CN105203690B - 一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，包括建立标准对照指纹图谱、测定待检样品指纹图谱、将标准对照指纹图谱和待检样品指纹图谱进行比对，鉴别待检样品是否合格，本发明检测准确、操作简便，选用三氯甲烷为提取溶剂，将检测波长、梯度洗脱等色谱条件进行优选，促使荷丹制剂的有效成分提取较完全，所得指纹图谱信息量较大，色谱图的分离度高，有效避免了色谱图的拖尾现象，有助于监控荷丹制剂的质量，保证药品质量稳定、均一。
Description
技术领域
本发明涉及中药制剂指纹图谱技术领域，具体而言涉及一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法。
背景技术
荷丹片、荷丹胶囊是由多种天然中药材经精工制作而成的中医复方制剂，具有化痰降浊、活血化瘀的功效，临床用于高脂血症属痰浊血瘀证候者。自荷丹制剂上市以来，因其治疗效果好，见效快，价格便宜，受到了广大患者的好评。荷丹制剂主要成分包括荷叶、丹参、山楂、番泻叶、补骨脂，现代药理研究已证明其含有多种生物活性物质。现有荷丹制剂的质量标准仅对其主要成分荷叶碱进行定量检测，对于成分复杂、有效成分尚不十分明确的中成药来说，单靠测定某种有效成分解决质量检测和产品批次间质量差异的问题是远远不够的。
指纹图谱技术是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。由于中药及其制剂均为多组分复杂体系，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。目前，尚无荷丹制剂指纹图谱研究工作的报道。
发明内容
本发明提供了一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，所述测定方法包括以下步骤：
步骤一：建立标准对照指纹图谱；
(1)制备供试品溶液
在荷丹制剂中加入硫酸溶液和三氯甲烷，并加热回流，回收三氯甲烷，取续滤液，即得；
(2)获得色谱图
将步骤(1)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，获得色谱图，色谱条件如下：
色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18柱，其综合性能稳定且优越，检测波长为260-280nm，流动相A为乙腈，B为含0.1％甲酸和0.3％三乙胺的溶液，梯度洗脱55-65分钟；
(3)建立标准对照指纹图谱
随机选取8-12批次荷丹制剂的色谱图，建立标准对照指纹图谱；
步骤二：测定待检样品指纹图谱；
步骤三：将步骤一、步骤二得到的指纹图谱进行相似度比对，鉴别待检样品是否合格。
进一步，所述步骤一中，制备供试品溶液的方法为：
取同批次的荷丹制剂8-12片，除去包衣，研细，精密称取0.3-0.4g，加入10-12ml的2.5mol/L硫酸溶液，超声处理5-10min，再加入8-12ml的三氯甲烷，加热回流，静置0.5-1h，分取三氯甲烷层，余留物再用8-12ml的三氯甲烷分2次振摇提取，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用70％甲醇定容至10ml容器中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
进一步，所述荷丹制剂的剂型为任意一种常规剂型。
进一步，所述步骤一中加热回流的时间为55-65min。
进一步，所述步骤一中检测波长为270nm。
进一步，所述色谱条件中流动相流速为0.5-1.5ml/min，进样量为8-12μl，柱温为25-35℃。
进一步，所述步骤一中梯度洗脱的方案为：
洗脱时间为0-20min时，乙腈浓度由5-7％上升为11-13％；
洗脱时间为20-31min时，乙腈浓度由11-13％上升为46-50％；
洗脱时间为31-45min时，乙腈浓度由46-50％上升为65-75％；
洗脱时间为45-65min时，乙腈浓度由65-75％上升为85-95％。
进一步，所述步骤一中梯度洗脱的方案为：
洗脱时间为0-20min时，乙腈浓度由6％上升为12％；
洗脱时间为20-31min时，乙腈浓度由12％上升为48％；
洗脱时间为31-45min时，乙腈浓度由48％上升为70％；
洗脱时间为45-65min时，乙腈浓度由70％上升为90％。
进一步，所述测定待检样品指纹图谱的方法为：
取同批次的荷丹制剂8-12片，除去包衣，研细，精密称取0.3-0.4g，加入10-12ml的2.5mol/L硫酸溶液，超声处理5-10min，再加入8-12ml的三氯甲烷，加热回流55-65min，静置0.5-1h，分取三氯甲烷层，余留物再用8-12ml的三氯甲烷分2次振摇提取，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用70％甲醇定容至10ml容器中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪，在步骤一所述的色谱条件下进行分析，记录55-65min色谱图，即得。
进一步，所述指纹图谱进行相似度比对的方法为：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)，将步骤二测定的待检样品指纹图谱与步骤一测定的标准对照指纹图谱，进行相似度评价，所述相似度≥0.9，即为合格产品；所述相似度＜0.9，即为不合格产品。
发明人通过高效液相色谱法对荷丹制剂进行指纹图谱的研究，建立标准指纹图谱，对荷丹制剂有效成分进行科学的鉴别和测定，为了提高测定的准确性，发明人分别对供试品溶液的制备条件、色谱条件进行优选：
一、供试品溶液的制备条件
