CN105842353A

CN105842353A - 银翘清热片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

Info

Publication number: CN105842353A
Application number: CN201610159119.2A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 王伟; 付娟; 徐凤莲; 秦建平; 李家春; 黄文哲; 王振中
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-03-18
Filing date: 2016-03-18
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2036-03-18
Also published as: CN105842353B

Abstract

本发明公开了银翘清热片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。银翘清热片指纹图谱的建立方法包括以下步骤：步骤1，制备银翘清热片供试品溶液；步骤2，分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤3，将步骤2中获得的银翘清热片指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次银翘清热片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成银翘清热片的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。用本发明所提供的方法所建立的银翘清热片指纹图谱，能有效地表征银翘清热片的质量，有利于全面监控药物的质量。本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

银翘清热片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明涉及一种银翘清热片指纹图谱的建立方法，以及利用上述方法建立的银翘清热片指纹图谱。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且已积累较丰富的应用经验，因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC-MS和GC-MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。

银翘清热片处方为临床经验方，由金银花、葛根、连翘、牛蒡子、薄荷、板蓝根等9味药材组成，具有辛凉解表，清热解毒的功效，用于风热型普通感冒和流行性感冒。该制剂现执行标准已经对绿原酸、连翘苷和牛蒡苷三个成分进行了定量分析，但由于银翘清热片药味繁多，成分复杂，个别成分的定性定量分析仍难以全面反应药品的全面信息，为更有效地控制银翘清热片的质量，本发明针对银翘清热片药效成分建立了制剂的指纹图谱。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种银翘清热片指纹图谱的建立方法。

本发明的第二目的是提供一种银翘清热片指纹图谱。

为了实现上述第一目的，本发明提供一种银翘清热片指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

步骤1，制备银翘清热片供试品溶液：提供不同批次的银翘清热片供试品，分别取一定重量银翘清热片供试品置于容器中，向容器中加入甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，过滤，取滤液即得供试品溶液；参照峰溶液为一定浓度的葛根素溶液；

步骤2，分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；

步骤3，将步骤2中获得的银翘清热片指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次银翘清热片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成银翘清热片的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

本发明如上所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤1的具体过程为：取银翘清热片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，250W/40kHz超声处理20min。

本发明如上所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，优选地，在步骤2中，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录85分钟的色谱图。

本发明如上所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，优选地，在步骤2中，银翘清热片指纹图谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为25℃；理论板数按葛根素峰计算不低于5000；梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相A，95→90％流动相B；10～15分钟，10→11％流动相A，90→89％流动相B；15～25分钟，11→13％流动相A，89→87％流动相B；25～50分钟，13→20％流动相A，87→80％流动相B；50～65分钟，20→32％流动相A，80→68％流动相B；65～80分钟，32→60％流动相A，68→40％流动相B；80～85分钟，60％流动相A，40％流动相B。

本发明如上所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，优选地，色谱柱规格为：KromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm。

本发明如上所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤1的具体过程为：取银翘清热片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，250W/40kHz超声处理20min；

在步骤2中，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录85分钟的色谱图；

银翘清热片指纹图谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为25℃；理论板数按葛根素峰计算不低于5000；梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相A，95→90％流动相B；10～15分钟，10→11％流动相A，90→89％流动相B；15～25分钟，11→13％流动相A，89→87％流动相B；25～50分钟，13→20％流动相A，87→80％流动相B；50～65分钟，20→32％流动相A，80→68％流动相B；65～80分钟，32→60％流动相A，68→40％流动相B；80～85分钟，60％流动相A，40％流动相B；色谱柱规格为：KromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm。

一种银翘清热片指纹图谱，其特征峰为与新绿原酸对应的3号峰，与绿原酸对应的5号峰，与隐绿原酸对应的8号峰，与葛根素对应的S号峰，与大豆苷对应的13号峰，与连翘酯苷A对应的18号峰，与峰异绿原酸C对应的22号峰，与连翘苷对应的23号峰，与牛蒡苷对应的25号峰，其相对保留时间分别为0.53、0.76、0.86、1.00、1.32、1.80、2.25、2.44、2.48。

