CN107807190A - 一种测定雪胆中3种活性成分的hplc方法 - Google Patents
一种测定雪胆中3种活性成分的hplc方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法,所述活性成分为雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸,包括如下操作步骤:a、取待检雪胆粉末,以乙醇提取,过滤,制备供试品溶液;b、取雪胆甲素、雪胆乙素、齐墩果酸对照品,混合,加乙醇溶解,制备对照品溶液;c、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪检测;d、根据检测结果计算得到雪胆中的3种成分含量。本发明方法可以同时测定雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸这3种成分,方法高效准确且重现性良好,为雪胆的系统评价和质量控制提供依据,可更全面地保障雪胆药材的质量。
Description
技术领域
本发明属于化学分析技术领域,具体涉及一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法。
背景技术
雪胆属(Hemsleya)植物为葫芦科(Cucurbitaceae)多年生攀援草本植物,《中国植物志》记载该属植物共31种10变种,主要分布于我国西南至中南部地区,其中云南、贵州、四川三省份拥有全属植物的92%。该属多种植物的干燥块根可供药用,是我国西南地区各民族常用的中草药、民族药,具有清热解毒、抗菌消炎的功效,广泛用于治疗菌痢、溃疡病、肺炎、支气管炎、肠炎及其他多种感染,具有用量少、效果明显、无依赖性等优点,也被初步判断为可替代抗生素的药品。
雪胆属植物因产地、物种等因素的差异,致使其所含的化学成分和含量也不尽相同,不同的标准中所收载的雪胆属植物不尽相同,导致药材来源混乱,质量参差不齐。《新华本草纲要》收载的雪胆属植物有曲莲(H.amabilis)、雪胆(H.chinensis)和罗锅底(H.macrosperma)。《四川省中药材标准》收载的雪胆属植物有长果雪胆(H.dolichocarpa)、峨眉雪胆(H.omeiensis)和巨花雪胆(H.gigantha)。《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)中收载的雪胆属植物有蛇莲(H.sphaerocarpa)和中华雪胆(H.chinensis)。目前主要从水分、总灰分和浸出物等方面评价雪胆药材的品质,该方法不能全面真实地体现被控药材的品质。
现代研究表明,雪胆属植物的主要活性成分为雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸等,然而,目前关于雪胆质量控制的报道多测定其中1类成分。例如何效平等,高效液相色谱法测定雪胆中雪胆甲素的含量,川北医学院学报,2007,264-266,用HPLC方法只测定了雪胆块根中雪胆甲素的含量,
秦小东等,高效液相色谱-蒸发光散射法测定不同产地雪胆中齐墩果酸的含量,中国临床药理学杂志,2017,33,1582-1584,用HPLC方法只只测定了雪胆中齐墩果酸的含量。尚未见用高效液相色谱法同时测定雪胆中3种活性成分的报道。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的是同时提供一种同时测定雪胆中三种活性成分的HPLC方法,以进一步完善雪胆的质量控制标准。
本发明提供了一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法,所述活性成分为雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸,包括如下操作步骤:
a、取待检雪胆粉末,以乙醇提取,过滤,制备供试品溶液;
b、取雪胆甲素、雪胆乙素、齐墩果酸对照品,混合,加乙醇溶解,制备对照品溶液;
c、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪检测,色谱条件如下:
色谱柱:C18色谱柱;
流动相:流动相A为体积分数为0.1%的磷酸水溶液,B为乙腈,梯度洗脱程序为:
0~20min,5%~20%B;
20~60min,20%~30%B;
60~95min,30%~90%B;
95~100min,90%B;
检测波长:203nm;
d、根据检测结果计算得到雪胆中的3种成分含量。
其中,步骤a中,提取的方法为:回流、超声和/或浸渍。
其中,步骤a中,乙醇提取的方法如下:
取雪胆粉末1重量份,先用25体积份无水乙醇回流提取3小时,然后超声提取60min,即可。
重量份与体积份的对应关系为:g/mL。
其中,步骤c中,所述色谱柱的规格为:内径4.6mm,长度250mm,填料粒径5μm;优选的色谱柱型号为InertSustain C18色谱柱。
其中,所述梯度洗脱程序为:
0~20min,5%B;
20~60min,20%B;
60~95min,30%B;
95~100min,90%B。
其中,所述色谱条件的检测波长为203nm;柱温为35℃;流速为1.0mL/min。
其中,所述供试品溶液的进样量为10μL。
其中,所述雪胆为长果雪胆(H.dolichocarpa)或巨花雪胆(H.gigantha)。
本发明检测方法可以在同一色谱条件下同时测定雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸这3种成分,方法高效准确且重现性良好,为雪胆的系统评价和质量控制提供依据,可更全面地保障雪胆药材的质量。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1对照品的HPLC图;1:雪胆乙素;2:雪胆甲素;3:齐墩果酸。
图2巨花雪胆的HPLC图;1:雪胆乙素;2:雪胆甲素;3:齐墩果酸。
图3长果雪胆的HPLC图;1:雪胆乙素;2:雪胆甲素;3:齐墩果酸。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明,但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明方法测定雪胆的三种活性成分含量
1、供试品溶液的制备
雪胆块根60℃干燥,粉碎,过60目筛。准确称取雪胆粉末1.00g,置于圆底烧瓶中,准确移取25.00mL无水乙醇,称重,回流提取3小时后,恒温超声提取60min,称其质量,用无水乙醇补齐质量,摇匀,经0.22μm微孔滤膜滤过,即得。
2、对照品溶液的制备