本发明以三氯甲烷为提取溶剂，采用超声提取方法，加热回流的时间设置为55-65min，与常用的丙酮、乙醇、甲醇等提取溶剂相比，三氯甲烷能够促使有效成分提取完全，所得指纹图谱信息量大，既含脂溶性成分，也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能的反映了荷丹制剂所含的全部信息。
二、梯度洗脱方案
在流动相系统的选择中，发明者分别以甲醇-水、甲醇-0.05％磷酸水、乙腈-水、0.1％醋酸-乙腈、(水-乙腈-三乙胺-冰醋酸)-乙腈、乙腈-含0.1％甲酸和0.3％三乙胺的溶液等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验，结果表明，用乙腈-含0.1％甲酸和0.3％三乙胺的溶液，进行梯度洗脱为佳，并且，在梯度洗脱过程中，乙腈的浓度增长率呈现平稳增长、急剧增长再平稳增长的趋势，促使色谱峰检测比较全面，锋形尖锐且分离度较好，峰面积较大，调整流动相不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移。
三、检测波长
发明者对采用190～400nm波长扫描的色谱图进行比较分析，结果表明，260-280nm波长扫描的色谱图基线平稳，具有很好的相似度，尤其采用270nm波长扫描的色谱图信息量多，各色谱峰的分离效果很好，峰面积大。
四、梯度洗脱时间
发明者在选择指纹图谱的洗脱时间时，记录了2h的色谱行为图，结果表明50min以后基本没有色谱峰出现，同时，为了照顾样品的差异性，保证所有样品的特征峰都能够被检出，因此，选择55-65min作为梯度洗脱时间。
以上所述制备条件、色谱条件相辅相成，将荷丹制剂中的有效成分进行完全提取，并促使各有效成分在设定时间内有效分离，有效缩短了检测时间，重现性好和信息量大。
本发明的有益效果如下：
1、本发明采用指纹图谱技术，对荷丹制剂的有效成分进行科学的鉴别和测定，具有检测准确、操作简便的特点。
2、本发明选用三氯甲烷为提取溶剂，采用超声提取方法，并有效设置加热回流时间，促使荷丹制剂的有效成分提取较完全，所得指纹图谱信息量较大。
3、本发明将检测波长、梯度洗脱等色谱条件进行优选，促使色谱图的分离度高，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析。
4、本发明能够快速且准确的鉴别样品是否合格，有效监控荷丹制剂的质量，保证药品质量稳定、均一。
附图说明
图1是本发明的10批次荷丹片的指纹图谱；
图2是本发明的荷丹片的标准对照指纹图谱；
图3是本发明的待检测荷丹片指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，包括以下步骤：
一、仪器、试剂与药品
1、仪器
Agilent1200型高效液相色谱仪(四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)、METTLERAE240天秤(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、SG8200H超声仪(上海冠特超声仪器有限公司)、W2018型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)、SHB-3A型循环水多用真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；
2、试剂
甲醇、乙腈为色谱醇(美国Tedia试剂公司)，水为二次蒸馏水，其他试剂均为国产分析纯；
3、药品
荷丹片由南昌济顺药业有限责任公司提供，生产批号S1-S10分别为：140301、140415、140502、140613、140709、140815、140911、141012、141107、141203。
二、建立标准对照指纹图谱
1、制备供试品溶液
生产批号为140301的荷丹片，随机选取10片，除去包衣，研细，精密称取0.4g，加入10ml的2.5mol/L硫酸溶液，超声处理5min，再加入10ml的三氯甲烷，加热回流60min，静置1h，分取三氯甲烷层，余留物再用10ml的三氯甲烷分2次振摇提取，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用70％甲醇定容至10ml量瓶中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
2、获得色谱图
将步骤1制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，获得色谱图，色谱条件如下：
色谱柱：PHENOMENEX LUNA C-18柱(250mm×4.6mm，5μm)(美国Phenomenex公司)，柱温：30℃，流动相：A为乙腈，B为含0.1％甲酸和0.3％三乙胺的溶液，进行梯度洗脱60分钟，流动相流速：1.0ml/min，进样量：10μl，检测波长：270nm；
梯度洗脱的方案为：
洗脱时间为0-20min时，乙腈浓度由6％上升为12％；
洗脱时间为20-31min时，乙腈浓度由12％上升为48％；
洗脱时间为31-45min时，乙腈浓度由48％上升为70％；
洗脱时间为45-65min时，乙腈浓度由70％上升为90％
理论塔板数按荷叶碱峰计算不低于2000，与其它峰的分离度均大于1.0，所有组分均在60min内被检测完；
3、建立标准对照指纹图谱
取其他9个生产批号的荷丹片，分别按照步骤1、步骤2获得色谱图，如图1所示。通过比较10批色谱图，确定共有13个共有峰，以3号峰作为指纹图谱的参比峰，计算各共有峰的相对保留时间，如表1所示：
表1：
| 峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 平均 | RSD |