此外，特征峰还包括：相对保留时间为0.21的1号峰、相对保留时间为0.45的2号峰、相对保留时间为0.73的4号峰、相对保留时间为0.79的6号峰、相对保留时间为0.82的7号峰、相对保留时间为1.02的10号峰、相对保留时间为1.08的11号峰、相对保留时间为1.12的12号峰、相对保留时间为1.34的14号峰、相对保留时间为1.64的15号峰、相对保留时间为1.73的16号峰、相对保留时间为1.78的17号峰、相对保留时间为1.95的19号峰、相对保留时间为2.04的20号峰、相对保留时间为2.11的21号峰、相对保留时间为2.45的24号峰、相对保留时间为2.61的26号峰、相对保留时间为2.86的27号峰、相对保留时间为2.91的28号峰。

本发明的有益效果是：

1、用本发明所提供的方法所建立的银翘清热片指纹图谱，能有效地表征银翘清热片的质量，有利于全面监控药物的质量。

2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定银翘清热片质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。

附图说明

图1-1～1-6为本发明一种实施例的洗脱梯度考察图谱；

图2-1～2-3为本发明一种实施例的洗脱系统考察图谱；

图3-1～3-3为本发明一种实施例的不同色谱柱考察图谱；

图4-1～4-3为本发明一种实施例的不同流速考察图谱；

图5-1～5-4为本发明一种实施例的不同柱温考察图谱；

图6为本发明一种实施例的14批银翘清热片指纹图谱；

图7为本发明一种实施例的银翘清热片对照指纹图谱；

图8为本银翘清热片指纹图谱中各共有峰归属色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提供一种银翘清热片指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

步骤1，制备银翘清热片供试品溶液：提供不同批次的银翘清热片供试品，分别取银翘清热片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，250W/40kHz超声处理20min，冷却，摇匀，过滤，取滤液即得供试品溶液；参照峰溶液为一定浓度的葛根素溶液；

步骤2，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录85分钟的色谱图；

银翘清热片指纹图谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为25℃；理论板数按葛根素峰计算不低于5000；梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相A，95→90％流动相B；10～15分钟，10→11％流动相A，90→89％流动相B；15～25分钟，11→13％流动相A，89→87％流动相B；25～50分钟，13→20％流动相A，87→80％流动相B；50～65分钟，20→32％流动相A，80→68％流动相B；65～80分钟，32→60％流动相A，68→40％流动相B；80～85分钟，60％流动相A，40％流动相B。优选地，色谱柱规格为：KromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm。

1、仪器与试剂

仪器：

Agilent1200高效液相色谱仪，MWD检测器；

METTLER TOLEDO AL204型电子分析天平

METTLER TOLEDOXP6型电子分析天平；

Milli-QAcademic纯水机；

KQ-250DB型数控超声波清洗器。

对照品：葛根素，批号：110752-201313，纯度：95.5％，购自中国食品药品检定研究院。

试剂：乙腈，色谱纯，美国天地公司，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2、药品来源

本发明用银翘清热片的批号分别为：101001、101101、101102、110301、110302、110303、110401、120601、120602、120603、120701、140401、140402、140403，均由江苏康缘药业股份有限公司生产。

3、参照物

葛根素为银翘清热片含量测定的指标成分，含量较稳定，且在图谱中保留时间适中、分离度较好，因此选择葛根素作为参照物。

4、色谱条件

供试品进行色谱检测的基本步骤如下：

步骤1，制备银翘清热片供试品溶液：取批号为140401批的银翘清热片0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25ml，250W-40kHz超声处理20min，冷却，摇匀，过滤，取滤液即得；

步骤2，银翘清热片指纹图谱测定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：KromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％磷酸为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为25℃；理论板数按葛根素峰计算不低于5000；

表1梯度洗脱表

步骤3，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录85分钟的色谱图。

4.1检测波长的选择

除检测波长条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。使用DAD检测器对样品进行190～600nm全波长扫描，并对等吸收图进行分析，提取吸收峰较多的三个波长(230nm、280nm、330nm)下的色谱图进行比较，显示230nm检测波长能较全面的反映银翘清热片中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，因此选择230nm作为银翘清热片指纹图谱的采集波长。

4.2洗脱梯度考察

除洗脱梯度条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：KromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％磷酸为流动相B，对梯度程序进行优化(如表2)；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为25℃。根据试验结果(见图1-1～1-6)，选择洗脱程序VI为指纹图谱洗脱条件。

