CN105548375A - 一种中药组合物及其原料药材的指纹图谱检测方法 - Google Patents

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CN105548375A CN201410594811.9A CN201410594811A CN105548375A CN 105548375 A CN105548375 A CN 105548375A CN 201410594811 A CN201410594811 A CN 201410594811A CN 105548375 A CN105548375 A CN 105548375A
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萧伟
胡军华
林夏
章晨峰
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Abstract

本发明公开了一种具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法及其原料药材检测方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照指纹图谱的建立和供试液指纹图谱的测定。本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证，本发明提供的指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价该中药组合物的质量，可以从源头上保证该中药组合物的安全性和有效性，保证临床疗效。

Description

一种中药组合物及其原料药材的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药制剂的质检方法，具体涉及一种具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物及其原料药材的指纹图谱检测方法。
背景技术
中国专利ZL02129192.6公开了一种具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物及其制备方法，由羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、人工牛黄、青礞石和甘草制成。该中药组合物由江苏康缘药业股份有限公司生产，临床具有清热解毒，祛痰止咳的功效，用于小儿急性支气管炎符合痰热咳嗽者，表现为发热、咳嗽、咳吐黄痰、咳吐不爽、舌质红、苔黄腻等。
目前，上述中药组合物的质量标准规定了个别化合物的鉴别和检测，检测工作繁琐，检测效率低，且检测的活性成分数量有限，不能很好的反应制剂的整体质量。
因此，为了更全面、有效的控制该中药组合物的质量，让临床用药安全及疗效更加有所保证，很有必要研究设计出一种能客观、准确，全面检测该中药组合物质量的指纹图谱测定方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法及其原料药材的质量检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价中药组合物的质量，对控制中药组合物及原料药材的质量、保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为：
具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，加乙醇超声提取，提取液在1500～3000转/分钟，离心，取离心液用微孔滤膜滤过，得到供试品溶液；优选用50％体积浓度的乙醇超声提取2次，每次30～60分钟；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次中药组合物的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算获得共有模式作为对照指纹图谱；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)中供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，相似度大于0.9。
作为优选方案，以上所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤(4)中用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)评价17个共有指纹峰，其中10号峰为黄芩苷，设为参照峰。
作为优选方案，骤(2)和步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1～2‰磷酸水溶液或1～2‰醋酸水溶性，B相为乙腈或甲醇，梯度洗脱，流动相流速为0.8～1ml/min；检测波长为280～300nm；柱温为25～45℃。
作为更加优选方案，以上所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，步骤(2)和步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为1ml/min；检测波长为280nm；柱温为30℃。
作为更优选方案，色谱柱选用phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm的色谱柱。
作为优选方案，以上所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，所述的梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 1‰磷酸水溶液/体积百分数 乙腈/体积百分数
0.0 95 5
35.0 65 35
60.0 15 85
65.0 15 85
本发明精密称定黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含200μg的溶液，按以上优选的色谱条件进行高效液相色谱分析，和以上指纹图谱的10号峰具有相同的保留时间。本发明选用10号峰即黄芩苷为参照峰。
作为优选方案，所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物由下列重量份数原料制成：
羚羊角8～12份、人工牛黄8～12份、平贝母12～20份、大黄20～35份、黄芩10～18份、生石膏15～25份、青礞石10～18份和甘草20～35份。
上述原料按照中国专利ZL02129192.6中所公开的制备方法制成口服制剂。
本发明提供的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的原料药材的检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：分别取处方中羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏和青礞石原料药材各0.5g，分别精密加50％乙醇25ml，超声提取30min，然后1500～2000转/分钟，离心，取离心液作为供试品溶液；
(2)分别取处方中的羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏和青礞石原料药材的供试品溶液，按以下色谱条件进行高效液相色谱法测定；
步骤(2)和步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选用phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm的色谱柱)；流动相：A相为1～2‰磷酸水溶液或1～2‰醋酸水溶性，B相为乙腈或甲醇，梯度洗脱，流动相流速为0.8～1ml/min；检测波长为280～300nm；柱温为25～45℃。
梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 1‰磷酸水溶液/体积百分数 乙腈/体积百分数
0.0 95 5
35.0 65 35
60.0 15 85
65.0 15 85
(3)取原料药材成分色谱图和上述中药组合物的对照指纹图谱相比，大黄供试品溶液中含有1、2、4、9、14、16、17号峰成分；人工牛黄供试品溶液中含有5号峰，甘草供试品溶液中含有7、8、11号峰；黄芩供试品溶液中含有6、9、10、12、13号峰。3号峰来源于羚羊角。15号峰为共煎煮产生的化合物峰。
作为优选方案，以上色谱条件为:色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(优选用phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm的色谱柱)；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为1ml/min；检测波长为280nm；柱温为30℃；
本发明所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法在评价该中药组合物成品质量中的应用。
本发明所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物原料药材检测方法在评价该中药组合物的原料药材质量中的应用。
本发明将供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度评价软件(选用中国药典委推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”)计算，获得指纹图谱相似度数值，依据相似度数值，应用于具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准；本发明提供的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物指纹图谱检测方法及其原料药材检测方法，用于生产检验，质量控制，所得产品具有较高的质量稳定性，可确保产品安全有效。
本发明提供的一种中药组合物的指纹图谱检测方法的最佳条件筛选过程：
1、仪器与试剂
Agilent1100液相色谱仪；MWD多波长紫外－可见检测器,G1313A全自动进样器，AgilentLC色谱工作站。
试剂：乙腈，色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2、流动相种类的筛选
由于本发明所述中药组合物活性成分复杂，本发明通过大量实验筛选了甲醇－水，乙腈－水，甲醇－磷酸水溶液，乙腈－磷酸水溶液，甲醇－醋酸水溶液和乙腈－醋酸水溶液体系等流动相。考虑到所述中药组合物中存在大黄酸等酸性成分，在流动相中加入酸有利于峰形改善，在乙腈－水体系、甲醇-水体系中加入一定量的乙酸。如图3至图4所示：通过比较不同流动相的显示峰的数目，分离度和峰形等，最后优选的流动相为：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，并采用优选的梯度洗脱程序洗脱，各色谱峰分离很好，保留时间适宜，达到指纹图谱信息最大化原则，且重现性和稳定性优。
3、检测波长的选择
如图5液相指纹图谱PDA图和图6所示，比较210nm、240nm、280nm、300m和330nm等波长下的指纹图谱，实验结果表明，在280nm处，中药组合物各成分具有明显的吸收峰，提供的化学成分信息量大，因此，本发明优选280nm作为测定波长，可得到理想的色谱图。
4、柱温的选择
本发明分别在25℃、30℃、35℃和40℃柱温下分析所述中药组合物，对比各柱温下的色谱图，实验结果表明，在25至40℃条件下，色谱峰分离较好，尤其在30℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，更优选30℃为最佳柱温条件。
5、色谱柱的选择
如图7和图8所示，本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，采用多种不同型号的色谱柱进行测定：
色谱检测结果表明，phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm色谱柱可将样品达到基线分离，各色谱峰分离度良好，重现性和稳定性好，可以建立稳定的指纹图谱。
经过上述大量实验筛选，本发明优选的最佳色谱条件为：优选用phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm的色谱柱；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为1ml/min；检测波长为280nm；柱温为30℃；
梯度洗脱方式如下表所示：
本发明所述指纹图谱检测方法的精密度试验：
取批号为090201的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物，按上述步骤(1)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照上述步骤(2)指纹图谱优选的色谱条件连续进样6次，进行测定。考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果17个共有峰的相对保留时间的RSD≤0.15％，相对峰面积＞3％的共有峰的相对峰面积值RSD≤1.5％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均大于0.99，符合指纹图谱的技术要求。表明本发明提供的指纹图谱检测方法精密度良好。
本发明所述指纹图谱检测方法的稳定性试验：
取批号为090201的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物，按上述步骤(1)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按步骤(2)指纹图谱优选的色谱条件于0、3、6、9、12小时分别测定一次指纹图谱，共测5次，考察17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果各共有峰相对保留时间RSD≤1.5％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值RSD≤2.0％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均大于0.99，表明本发明提供的指纹图谱检测方法，在12小时内是稳定的。
本发明所述的指纹图谱检测方法的重复性试验：
取批号为090201的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物，按上述步骤(1)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按步骤(2)指纹图谱优选的色谱条件于0、3、6、9、12小时分别测定一次指纹图谱，共测5次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果各共有峰相对保留时间RSD≤2.0％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值RSD≤2.0％，并以第1次进样所得指纹图谱作为参照，计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均大于0.99，表明本发明提供的指纹图谱检测方法的重复性好。