| 1 | 0.319 | 0.324 | 0.326 | 0.327 | 0.324 | 0.323 | 0.325 | 0.328 | 0.314 | 0.319 | 0.323 | 0.014 |
| 2 | 0.847 | 0.853 | 0.852 | 0.853 | 0.853 | 0.853 | 0.852 | 0.846 | 0.805 | 0.861 | 0.847 | 0.019 |
| 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| 4 | 1.372 | 1.292 | 1.297 | 1.306 | 1.313 | 1.323 | 1.337 | 1.47 | 1.374 | 1.244 | 1.334 | 0.057 |
| 5 | 1.595 | 1.523 | 1.528 | 1.535 | 1.54 | 1.549 | 1.564 | 1.685 | 1.572 | 1.478 | 1.558 | 0.045 |
| 6 | 1.746 | 1.668 | 1.675 | 1.679 | 1.687 | 1.697 | 1.713 | 1.848 | 1.723 | 1.62 | 1.707 | 0.048 |
| 7 | 2.087 | 1.991 | 2.000 | 2.003 | 2.014 | 2.026 | 2.046 | 2.205 | 2.056 | 1.935 | 2.037 | 0.045 |
| 8 | 2.594 | 2.476 | 2.484 | 2.489 | 2.503 | 2.517 | 2.541 | 2.738 | 2.552 | 2.404 | 2.531 | 0.044 |
| 9 | 2.781 | 2.653 | 2.662 | 2.668 | 2.683 | 2.699 | 2.726 | 2.937 | 2.738 | 2.579 | 2.714 | 0.045 |
| 10 | 2.955 | 2.82 | 2.829 | 2.835 | 2.852 | 2.866 | 2.894 | 3.117 | 2.906 | 2.739 | 2.883 | 0.044 |
| 11 | 3.308 | 3.156 | 3.165 | 3.171 | 3.191 | 3.207 | 3.239 | 3.488 | 3.251 | 3.065 | 3.226 | 0.044 |
| 12 | 3.497 | 3.326 | 3.336 | 3.345 | 3.368 | 3.387 | 3.424 | 3.714 | 3.463 | 3.227 | 3.411 | 0.048 |
| 13 | 3.666 | 3.488 | 3.499 | 3.508 | 3.534 | 3.553 | 3.591 | 3.893 | 3.629 | 3.386 | 3.577 | 0.048 |
上述数据由南昌济顺制药有限责任公司提供
以3号峰作为指纹图谱的参比峰，计算各共有峰的相对峰面积，如表2所示：
表2：
| 峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 平均 | RSD |
| 1 | 0.098 | 0.108 | 0.106 | 0.109 | 0.138 | 0.14 | 0.123 | 0.12 | 0.114 | 0.132 | 0.118 | 0.137 |
| 2 | 1.012 | 1.057 | 1.022 | 1.034 | 0.976 | 1.013 | 1.019 | 0.912 | 0.997 | 1.004 | 1.003 | 0.021 |
| 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
| 4 | 0.343 | 0.315 | 0.286 | 0.323 | 0.113 | 0.101 | 0.243 | 0.266 | 0.532 | 0.178 | 0.269 | 0.464 |
| 5 | 0.09 | 0.089 | 0.07 | 0.081 | 0.028 | 0.029 | 0.051 | 0.043 | 0.091 | 0.072 | 0.064 | 0.367 |
| 6 | 0.07 | 0.066 | 0.066 | 0.074 | 0.05 | 0.058 | 0.064 | 0.059 | 0.084 | 0.082 | 0.067 | 0.153 |
| 7 | 0.086 | 0.082 | 0.078 | 0.103 | 0.084 | 0.069 | 0.075 | 0.068 | 0.079 | 0.094 | 0.081 | 0.122 |
| 8 | 0.186 | 0.178 | 0.181 | 0.155 | 0.04 | 0.101 | 0.135 | 0.141 | 0.173 | 0.123 | 0.14 | 0.313 |
| 9 | 0.254 | 0.237 | 0.224 | 0.272 | 0.113 | 0.104 | 0.164 | 0.148 | 0.233 | 0.18 | 0.192 | 0.29 |
| 10 | 0.274 | 0.266 | 0.266 | 0.28 | 0.127 | 0.159 | 0.208 | 0.18 | 0.261 | 0.201 | 0.221 | 0.229 |
| 11 | 0.145 | 0.134 | 0.122 | 0.144 | 0.068 | 0.072 | 0.099 | 0.092 | 0.136 | 0.111 | 0.111 | 0.238 |