表2-1溶剂洗脱程序Ⅰ

表2-2溶剂洗脱程序II

表2-3溶剂洗脱程序III

表2-4溶剂洗脱程序IV

表2-5溶剂洗脱程序Ⅴ

表2-6溶剂洗脱程序VI

4.3色谱条件的优化

洗脱系统的选择

除洗脱系统条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。考虑到金银花、连翘中含有大量有机酸类、苯乙醇苷类成分，选用乙腈-酸水系统进行研究。比较了乙腈-三氟乙酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液系统，结果显示乙腈-三氟乙酸水溶液基线漂移，乙腈-甲酸水溶液系统各成分响应较小，基线噪音高，因此选用乙腈-磷酸水溶液作为流动相洗脱系统。结果见图2-1～2-3。

色谱柱考察

除色谱柱条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为：KromasilC₁₈(250×4.6mm，5μm)、WatersSymmmetryC₁₈(4.6×250mm，5μm)和LunaC₁₈(4.6×250mm，5μm)。结果显示，KromasilC₁₈(250×4.6mm，5μm)对样品的分离效果较好，用2支该类型的色谱柱进行试验，结果重复性较好，因此选择用该类型色谱柱为银翘清热片指纹图谱分析柱。结果见图3-1～3-3。

流速考察

除流速条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。考察流速为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min所得图谱，结果流速为1.0ml/min时各成分分离度和峰形较好，选择流速为1.0ml/min，结果见图4-1～4-3。

柱温考察

除柱温条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。考察柱温为20℃、25℃、30℃和35℃所得图谱，结果柱温为20℃、25℃时各个成分分离度和色谱峰的对称性均较好，考虑到实验室和仪器的控温能力，选择柱温为25℃，结果见图5-1～5-4。

5供试品溶液的制备

5.1提取方法的选择

除提取方式条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为140401批的银翘清热片，研细，称取2份，每份约0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，考察超声提取(250W，40KHz)30分钟和回流提取30分钟，放冷，滤过，取续滤液，测定，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标，试验结果表明，超声与回流两种方式提取效果相当，考虑到超声提取操作简单易行，选择超声提取法。

5.2提取溶剂的选择

除提取溶剂条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为140401批的银翘清热片，研细，称取5份，每份约0.2g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、体积百分比浓度为50％甲醇、100％甲醇、体积百分比浓度为50％乙醇、体积百分比浓度为70％乙醇各25ml，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，测定，以色谱峰峰型、色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，50％甲醇和甲醇提取的样品信息较全面，色谱峰个数和主峰面积与称样量比值没有显著差异，选择50％甲醇为提取溶剂。

5.3提取时间的选择

除提取时间条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为140401批的银翘清热片，研细，称取4份，每份约0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，分别超声提取(250W，40KHz)10、20、30、40分钟，放冷，滤过，取续滤液，测定，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，超声20分钟样品中各成分已提取充分，因此选择提取时间为20分钟。

5.4溶剂用量的选择

除溶剂用量条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。取批号为140401批的银翘清热片，研细，称取3份，每份约0.2g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入体积百分比浓度为50％甲醇10mi、25ml、50ml，超声提取(250W，40KHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，测定，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，溶剂用量在10～50ml之间，各色谱峰均提取较充分，而溶剂用量为10ml时，样品黏度大，难于处理，选择溶剂用量为25ml。

综合上述试验结果，确定银翘清热片指纹图谱供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25ml，超声(250W，40kHz)处理20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

6方法学验证

6.1精密度试验

取批号为140303批的银翘清热片，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，精密吸取供试品10μl，重复进样6次，记录色谱图。计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间和相对峰面积。结果见表3、表4。结果表明仪器精密度良好。

表3银翘清热片指纹图谱精密度考察结果(相对保留时间)

表4银翘清热片指纹图谱精密度考察结果(相对峰面积)

6.2稳定性试验

取批号为140303批的银翘清热片，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，同一供试品溶液分别于0h、3h、8h、11h、16和24h进样，记录指纹色谱图谱，共测定6个时间点，计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间和相对峰面积。结果见表5和表6。结果表明供试品溶液在室温条件下24小时内稳定性良好。

表5银翘清热片指纹图谱稳定性考察结果(相对保留时间)

表6银翘清热片指纹图谱稳定性考察结果(相对峰面积)

6.3重复性试验

取批号为140303批的银翘清热片，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，同法制备供试品溶液6份，依法测定。计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间和相对峰面积，结果见表7、表8。结果表明该方法重复性良好。