根据以上方法学考察结果表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，具有很好的精密度、重复性和稳定性，可以全面、客观、准确的检测和评价具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的质量，对保证临床疗效具有重要意义。
有益效果：本发明提供的中药组合物指纹图谱检测方法及其原料药材检测方法，具有以下优点：
1、本发明针对现有技术检测方法的诸多不足，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱方式，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，可建立良好的指纹图谱。采用本发明提供的中药组合物指纹图谱检测方法，可以同时检测该中药组合物中的17个活性成分，从而可以全面、客观、准确的检测和评价该中药组合物的质量，对保证临床疗效具有重要意义。
2、本发明提供的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的原料药材的检测方法，能够准确测定和评价各原料药材的质量，为具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物从源头上保证原料药材的安全，有效，把好质量关具有重要的意义。
附图说明
图1为具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的对照指纹图谱。
图2为具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物供试品指纹图谱。
图3为不同流动相的色谱图。
图4为不同流动相的色谱图。
图5为液相指纹图谱PDA图。
图6为不同检测波长下的色谱图。
图7为不同色谱柱的色谱图。
图8为不同色谱柱的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所述中药组合物由羚羊角(9.45重量份)、人工牛黄(9.45重量份)、平贝母(17.25重量份)、大黄(31.50重量份)、黄芩(15.75重量份)、生石膏(23.62重量份)、青礞石(15.75重量份)和甘草(31.50重量份)组成，按照中国专利ZL02129192.6中所公开的制备方法制成口服制剂。
实施例1中药组合物指纹图谱的建立及应用
1、所述中药组合物的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：将中药组合物加50％乙醇超声提取2次，每次30分钟，提取液在1500～3000转/分钟，离心，取离心液用微孔滤膜滤过，得到供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批所述中药组合物按照步骤(1)的方法制备供试品，在适当的色谱条件下进样，测得各批次中药组合物的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，计算获得共有模式作为对照指纹图谱，如图1所示，指纹图谱中共检测到17个共有指纹峰，具体保留时间(min)如下表所示：
以10号峰为S峰，各峰相对保留时间为出峰时间与S峰出峰时间比值，允许范围为±20％
色谱条件为：phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm色谱柱；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为1ml/min；检测波长为280nm；柱温为30℃。所述的梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 1‰磷酸水溶液/体积百分数 乙腈/体积百分数
0.0 95 5
35.0 65 35
60.0 15 85
65.0 15 85
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：另取10批中药组合物按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱，如图2所示；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)进行评价，具体实验结果如表1所示：相似度均大于0.9。
表1中药组合物样品及相似度评价结果
批号 相似度 批号 相似度
090201 0.998 090601 0.985
090302 0.997 090602 0.985
090401 0.989 090801 0.999
090402 0.999 090802 0.998
090501 0.987 090803 0.987
表1的计算结果表明，各批次中药组合物指纹图谱相似度较高，均大于0.90，表明生产工艺较稳定，质量均一性好。同时也证明，采用本发明提供的指纹图谱检测方法可以全面客观的反映该中药组合物的质量，对保证临床疗效具有重要的意义。
实施例2中药组合物指纹图谱的建立及应用
1、所述中药组合物的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：将中药组合物加50％乙醇超声提取2次，每次30分钟，提取液在1500～3000转/分钟，离心，取离心液用微孔滤膜滤过，得到供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批所述中药组合物按照步骤(1)的方法制备供试品，在适当的色谱条件下进样，测得各批次中药组合物的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，计算获得共有模式作为对照指纹图谱，指纹图谱中共检测到17个共有指纹峰，具体保留时间(min)
以10号峰为S峰，各峰相对保留时间为出峰时间与S峰出峰时间比值，允许范围为±20％；
色谱条件为：phenomenexLunaC184.6×250mm，5μm色谱柱；流动相：A相为2‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为0.8ml/min；检测波长为300nm；柱温为35℃。所述的梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 1‰磷酸水溶液/体积百分数 乙腈/体积百分数
0.0 95 5
35.0 65 35
60.0 15 85
65.0 15 85
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：另取10批中药组合物按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)进行评价，具体实验结果如表2所示：相似度均大于0.9。
表2中药组合物样品及相似度评价结果
批号 相似度 批号 相似度
090201 0.997 090601 0.987
090302 0.997 090602 0.986
090401 0.989 090801 0.999
090402 0.999 090802 0.998
090501 0.988 090803 0.991
表2的计算结果表明，各批次中药组合物指纹图谱相似度较高，均大于0.90，表明生产工艺较稳定，质量均一性好。同时也证明，采用本发明提供的指纹图谱检测方法可以全面客观的反映该中药组合物的质量，对保证临床疗效具有重要的意义。
