CN103776926B

CN103776926B - 溪黄草药材hplc指纹图谱的建立

Info

Publication number: CN103776926B
Application number: CN201410008547.6A
Authority: CN
Inventors: 赖小平; 黄松; 蒋东旭
Original assignee: Dongguan Institute of Traditional Chinese Medicine Engineering Guangzhou Univers
Current assignee: Dongguan Institute of Traditional Chinese Medicine Engineering Guangzhou Univers
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2034-01-08
Also published as: CN103776926A

Abstract

本发明公开了一种溪黄草药材指纹图谱的建立及其指纹图谱，涉及中药药材的质量控制方法，具体是建立HPLC指纹图谱以检测溪黄草药材提取液的方法。本发明步骤为，对照品溶液的制备；提取溶剂与方法的选择；样品溶液的制备；色谱条件考察：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为0.1%～0.3%乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：25～40℃，紫外检测波长为230～270nm，时间100～120min；不同品种溪黄草药材HPLC指纹图谱测定；特征峰的标记与参照峰的选择。本发明的有益效果：解决溪黄草的入药基源争议。综合运用了指纹图谱的共有峰比较、聚类分析和特有峰分析等方法对三个品种溪黄草HPLC指纹图谱进行鉴别，实现对溪黄草药材的基源鉴别，划分了产地归类，为溪黄草药材的质量控制、临床正确使用提供依据。

Description

溪黄草药材HPLC指纹图谱的建立

技术领域

本发明涉及中药药材的质量控制方法，具体涉及溪黄草药材高效液相色谱法指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。

背景技术

溪黄草原植物为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Isodon lophanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara.的干燥地上部分。主产于长江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、广东、广西、福建等省区。性味苦、甘、寒,归肝、胆经，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效，用于治疗湿热黄疸、湿热泻痢、跌打瘀痛、急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎等疾病。

溪黄草为华南地区民间习用草药。溪黄草作为清肝利胆药在广东大部分地区民间有着很长的使用历史。民间和历代名医把溪黄草用作清热祛湿、利胆退黄药，治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎，为预防和治疗肝胆疾病的常用药。

现作商品“溪黄草”入药的除线纹香茶菜外，还有同属植物狭基线纹香茶菜R.lophanthoides(Buch.-Ham ex D.Don)Hara var.gerardiana(Benth.)Hara、纤花香茶菜R.lophanthoides(Buch.-Ham ex D.Don)Hara var.gracilifl ora(Benth.)Hara和溪黄草R.serra(Maxim.)Hara。广东部颁标准和国家药典2010版（附录）对溪黄草的基源收载以及学者间都存在争议。中药溪黄草来源复杂，同名异物、品种混乱普遍，且这类植物外形类似，开花前和干品都不易鉴别。为保证和提高药材质量，促进中药标准化，在研究过程中应重视对所用药材作基源鉴定；并应对多来源药材在鉴定、化学、药理和临床进一步比较研究，以便在各种药材之间找出功效、主效异同点，为临床用药的安全、有效提供准确可靠的依据。

发明内容

本发明的目的为溪黄草药材的质量控制和真伪鉴别提供一个新的方法，通过建立溪黄草药材指纹图谱的方法，并由此方法得到溪黄草药材共有模式的指纹图谱。

为达到本发明的目的所采用的技术方案：用高效液相色谱法建立溪黄草药材指纹图谱的方法，具体包括如下步骤：

①、对照品溶液的制备：精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为 0.115mg/mL的混合对照品溶液。；

②、样品溶液的制备：精密称定溪黄草药材粉末，精密加入50%乙醇20mL,称摇匀，滤过，作为供试品溶液；

③、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为230～270nm；

④、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

进一步优选的方法可以通过下述步骤实施：

①、对照品溶液的制备：精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为0.115mg/mL的混合对照品溶液。；

②、样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL,称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为样品溶液；

所述步骤；

③、色谱条件，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为0.1%～0.3%乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：25～40℃，紫外检测波长为230～270nm，时间100～120min；

④、测定，采用精密吸取样品溶液10～20μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施:

步骤②样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL,称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为样品溶液；步骤③色谱条件中流动相为0.3%乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，流速为0.8mL/min，柱温：30℃，紫外检测波长为254nm，分析时间120min；

在步骤③中，所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为8%的乙腈溶液、流动相B为92%的0.3%的磷酸溶液；

