有10个共有峰，建立了骨疏康制剂HPLC指纹图谱；

骨疏康制剂HPLC指纹图谱各共有峰的来源确定：取各对照品溶液，注入高效液相色谱仪得对照品HPLC图谱，对照品HPLC图谱与骨疏康制剂HPLC指纹图谱对照得骨疏康制剂HPLC指纹图谱各共有峰的来源；对照品溶液的配制：分别精密称取淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、木耳多糖、异槲皮甙适量，加甲醇使溶解，制成对照品溶液；各对照品溶液浓度分别为：淫羊藿苷为25μg/ml，毛蕊花糖苷为20μg/ml，柚皮苷为60μg/ml，黄芪甲苷为500μg/ml，毛蕊异黄酮葡萄糖苷为50μg/ml，丹参素为50μg/ml，丹参酮ⅡA为20μg/ml，丹酚酸B为100μg/ml，木耳多糖为70μg/ml，异槲皮甙为50μg/ml；

本发明的测定方法，采用高效液相色谱法，其色谱条件为：

色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；检测波长270nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl；

流动相：流动相A为甲醇，B为乙腈，C为50mmol/L磷酸-30mmol/L三乙胺溶液(用2mol/L氢氧化钠调节PH至5.0)

洗脱方式：梯度洗脱；

理论塔板数按淫羊藿苷峰计算不低于3000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在65min内被检测完。

其中，梯度洗脱过程如下表1

表1. HPLC检测梯度洗脱过程

时间(分钟)	流动相A	流动相B	流动相C
				0-15	5～10％	3％～7％	92％～83％
16-25	10％～15％	7％～12％	83％～73％
				26-50	15～24％	12％～30％	73％～46％
51-60	24％～35％	30％～45％	46％～20％
				60-65	35％	45％	20％

本发明的测定方法是经过创造性的筛选得来的，分别对供试品溶液的制备条件，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。

其中，供试品溶液制备条件的考察：试验比较了不同提取溶剂如丙酮、乙醇、甲醇、三氯甲烷的水浴回流和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以甲醇水浴回流提取的总体效果为佳。同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间(30，60，120min)的提取效果。结果表明，以甲醇为提取溶剂，回流提取60min，提取较完全，操作方法简便，且方法稳定、重现性好。同时还考察甲醇、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷为萃取剂的分离效果。结果表明，以三氯甲烷为萃取剂，所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息，可以作为综合质量评价的方法。

其中，色谱条件的选择及优化，在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇-0.05％磷酸水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-甲醇-0.05％磷酸三乙胺水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验。结果表明，用乙腈-甲醇-磷酸三乙胺水溶液进行梯度洗脱为佳，色谱峰检测比较全面，锋形尖锐且分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。

其中，检测波长的选择，对190～400nm扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，结果270nm处检测的色谱图不仅基线平稳，信息量多，各色谱峰的分离效果很好，峰面积大。因此，选270nm作为检测波长。同时按照试行标准的要求考察了其他波长下的色谱图，其结果显示骨疏康颗粒在不同波长下的色谱指纹图谱具有很好的相似度。

其中，分析时间的选择，在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了2h的色谱行为图。结果表明60min以后基本没有色谱峰出现，同时为了照顾样品的差异性，保证所有样品的特征峰都能够被检出，因此选择65min作为分析时间。

本发明所述的骨疏康制剂可以为：颗粒剂、胶囊或片剂等口服固体制剂。

本发明中骨疏康制剂由淫羊藿，熟地黄，骨碎补，黄芪，丹参，木耳，黄瓜子组成。

各重量配比如下：淫羊藿7.5％-70％，熟地黄6％-50％，骨碎补5％-65％，黄芪5％-40％，丹参5％-60％，木耳3％-20％，黄瓜子5％-30％。优选的淫羊藿17.5％，熟地黄23.2％，骨碎补11.6％，黄芪17.5％，丹参11.6％，木耳9.3％，黄瓜子9.3％。

所述的骨疏康制剂的制备方法，包括以下步骤：黄瓜子破碎，与木耳加水煎煮1-4次，每次加水3-20倍量，每次煎煮1-4.5小时，煎液分别滤过，滤液减压浓缩至相对密度约为1.00-1.35、温度为20℃-100℃的清膏；丹参用乙醇回流提取1-4次，每次加乙醇2-12倍量，每次回流提取1-4.5小时，合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度约为1.00-1.35、温度为20℃-100℃的清膏；丹参药渣与淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪加水煎煮1-6次，每次加水3-12倍量，每次煎煮1-4.5小时，合并煎液，静置2-24小时，取上清液，经吸附树脂吸附，用20％-95％浓度乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.00-1.35、温度为20℃-100℃的清膏；取上述清膏，干燥，粉碎，制成骨疏康制剂，包装，即得。