3、具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的原料药材的检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：分别取处方中羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、青礞石和甘草原药材各0.5g，分别精密加50％乙醇25ml，超声提取30min，然后1500～2000转/分钟，离心，取离心液作为供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测得原料药材的对照指纹图谱：分别取10批羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、青礞石和甘草原药材，按步骤(1)方法制备得到各原料药材的供试品溶液；按下述色谱条件测得每批原料药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为原料药材对照指纹图谱；
色谱条件为:色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为1ml/min；检测波长为280nm；柱温为35℃；
梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 1‰磷酸水溶液/体积百分数 乙腈/体积百分数
0.0 95 5
35.0 65 35
60.0 15 85
65.0 15 85
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)的供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件测定，测得各原料药材的供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价，结果表明：10批羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、青礞石和甘草原药材相似度较高，均大于0.90。
并且测得的羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、青礞石和甘草原药材供试品指纹图谱和和实施例1所述中药组合物对照指纹图谱相比，大黄供试品溶液指纹图谱中中含有1、2、4、9、14、16、17号峰成分；人工牛黄供试品溶液指纹图谱中含有5号峰，甘草供试品溶液指纹图谱中含有7、8、11号峰；黄芩供试品溶液指纹图谱中含有6、9、10、12、13号峰。本发明提供的中药组合物的原料药材的检测方法，可用于评价成品和原料药材之间的相关性，并且能够准确测定和评价各原料药材的质量。
通过以上实验结果表明，本发明提供的指纹图谱检测方法，可以客观，全面，有针对性的分析和评价所述中药组合物成品及原料药材的质量，对保证临床疗效具有重要意义。本发明提供的指纹图谱检测方法，可以同时用于分析原料药材和成品制剂，较现有技术单个分析原料药材或中药组合物中的一种成分，具有明显的技术进步。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取中药组合物，加乙醇超声提取，取提取液在1500～3000转/分钟，离心，取离心液用微孔滤膜滤过，得到供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测定对照指纹图谱：取10批以上中药组合物按步骤(1)方法制备得到供试品，在适当的色谱条件下进样，测得各批次中药组合物的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算获得共有模式作为对照指纹图谱；
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)制备的供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价，相似度大于0.9。
2.根据权利要求1所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1～2‰磷酸水溶液或1～2‰醋酸水溶性，B相为乙腈或甲醇，梯度洗脱，流动相流速为0.8～1ml/min；检测波长为280～300nm；柱温为25～45℃。
3.根据权利要求2所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为0.8～1ml/min；检测波长为280nm；柱温为35～45℃。
4.根据权利要求2所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 A/体积百分数 B/体积百分数 0.0 95 5 35.0 65 35 60.0 15 85 65.0 15 85
。
5.根据权利要求1至4任一项所述的中药组合物的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的中药组合物由下列重量份数的原料制成：
羚羊角8～12份、人工牛黄8～12份、平贝母12～20份、大黄20～35份、黄芩10～18份、生石膏15～25份、青礞石10～18份和甘草20～35份。
6.具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的原料药材的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：分别取处方中羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、青礞石和甘草原药材各0.5g，分别精密加50％乙醇25ml，超声提取30min，然后1500～2000转/分钟，离心，取离心液作为供试品溶液；
(2)高效液相色谱法测得原料药材的对照指纹图谱：分别取10批羚羊角、人工牛黄、平贝母、大黄、黄芩、生石膏、青礞石和甘草原药材，按步骤(1)方法制备得到各原料药材的供试品溶液；按下述色谱条件测得每批原料药材的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为原料药材对照指纹图谱；
色谱条件为:色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1～2‰磷酸水溶液或1～2‰醋酸水溶性，B相为乙腈或甲醇，梯度洗脱，流动相流速为0.8～1ml/min；检测波长为280～300nm；柱温为25～45℃；
梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 A/体积百分数 B/体积百分数 0.0 95 5 35.0 65 35 60.0 15 85 65.0 15 85
(3)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)的供试品溶液按步骤(2)相同的色谱条件测定，测得各原料药材的供试品溶液的指纹图谱；
(4)将步骤(3)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(2)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。
7.根据权利要求6所述的具有防治感冒及急、慢性气管炎功效的中药组合物的原料药材的检测方法，其特征在于，
步骤(2)中的色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为1‰磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱，流动相流速为0.8～1ml/min；检测波长为280nm；柱温为35～45℃；
梯度洗脱方式如下表所示：
时间/分钟 1‰磷酸水溶液/体积百分数 乙腈/体积百分数 0.0 95 5
35.0 65 35 60.0 15 85 65.0 15 85
。
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