CN103033584B - 一种快速区别两种相似药材的判断方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速区别两种相似药材的判断方法，该方法包括以下步骤：⑴精密吸取不同体积的獐牙菜苦苷标准品溶液，采用高效液相色谱仪进行分析、绘制标准曲线、计算回归方程；⑵精密吸取不同体积的龙胆苦苷标准品溶液，采用高效液相色谱仪进行分析、绘制标准曲线、计算回归方程；⑶分别对獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的回归方程进行验证；⑷采集獐牙菜样品；⑸对獐牙菜样品进行测试，分别得到獐牙菜样品中的獐牙菜苦苷含量和龙胆苦苷含量；⑹当獐牙菜苦苷含量均低于1%且龙胆苦苷含量均高于1%时，则该獐牙菜样品为川西獐牙菜；当獐牙菜苦苷含量均高于2%且龙胆苦苷含量均低于1%时，则该獐牙菜样品为抱茎獐牙菜。本发明简便、快捷、可保证用药正确性。

Description

一种快速区别两种相似药材的判断方法

技术领域

本发明涉及一种药材判断方法，尤其涉及一种快速区别两种相似药材的判断方法。 

背景技术

川西獐芽菜（Sweiitia mussotii Franch）为龙胆科獐芽菜属植物，为藏药特有药材，收载于中华人民共和国卫生部《药品标准  藏药 第一部》（1992年版 第六页），其性味为：甘、苦、凉、糙。功能主治为：清肝利胆、退诸热。用于黄疸型肝炎，病毒性肝炎，血病。青海药品标准（1992年版，第17页）的藏茵陈中收载了川西獐芽菜和抱茎獐芽菜（Sweiitia Franchetiana Smith），其性味为：苦、寒。功能主治为：清热消炎，舒肝利胆。用于急性或慢性肝炎、黄疸型肝炎。而中国藏药中记载的藏药药材——獐芽菜（藏语：蒂达）其正品为川西獐芽菜和当药（Sweiitia diluta (Turcz.)Benth et Hook.f.(S.chinensis Franch.)）。单方与组方药物入药，主要用于肝、胆系统疾病的治疗。我国卫生部部颁的藏药标准成方制剂中，收载的治疗肝胆系统疾病及抗病毒药品中所用的獐芽菜应为川西獐芽菜，主产青海玉树和川西北。但由于川西獐芽菜和抱茎獐芽菜两种药材的生物学特征极为相近，尤其是干燥药材，其形态几乎无法分辨，其药品标准不能有效鉴定和区别两种药材的差异，尤其是缺乏对干燥原料药材形态区别，造成入药药材的混淆。由于两种药材的功能和性味有一定差异，因此造成药品疗效不稳定，民间用药不对症的情况。因此，本发明的目的旨在建立一种快速、专属的识别两种药材的方法。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种保证用药正确性的快速区别两种相似药材的判断方法。 

为解决上述问题，本发明所述的一种快速区别两种相似药材的判断方法，包括以下步骤： 

⑴精密吸取0.232mg/ml的獐牙菜苦苷标准品溶液4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl、20.0μl，然后分别进样，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰计算不低于3000的条件下进行分析，并测定积分峰面积，最后以峰面积积分值为纵坐标，獐牙菜苦苷含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算得到獐牙菜苦苷的回归方程Y=96470.4x＋226293.15，r=0.9998；

⑵精密吸取0.61mg/ml的龙胆苦苷标准品溶液4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl、20.0μl，然后分别进样，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按龙胆苦苷峰计算不低于3000的条件下进行分析，并测定积分峰面积，最后以峰面积积分值为纵坐标，龙胆苦苷含量为横坐标，绘制标准曲线，并分别计算得到龙胆苦苷的回归方程Y=－294961.8x＋2003098.5，r=0.9992；

⑶按常规方法分别对獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的回归方程依次进行精密度试验、稳定性试验、重现性试验、回收率试验以验证该回归方程的可行性；

⑷采集獐牙菜样品：将采集或收购的已阴干干燥、拣选除杂后的獐牙菜经粉碎过四号筛后，取2~3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，在55~75℃温度下加热回流30min，室温下冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜除去杂质，精密量取10μl进样即得；

⑸对所述獐牙菜样品采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰、龙胆苦苷峰计算不低于3000的条件下进行测试，并利用所述獐牙菜苦苷的回归方程、龙胆苦苷的回归方程分别得到所述獐牙菜样品中的獐牙菜苦苷含量和龙胆苦苷含量；