本发明建立的骨疏康制剂HPLC指纹图谱在检测中可以对待测样品进行产品质量的检测，将检测样品的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”，通过“相似度计算”功能进行色谱图谱样本与骨疏康标准对照指纹图谱的相似度评价。相似度大于或等于0.9即为合格产品，小于0.9即为不合格产品。

本发明的测定方法与现有方法相比较，检测更加准确，操作更加简便，有效的缩短了检测时间，重现性好和信息量大。

附图说明

图1为本发明建立的骨疏康制剂HPLC指纹图谱和10批骨疏康HPLC图谱叠图；

图2为本发明建立的骨疏康制剂HPLC指纹图谱。

具体实施方式

实施例

一、器材与方法

1.1 仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪(四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)。

1.2 试剂甲醇、乙腈、为色谱醇(美国Tedia试剂公司)，水为二次蒸馏水，其他试剂均为国产分析纯；淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、木耳多糖、异槲皮甙标准品购自中国食品药品检定研究院。骨疏康颗粒由辽宁康辰药业有限责任公司提供(批号：150301、150415、150502、150613、150709、150815、150911、151012、151107、151203)，药品批准文号为国药准字Z20003255。

1.3 色谱条件：色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18柱(250mm×4.6mm,5μm)(美国Phenomenex公司)；流动相：流动相A为甲醇，B为乙腈，C为50mmol/L磷酸-30mmol/L三乙胺溶液(用2mol/L氢氧化钠调节PH至5.0)。检测波长270nm，柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl。理论塔板数按淫羊藿苷峰计算不低于3000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在65min内被检测完。梯度洗脱过程如下表1

表1. HPLC检测梯度洗脱过程

时间(分钟)	流动相A	流动相B	流动相C
				0-15	5～10％	3％～7％	92％～83％
16-25	10％～15％	7％～12％	83％～73％
				26-50	15～24％	12％～30％	73％～46％
51-60	24％～35％	30％～45％	46％～20％
				60-65	35％	45％	20％

1.4 供试品溶液的制备及其检测：

骨疏康制剂供试品溶液的配制：精密称定本品1.0g，研细，加甲醇20ml加热回流1小时，放冷，滤过得滤液和滤饼，滤饼用10ml甲醇分2次洗涤，合并滤液及洗涤液蒸干得一次蒸干物，一次蒸干物再用20ml三氯甲烷分2次振摇提取，合并两次三氯甲烷提取液后蒸干得二次蒸干物，二次蒸干物用甲醇定容至10ml量瓶中，采取0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

取辽宁康辰药业有限责任公司提供10个批次的骨疏康颗粒，制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照1.3所述色谱条件进行分析，记录65min色谱图，得出10批次骨疏康颗粒共有峰的骨疏康制剂HPLC指纹图谱。

1.5 标准品溶液的制备及其检测：

精密称取淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参素、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、木耳多糖、异槲皮甙适量，加甲醇使溶解，分别制成对照品溶液；其浓度分别为：淫羊藿苷为25μg/ml，毛蕊花糖苷为20μg/ml，柚皮苷为60μg/ml，黄芪甲苷为500μg/ml，毛蕊异黄酮葡萄糖苷为50μg/ml，丹参素为50μg/ml，丹参酮ⅡA为20μg/ml，丹酚酸B为100μg/ml，木耳多糖为70μg/ml，异槲皮甙为50μg/ml。按照1.3的检测方法通过HPLC检测定位。

对照品HPLC谱图与1.4得出的骨疏康制剂HPLC指纹图谱比较确定：1号峰为木耳多糖，2号峰为丹参素，3号峰为淫羊藿苷，4号峰为柚皮苷，5号峰为异槲皮甙，6号峰为丹参酮ⅡA；7号峰为毛蕊花糖苷，8号峰为丹酚酸B，9号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，10号峰为黄芪甲苷。

以2号峰作为指纹图谱的参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如下表2和3所示：

表2. 10批骨疏康指纹图谱共有峰的相对保留时间

表3. 10批骨疏康指纹图谱共有峰的相对峰面积

应用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”对检测的10批骨疏康指纹图谱进行评价，结果如下表4。