5分钟时，流动相A为12%的乙腈溶液、流动相B为88%的0.3%的磷酸溶液；

30分钟时，流动相A为18%的乙腈溶液、流动相B为82%的0.3%的磷酸溶液；

60分钟时，流动相A为23%的乙腈溶液、流动相B为77%的0.3%的磷酸溶液；

80分钟时，流动相A为50%的乙腈溶液、流动相B为50%的0.3%的磷酸溶液；

100分钟时，流动相A为70%的乙腈溶液、流动相B为30%的0.3%的磷酸溶液；

120分钟时，流动相A为90%的乙腈溶液、流动相B为10%的0.3%的磷酸溶液。

具体见下表：

溪黄草药材指的纹图谱的建立，具体包括如下步骤：

②、样品溶液的制备：精密称定溪黄草药材粉末，精密加入50%乙醇20mL，称摇匀，滤过，作为供试品溶液；

联合运用色谱峰保留时间（t）、二极阵列检测器采集各色谱峰紫外光谱（UV）确定4个特征峰。其中，S4号峰（迷迭香酸）的峰高最高，且均为4个品种溪黄草药材均含有的色谱峰，峰面积最大，与相邻峰分离度较好，在测定时比较稳定，因此选作参照峰。咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸均为线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜和纤花线纹香茶菜共有的色谱峰(分别为2-S1、3-S2、5-S3、9-S4峰)，而溪黄草仅有咖啡酸和迷迭香酸峰（分别为3-S1、15-S4峰）。由这些特征峰可明显区别溪黄草与正品线纹香茶。

本发明的原理是从溪黄草的指纹图谱研究发现，线纹香茶菜及其变种与溪黄草Rabdosia serra(Maxim.)H.Hara之间的化学成分差异显著。其中，咖啡酸、迷迭香酸是溪黄草、线纹香茶菜及其变种均含有的水溶性共有成分，是其主要活性成分之一。其指纹图谱能从色谱的整体面貌上体现出不同种溪黄草药材的化学成分含量情况。用本方法测定从市面上收集的溪黄草药材均能得到相同、相近似的指纹图谱。

本发明的有益效果如下：

（1）用本发明所提供的方法所建立的HPLC指纹图谱，能有效地表征溪黄草药材的质量，有利于全面监控药材的质量。

（2）综合运用了指纹图谱的共有峰比较、聚类分析和特有峰分析等方法对三个品种溪黄草HPLC指纹图谱进行鉴别，实现对溪黄草药材的基源鉴别，划分了产地归类，为溪黄草药材的质量控制、临床正确使用提供依据，为建立规范化的溪黄草种植基地提供有效的质量控制和品种选育手段。

（3）本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

（4）该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

附图说明

图1溪黄草的HPLC指纹图谱

图24个混标HPLC色谱图

图312批溪黄草药材的特征指纹图谱

具体实施方式

为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与精神，藉由以下结合附图与具体实施方式对本发明的详述得到进一步的了解。

实施例一：检测不同品种溪黄草药材的指纹图谱

1.仪器与试药

1.1仪器实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)；家用万能粉碎机FZ-230型（温岭市牧屿百乐机床厂）;超声波清洗器（ULTRASONIC；360kw，250kHz)；电热恒温水浴锅DK-98-11A；电热鼓风干燥箱101-1AB型；FEJ-200电子称（d=0.1g）；万分之一电子天平（Sartorius BP110s，德国sartorius公司）；十万分之一电子天平（Sartorius CP2250，德国sartorius公司）；日本岛津高效液相色谱仪1(SIL-20A prominence AUTO SAMPLER,LC-20AT prominence LIQUID CHROMATOGRAPH,DGU-20A5prominence DEGASSER,SPD-M20A prominence DIODE ARRAY DETECTOR,CTO-20A prominence column oven)；日本岛津高效液相UV-1色谱仪2（SIL-20A prominence Auto sampler、SPD-20A prominence UV/VIS Detector、DGU-20A5prominence Degasser、LC-20AT prominence Liquid chromatograph、CTO-20A prominence Column oven）；高效液相柱：Dikma Diamonsil(2)（C18250mm×4.6mm，5μm）柱；

1.2试剂咖啡酸对照品（中国药品生物制品检定所，编号为：110885-200102）；迷迭香酸对照品（中国药品生物制品检定所，编号为：111871-201102）；牡荆苷对照品（中国药品生物制品检定所，编号为：111687-200602）；6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素对照品（广州中医药大学新药中心，为自己分离，纯度98%）；乙腈(色谱纯,德国Merck公司)；甲醇(色谱纯,德国Merck公司)；磷酸（AR级，天津市大茂化学试剂厂)；甲醇、乙醇、醋酸、磷酸、冰乙酸、异丙醇均为分析纯（广东光华化学厂有限公司）；重蒸去离子水(实验室制备)。