⑹当獐牙菜苦苷含量均低于1%且龙胆苦苷含量均高于1%时，则该獐牙菜样品为川西獐牙菜；当獐牙菜苦苷含量均高于2%且龙胆苦苷含量均低于1%时，则该獐牙菜样品为抱茎獐牙菜。

本发明与现有技术相比具有以下优点： 

1、本发明利用高效液相色谱仪进行两种相似药材的化学成分分析，根据化合物成分的不同分布，建立了两种药材快速、准确的区分方法，从而保证了用药的正确性。

2、通过实际验证，川西獐牙菜和抱茎獐牙菜同属龙胆科獐芽菜属植物，但其药效成分獐牙菜苦苷、龙胆苦苷测定结果表明川西獐牙菜中药效成分龙胆苦苷含量分布均高于1%，獐牙菜苦苷则低于1%，抱茎獐牙菜中药效成分獐牙菜苦苷含量分布为2%~16%，而龙胆苦苷则低于1%。换言之，根据两种药效成分的含量高低，可以判断两种獐牙菜的归宿，川西獐牙菜中龙胆苦苷含量高，则獐牙菜苦苷含量低。抱茎獐牙菜中獐牙菜苦苷含量高，则龙胆苦苷含量低。该结果为两种药材的快速区别提供了可靠的鉴别依据，解决了两种植物外观形态相似，药材混淆的根本问题。 

3、本发明方法简便、快捷、准确。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。 

图1为本发明中獐牙菜苦苷标准品溶液的标准曲线。 

图2为本发明中龙胆苦苷标准品溶液的标准曲线。 

具体实施方式

一种快速区别两种相似药材的判断方法，包括以下步骤： 

⑴精密吸取0.232mg/ml的獐牙菜苦苷标准品溶液4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl、20.0μl，然后分别进样，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰计算不低于3000的条件下进行分析，并测定积分峰面积，最后以峰面积积分值为纵坐标，獐牙菜苦苷含量为横坐标，绘制标准曲线（参见图1），并计算得到獐牙菜苦苷的回归方程Y=96470.4x＋226293.15，r=0.9998，表示獐牙菜苦苷在0.93μg~4.64μg范围内有良好的线性关系（表1）。

表1獐牙菜苦苷线性关系试验 

⑵精密吸取0.61mg/ml的龙胆苦苷标准品溶液4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl、20.0μl，然后分别进样，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按龙胆苦苷峰计算不低于3000的条件下进行分析，并测定积分峰面积，最后以峰面积积分值为纵坐标，龙胆苦苷含量为横坐标，绘制标准曲线，并分别计算得到龙胆苦苷的回归方程Y=－294961.8x＋2003098.5，r=0.9992，表示龙胆苦苷在2.44μg~12.2μg范围内有良好的线性关系（表2）。

表2龙胆苦苷线性关系试验

⑶按常规方法分别对獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的回归方程依次进行精密度试验、稳定性试验、重现性试验、回收率试验以验证该回归方程的可行性。

①精密度试验： 

分别精密吸取上述獐牙菜苦苷、龙胆苦苷标准品溶液20μl，分别重复进样5次，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷峰面积积分值的相对标准偏差均﹤2%，结果见表3。

表3  精密度试验结果

②稳定性试验

对同一供试品溶液，进行间隔时间为0、2、4、6、8小时的测定，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷峰面积积分值的相对标准偏差<5%，证明该测试方法相对稳定，符合测定要求。结果见表4。

表4   稳定性试验

③重现性试验

精密称取同批样品，进行5次（n＝2）平行试验，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷含量相对标准偏差<3%，符合测定要求。结果见表5。

表5 重现性试验（n＝2）

④回收率试验

精密称定已知獐牙菜苦苷、龙胆苦苷含量的川西獐牙菜药材，精确添加已知量的獐牙菜苦苷、龙胆苦苷标准品溶液，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰计算不低于3000的条件下进行测定，按下式计算回收率：结果见表6、7。表明本法回收率符合含量测定要求，方法可行。

表6獐牙菜苦苷回收率实验

表7龙胆苦苷回收率实验

⑷采集獐牙菜样品：将采集或收购的已阴干干燥、拣选除杂后的獐牙菜经粉碎过四号筛后，取2~3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，在55~75℃温度下加热回流30min，室温下冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜除去杂质，精密量取10μl进样即得。

⑸采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰、龙胆苦苷峰计算不低于3000的条件下进行测试，并利用獐牙菜苦苷的回归方程、龙胆苦苷的回归方程分别得到獐牙菜样品中的獐牙菜苦苷含量和龙胆苦苷含量。 