表7银翘清热片指纹图谱重复性考察结果(相对保留时间)

表8银翘清热片指纹图谱重复性考察结果(相对峰面积)

7指纹图谱的建立

7.114批银翘清热片指纹图谱的检测

取批号分别为：101001、101101、101102、110301、110302、110303、110401、120601、120602、120603、120701、140401、140402、140403的银翘清热片，按照供试品进行色谱检测的基本步骤进行检测，不同批次的银翘清热片指纹图谱见图6。

7.2共有峰的确定及对照指纹图谱的获得

将14批银翘清热片指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(如图6)。选择14批银翘清热片指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成银翘清热片的对照指纹图谱，见图7。计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积和相似度，结果见表9～11。

表9-114批银翘清热片指纹图谱测定结果1(相对保留时间)

表9-214批银翘清热片指纹图谱测定结果2(相对保留时间)

表10-114批银翘清热片指纹图谱测定结果1(相对峰面积)

表10-214批银翘清热片指纹图谱测定结果2(相对峰面积)

表1114批银翘清热片指纹图谱相似度结果

7.3指纹图谱技术参数的确定

上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，14批银翘清热片指纹图谱相似度均在0.95以上，因此暂定银翘清热片指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

8银翘清热片指纹图谱成分来源分析

通过与处方中的九味药材制备的样品图谱比较，结果显示银翘清热片指纹图谱中的成分主要来自葛根、金银花、连翘、牛蒡子、知母和升麻药材。其中1、15、17、18、19、23、26号峰来源于连翘，3、5、6、7、8、14、20、21、22号峰来源于金银花，2号峰来源于连翘和升麻，4、S、11、12、13、24号峰来源于葛根，25、27、28号峰来源于牛蒡子，10号峰来源于知母，16来源于升麻。见图8。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种银翘清热片指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1的具体过程为：取银翘清热片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，250W/40kHz超声处理20min。

3.根据权利要求3所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤2中，分别精密吸取参照峰溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录85分钟的色谱图。

4.根据权利要求1所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，其特征在于，在步骤2中，银翘清热片指纹图谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积百分比浓度为0.1％磷酸为流动相B进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为230nm；柱温为25℃；理论板数按葛根素峰计算不低于5000；梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相A，95→90％流动相B；10～15分钟，10→11％流动相A，90→89％流动相B；15～25分钟，11→13％流动相A，89→87％流动相B；25～50分钟，13→20％流动相A，87→80％流动相B；50～65分钟，20→32％流动相A，80→68％流动相B；65～80分钟，32→60％流动相A，68→40％流动相B；80～85分钟，60％流动相A，40％流动相B。

5.根据权利要求4所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，其特征在于，色谱柱规格为：KromasilC₁₈，250mm×4.6mm，5μm。

6.根据权利要求1所述的银翘清热片指纹图谱的建立方法，其特征在于，

步骤1的具体过程为：取银翘清热片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入体积百分比浓度为50％甲醇25ml，250W/40kHz超声处理20min；

7.一种银翘清热片指纹图谱，其特征在于，其特征峰为与新绿原酸对应的3号峰，与绿原酸对应的5号峰，与隐绿原酸对应的8号峰，与葛根素对应的9号峰，与大豆苷对应的13号峰，与连翘酯苷A对应的18号峰，与异绿原酸C对应的22号峰，与连翘苷对应的23号峰，与牛蒡苷对应的25号峰，其相对保留时间分别为0.53、0.76、0.86、1.00、1.32、1.80、2.25、2.44、2.48。

8.根据权利要求7所述的银翘清热片指纹图谱，其特征在于，特征峰还包括：相对保留时间为0.21的1号峰、相对保留时间为0.45的2号峰、相对保留时间为0.73的4号峰、相对保留时间为0.79的6号峰、相对保留时间为0.82的7号峰、相对保留时间为1.02的10号峰、相对保留时间为1.08的11号峰、相对保留时间为1.12的12号峰、相对保留时间为1.34的14号峰、相对保留时间为1.64的15号峰、相对保留时间为1.73的16号峰、相对保留时间为1.78的17号峰、相对保留时间为1.95的19号峰、相对保留时间为2.04的20号峰、相对保留时间为2.11的21号峰、相对保留时间为2.45的24号峰、相对保留时间为2.61的26号峰、相对保留时间为2.86的27号峰、相对保留时间为2.91的28号峰。