| 12 | 0.201 | 0.189 | 0.184 | 0.208 | 0.081 | 0.08 | 0.136 | 0.091 | 0.154 | 0.152 | 0.146 | 0.314 |
| 13 | 0.278 | 0.274 | 0.254 | 0.293 | 0.124 | 0.107 | 0.182 | 0.137 | 0.259 | 0.167 | 0.206 | 0.324 |
上述数据由南昌济顺制药有限责任公司提供
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)，对所述10批荷丹指纹图谱进行相似度评价，所述10批荷丹指纹图谱导入相似度评价系统后，系统自动生成一个对照指纹图谱，以上所述指纹图谱的相似度评价结果如表3
所示：
表3：
上述数据由南昌济顺制药有限责任公司提供
由表3可以看出，以上所述指纹图谱间的相似度均≥0.9，说明所述10个生产批号的荷丹片均为合格品，所述对照指纹图谱即为荷丹片标准对照指纹图谱，从而建立荷丹片标准对照指纹图谱如图2所示。
三、测定待检样品指纹图谱
取待检测荷丹片，所述待检测荷丹片由南昌济顺药业有限责任公司提供，其生产批号为150109，按照步骤二制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照步骤二所述色谱条件进行分析，记录60min色谱图，如图3所示。
四、将待检样品指纹图谱与标准对照指纹图谱进行比对，鉴别待检样品是否合格
将检测样品的指纹图谱，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)，通过“相似度计算”功能进行相似度评价，结果显示相似度为0.973，即待检测荷丹片为合格产品。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，其特征在于：所述测定方法包括以下步骤：
步骤一：建立标准对照指纹图谱；
(1)制备供试品溶液
取同批次的荷丹制剂8-12片，除去包衣，研细，精密称取0.3-0.4g，加入10-12ml的2.5mol/L硫酸溶液，超声处理5-10min，再加入8-12ml的三氯甲烷，加热回流，静置0.5-1h，分取三氯甲烷层，余留物再用8-12ml的三氯甲烷分2次振摇提取，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用70％甲醇定容至10ml容器中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
(2)获得色谱图
将步骤(1)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行梯度洗脱，获得色谱图，色谱条件如下：
色谱柱为PHENOMENEXLUNA C-18柱，检测波长为260-280nm，流动相A为乙腈，B为含0.1％甲酸和0.3％三乙胺的溶液，流动相流速为0.5-1.5ml/min，进样量为8-12μl，柱温为25-35℃；
所述梯度洗脱的方案为：
洗脱时间为0-20min时，乙腈浓度由5-7％上升为11-13％；
洗脱时间为20-31min时，乙腈浓度由11-13％上升为46-50％；
洗脱时间为31-45min时，乙腈浓度由46-50％上升为65-75％；
洗脱时间为45-65min时，乙腈浓度由65-75％上升为85-95％
(3)建立标准对照指纹图谱
随机选取8-12批次荷丹制剂的色谱图，建立标准对照指纹图谱；
步骤二：测定待检样品指纹图谱；
取同批次的荷丹制剂8-12片，除去包衣，研细，精密称取0.3-0.4g，加入10-12ml的2.5mol/L硫酸溶液，超声处理5-10min，再加入8-12ml的三氯甲烷，加热回流55-65min，静置0.5-1h，分取三氯甲烷层，余留物再用8-12ml的三氯甲烷分2次振摇提取，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用70％甲醇定容至10ml容器中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪，在步骤一所述的色谱条件下进行分析，记录色谱图，即得；
步骤三：将步骤一、步骤二得到的指纹图谱进行相似度比对，鉴别待检样品是否合格。
2.根据权利要求1所述的一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，其特征在于：所述步骤一中加热回流的时间为55-65min。
3.根据权利要求2所述的一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，其特征在于：所述步骤一中检测波长为270nm。
4.根据权利要求3所述的一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，其特征在于：所述步骤一中梯度洗脱的方案为：
洗脱时间为0-20min时，乙腈浓度由6％上升为12％；
洗脱时间为20-31min时，乙腈浓度由12％上升为48％；
洗脱时间为31-45min时，乙腈浓度由48％上升为70％；
洗脱时间为45-65min时，乙腈浓度由70％上升为90％。
5.根据权利要求4所述的一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法，其特征在于：所述指纹图谱进行相似度比对的方法为：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版2004A，将步骤二测定的待检样品指纹图谱与步骤一测定的标准对照指纹图谱，进行相似度评价，所述相似度≥0.9，即为合格产品；所述相似度＜0.9，即为不合格产品。
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