⑹当獐牙菜苦苷含量均低于1%且龙胆苦苷含量均高于1%时，则该獐牙菜样品为川西獐牙菜；当獐牙菜苦苷含量均高于2%且龙胆苦苷含量均低于1%时，则该獐牙菜样品为抱茎獐牙菜。 

对30批采集样品按液相色谱龙胆苦苷、獐牙菜苦苷含量测定项下进行平行样的测定，并计算獐牙菜药材中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的含量，结果见表8。 

表8  30批供试品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的测定结果

注：1~12号为2004年样品；13~18号为2005年样品；19~30号为2006年样品。

以上结果显示：连续三年采集的样品中獐牙菜苦苷含量为0.16%~0.33%，均低于1%；龙胆苦苷含量为1.23%~4.67%，均高于1%。因此，该样品为川西獐牙菜。 

对25批獐牙菜采集样品按液相色谱龙胆苦苷、獐牙菜苦苷含量测定项下进行平行样的测定，并计算獐牙菜药材中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的含量，结果见表9。 

表9  25批供试品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的测定结果

注：1~5号为2004年样品；6~9号为2005年样品；10~25号为2006年样品。

以上结果显示：连续三年采集的样品中獐牙菜苦苷含量为2.96%~16.21%，均高于2%；龙胆苦苷含量均低于1%。因此，该样品为抱茎獐牙菜。 

上述2004年、2005年、2006年三年样品中的30批样品均来自青海省的玉树洲及果洛洲；25批样品来自青海省的不同州县，采集地平均海拔在3000米以上。同时，30批样品和25批样品分别经中国科学院西北高原生物研究所陈桂琛研究员鉴定为川西獐牙菜Swertia mussotii Franch.全草和抱茎獐牙菜Swertia franchetiana H.全草。 

本发明中所涉及的仪器与材料如下： 

主要仪器：

LC-10ATVP二元泵(岛津公司)；Rheodyne7725进样器(美国)；SPD-M10AVP二极管阵列检测器(岛津公司)；Class-VP液相色谱工作站(岛津公司)；Milli-Q超纯水装置；AT-130柱温箱(天津)；AB104-N 电子天平(Mettler-toledo公司)；ZM震动超微粉碎机；2200B超声波仪；C₁₈硅胶小柱(1 mL Waters)。

实验材料： 

所用色谱纯甲醇为山东禹城禹王试剂厂产品，磷酸为分析纯；水为自制重蒸水并经0.45μm滤膜过滤；色谱柱大连依利特Hypersil C₁₈ (250×4.6mm, 5μm)。

Claims (1)

1.一种快速区别两种相似药材的判断方法，包括以下步骤：

⑴精密吸取0.232mg/ml的獐牙菜苦苷标准品溶液4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl、20.0μl，然后分别进样，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰计算不低于3000的条件下进行分析，并测定积分峰面积，最后以峰面积积分值为纵坐标，獐牙菜苦苷含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算得到獐牙菜苦苷的回归方程Y=96470.4x＋226293.15，r=0.9998；

⑵精密吸取0.61mg/ml的龙胆苦苷标准品溶液4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl、20.0μl，然后分别进样，采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按龙胆苦苷峰计算不低于3000的条件下进行分析，并测定积分峰面积，最后以峰面积积分值为纵坐标，龙胆苦苷含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算得到龙胆苦苷的回归方程Y=－294961.8x＋2003098.5，r=0.9992；

⑶按常规方法分别对獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的回归方程依次进行精密度试验、稳定性试验、重现性试验、回收率试验以验证该回归方程的可行性；

⑷采集獐牙菜样品：将采集或收购的已阴干干燥、拣选除杂后的獐牙菜经粉碎过四号筛后，取2~3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，在55~75℃温度下加热回流30min，室温下冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜除去杂质，精密量取10μl进样即得；

⑸对所述獐牙菜样品采用高效液相色谱仪以甲醇-0.02%磷酸溶液为流动相，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在检测波长240~260nm，理论塔板数按獐牙菜苦苷峰、龙胆苦苷峰计算不低于3000的条件下进行测试，并利用所述獐牙菜苦苷的回归方程、龙胆苦苷的回归方程分别得到所述獐牙菜样品中的獐牙菜苦苷含量和龙胆苦苷含量；

⑹根据獐牙菜苦苷含量与龙胆苦苷含量的差异来判别獐牙菜样品是否为川西獐牙菜或抱茎獐牙菜。