表4 10批骨疏康指纹图谱的相似度结果

二、对本发明开发出的骨疏康制剂HPLC指纹图谱的检测方法进行方法学验证，结果如下：

2.1 稳定性试验：取同一供试品，分别在0,2,4,8,16,24h进样，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性，结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.2 精密度实验：取同一供试品，连续进样6次，测得的结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3％，结果表明本方法精密度良好，符合指纹图谱测定要求。

2.3 重复性试验：取同一批号的样品，平行制备6份供试品溶液，进行测定，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明该方法重复性良好。

三、本发明建立的骨疏康制剂HPLC指纹图谱可进行待测样品质量的判断

结果判定依据：

将检测样品利用本发明构建的检测方法进行检验，将HPLC指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)”，通过“相似度计算”功能进行色谱图谱样本与本发明建立的骨疏康制剂HPLC指纹图谱的相似度评价。相似度大于或等于0.9即为合格产品，小于0.9即为不合格产品。

Claims (8)

1.一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)骨疏康制剂供试品溶液的配制：精密称定骨疏康制剂1.0g，研细，加甲醇20ml加热回流1小时，放冷，滤过得滤液和滤饼，滤饼用10ml甲醇分2次洗涤，合并滤液及洗涤液蒸干得一次蒸干物，一次蒸干物再用20ml三氯甲烷分2次振摇提取，合并两次三氯甲烷提取液后蒸干得二次蒸干物，二次蒸干物用甲醇定容至10ml量瓶中，采取0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

2)测定：取10个不同批次的骨疏康制剂，按照1)所述步骤制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，比较10批骨疏康制剂的高效液相色谱图，确定共有10个共有峰，建立骨疏康制剂HPLC指纹图谱；

所述步骤2)中高效液相色谱仪的检测条件为：

色谱柱：PHENOMENEX LUNA C-18柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量10μl；检测波长为270nm；

流动相：由三组分溶液组成，分别为A相甲醇，B相乙腈，C相为pH＝5.0的水相；

采取梯度洗脱方式进行洗脱65min：0-15min之间，A相甲醇体积比由5％变为10％，B相乙腈体积比由3％变为7％，C相pH＝5.0的水相体积比由92％变为83％；16-25min之间，A相甲醇体积比由10％变为15％，B相乙腈体积比由7％变为12％，C相pH＝5.0的水相体积比由83％变为73％；26-50min之间，A相甲醇体积比由15％变为24％，B相乙腈体积比由12％变为30％，C相pH＝5.0的水相体积比由73％变为46％；51-60min之间，A相甲醇体积比由24％变为35％，B相乙腈体积比由30％变为45％，C相pH＝5.0的水相体积比由46％变为20％；60-65min之间，A相甲醇体积比为35％，B相乙腈体积比为45％，C相pH＝5.0的水相体积比为20％。

2.根据权利要求1所述的一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述骨疏康制剂HPLC指纹图谱10个共有峰中1号峰为木耳多糖，2号峰为丹参素，3号峰为淫羊藿苷，4号峰为柚皮苷，5号峰为异槲皮甙，6号峰为丹参酮ⅡA；7号峰为毛蕊花糖苷，8号峰为丹酚酸B，9号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，10号峰为黄芪甲苷。

3.根据权利要求2所述的一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述骨疏康制剂HPLC指纹图谱10个共有峰中以2号峰丹参素的保留时间为基准，各峰的相对保留时间分别为，1号峰木耳多糖0.381，2号峰丹参素1.0，3号峰淫羊藿苷1.180，4号峰柚皮苷1.574，5号峰异槲皮甙1.838，6号峰丹参酮ⅡA 2.014；7号峰毛蕊花糖苷2.404，8号峰丹酚酸B 2.987，9号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷3.203，10号峰黄芪甲苷3.402。

4.根据权利要求1所述的一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述骨疏康制剂为骨疏康口服固体制剂。

5.根据权利要求4所述的一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述骨疏康口服固体制剂为颗粒剂、胶囊或片剂。

6.根据权利要求1所述的一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述pH＝5.0的水相由2mol/L氢氧化钠水溶液调节50mmol/L磷酸和30mmol/L三乙胺溶液所得。

7.根据权利要求1所述的一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述骨疏康制剂由淫羊藿，熟地黄，骨碎补，黄芪，丹参，木耳，黄瓜子组成。

8.一种骨疏康制剂HPLC指纹图谱的建立方法的用途，其特征在于：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究2004A版，将权利要求1步骤2)建立骨疏康制剂HPLC指纹图谱与待检测样品指纹图谱进行相似度评价，所述相似度≥0.9，为合格产品；所述相似度＜0.9，为不合格产品。