2.高效液相色谱

2.1色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，流速为0.8mL/min，柱温：30℃，紫外检测波长为254nm，时间120min；

梯度洗脱程序如下表

梯度洗脱条件

2.2对照品溶液的制备：分别精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，定容至刻度，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为0.115mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备：取线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜、纤花线纹香茶菜和溪黄草药材药材粉末各1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20mL,称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；

2.4测定：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

实施例二：12批溪黄草（苦溪黄）药材指纹图谱的测定与数据分析

取溪黄草药材12批次，按实施例一条件进行检测，得12批样品的HPLC图谱。

通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰：将12批溪黄草的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（中国药典委员会2004A版）”，选15号峰（迷迭香酸）作为参照，如图2，确定了21个共有峰。采用中位数法自动匹配自动生成对照谱R，得各药材相似度。12批次溪黄草的相似度。见表1。

表112批溪黄草药材指纹图谱的相似度

以迷香酸（15号峰）为参照峰，选择了各批次重复稳定出现的21个峰为共有峰，经计算机辅助相似度评价软件计算后，该12批溪黄草药材相对所建立的对照指纹图谱的相似度除S5样品外（相似度0.85）均在0.90以上。12批溪黄草的21个共有峰相对保留时间基本一致，而相对峰面积存在较大差别。可能是由于不同种植地土壤、水质或采收、储藏时间的差异导致的化学成分积累差异，其原因有待进一步探索。

以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，于此所揭示的实施例与所有观点，应被视为用以说明本发明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以权利要求为准，并涵盖合法均等物。

Claims

1.一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤：

①、对照品溶液的制备：精密称取对照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸，以甲醇为溶剂，配成咖啡酸浓度为0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素为0.238mg/mL、牡荆苷为0.179mg/mL和迷迭香酸为0.115mg/mL的混合对照品溶液；

②、样品溶液的制备：准确称定溪黄草药材粉末，精密加入50％乙醇20mL，摇匀，滤过，作为供试品溶液；

③、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-磷酸组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为230～270nm，具体的梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A为8％的乙腈溶液、流动相B为92％的0.3％的磷酸溶液；

5分钟时，流动相A为12％的乙腈溶液、流动相B为88％的0.3％的磷酸溶液；

30分钟时，流动相A为18％的乙腈溶液、流动相B为82％的0.3％的磷酸溶液；

60分钟时，流动相A为23％的乙腈溶液、流动相B为77％的0.3％的磷酸溶液；

80分钟时，流动相A为50％的乙腈溶液、流动相B为50％的0.3％的磷酸溶液；

100分钟时，流动相A为70％的乙腈溶液、流动相B为30％的0.3％的磷酸溶液；

120分钟时，流动相A为90％的乙腈溶液、流动相B为10％的0.3％的磷酸溶液；

④、测定：精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其特征在于：通过高效液相色谱仪获得的指纹图谱是联合运用色谱峰保留时间t和二极阵列检测器采集各色谱峰紫外光谱UV确定4个特征峰；其中，S4号峰迷迭香酸的峰高最高，且均为4个品种溪黄草药材均含有的色谱峰，峰面积最大，与相邻峰分离度较好，在测定时比较稳定，因此选作参照峰；咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荆苷和迷迭香酸均为线纹香茶菜、狭基线纹香茶菜和纤花线纹香茶菜共有的色谱峰，分别为2-S1、3-S2、5-S3、9-S4峰，而溪黄草仅有咖啡酸和迷迭香酸峰，分别为3-S1、15-S4峰；指纹图谱中特征峰的差异可作为区别溪黄草与正品线纹香茶的标准。

2.根据权利要求1所述的一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于：

所述步骤②样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为供试品；

所述步骤③色谱条件，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-0.1％～0.3％磷酸组成的梯度洗脱液，柱温：25～40℃，紫外检测波长为230～270nm，时间100～120min；

所述步骤④测定，采用精密吸取样品溶液10～20μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

3.根据权利要求1所述的一种溪黄草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于：

所述步骤②样品溶液的制备，取溪黄草药材粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为样品溶液；

所述步骤③色谱条件中流动相为乙腈-0.3％磷酸组成的梯度洗脱液，流速为0.8mL/min，柱温：30℃，紫外检测波长为254nm，分析时间120min。