分别精密称取雪胆素甲、雪胆素乙和齐墩果酸对照品,加无水乙醇溶解并定容,配制成质量浓度分别为0.62、0.75、0.70mg/mL的混合对照品溶液,备用。
3、3种活性成分含量测定标准曲线的建立
色谱柱为InertSustain C18色谱柱(4.6×250mm,5μm);
流动相为0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱,梯度洗脱程序为:
0min,5%B;
20min,20%B;
60min,30%B;
95min,90%B;
100min,90%B;
检测波长为203nm;柱温为35℃;流速为1.00mL/min。取混合对照品溶液分别进样1、5、10、15、20μL,建立标准曲线,计算每成分线性回归方程。
4、样品中活性成分含量的测定
按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定,进样体积为10μL,利用线性回归方程,计算样品中3种活性成分的含量。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果:
试验例1本发明的方法学验证
1仪器与试剂
1.1仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪,配备InertSustain C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱、自动进样器、DAD检测器、四元泵、柱温箱;KQ-300GDV恒温数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);BT124s电子天平(Sartorius公司);WP-Z-UV实验室超纯水机(四川沃特浦水处理有限公司)。
1.2试剂
雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸标准品(HPLC≥98%,含量以100%计),购自成都瑞芬思生物科技有限公司;乙腈为色谱纯(fisher),无水乙醇为分析纯,水为自制超纯水。
供试材料经四川农业大学生命科学学院杨瑞武教授鉴定为长果雪胆(H.dolichocarpa)和巨花雪胆(H.gigantha),来源见表1。
表1材料来源
二、实验方法
2.1色谱条件与系统适应性
色谱条件为:色谱柱为InertSustain C18,流动相为0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱;流速为1.0mL/min;检测波长203nm,柱温35℃,进样体积为10μL;梯度洗脱程序为0~20min,5%~20%B;20~60min,20%~30%B;60~95min,30%~90%B;95~100min,90%B。
按照实施例1的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液。
在上述色谱条件下,混合对照品溶液和供试品溶液中雪胆乙素、雪胆甲素、齐墩果酸分离良好,结果见图1-3。
2.2标准曲线的建立
准确称取雪胆素甲、雪胆素乙和齐墩果酸对照品,配制成质量浓度分别为0.62、0.075、0.070mg/mL的对照品溶液,分别进样1、5、10、15、20μL,按照实施例1中的色谱条件测定峰面积,以各成分进样量(μg)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程及相关关系。
精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验按常规方法进行。
三、实验结果
3.1线性关系考察
回归方程及相关关系结果见表2。
表2线性回归方程及线性范围
本方法测定三种活性成分在0.070~12.40μg范围内呈良好的线性关系(r≥0.9999)。
可见,各成分对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好,说明本发明方法线性范围广,准确度高。
3.2精密度试验
取混合对照品溶液,按照实施例1的色谱条件,连续进样5次,记录色谱图及共有峰峰面积。结果显示,各共有峰相对保留时间RSD=1.10%,各共有峰相对峰面积RSD=1.71%。
可见,使用本发明色谱系统,各成分的相对标准偏差均远远小于10%,精密度良好。
3.3重复性试验
精密称取同一雪胆粉末1.00g,按实施例1中的制备方法平行制备5份供试品溶液,按实施例1的色谱条件进行测定,记录色谱图及共有峰峰面积。结果显示,各共有峰相对保留时间的RSD=1.32%,各共有峰相对峰面积的RSD=2.51%。
可见,使用本发明方法,各成分的相对标准偏差均远远小于10%,说明本发明方法重复性良好。
3.4稳定性试验
准确称取雪胆粉末1.00g,按实施例1中的制备方法制备供试品溶液,按实施例1的色谱条件,分别于0、4、8、12、24h进行测定,记录色谱图及共有峰峰面积。结果显示,各共有峰相对保留时间RSD=1.26%,各共有峰相对峰面积RSD=1.54%,
可见,供试品溶液配制24h内,使用本发明方法,各成分的相对标准偏差均远远小于10%,稳定性良好。
3.5加标回收率试验
精密称取已知含量的巨花雪胆样品粉末5份,按实施例1的色谱条件测定;加入适量的雪胆甲素,按制备样品供试液的方法处理,测得平均加样回收率为99.85%,RSD=2.40%(n=5)。
可见,使用本发明方法,样品回收率较高,说明本发明方法准确度高。
试验例2本发明方法对不同雪胆的测定结果
取长果雪胆(H.dolichocarpa)和巨花雪胆(H.gigantha)样品,按照实施例1的方法进行测定,根据线性回归方程计算三种活性成分的含量。
结果见表3。
表3种雪胆种3种活性成分的测定结果
可见,本发明方法可以测定不同雪胆块根中的成分含量。
试验例3本发明方法的筛选实验
1、供试品溶液的提取方法筛选
本研究以无水乙醇为提取溶剂,优选回流提取、超声提取和先回流再超声提取三种方法对雪胆中雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸提取率的影响,结果见表4。
其中,先回流再超声方法为:先回流提取3小时后,然后超声提取60min。
表4三种方法对比结果(长果雪胆)
可见,三种方法均可以提取出三种有效成分,其中,以先回流再超声的方法提取效率最高,作为本发明的样品提取方法。
2、测定波长的确定
为全面反映雪胆属植物中的化学组分,本研究采用DAD检测器扫描,对色谱图进行比较,其中在203nm检测波长下得到的色谱峰峰形较好,各峰吸收均匀,各色谱峰之间分离度较好,基线较平稳,因此本实验选择203nm作为雪胆有效成分的检测波长。
综上,本发明检测方法可以在同一色谱条件下同时测定雪胆乙素、雪胆甲素和齐墩果酸这3种成分,方法高效准确且重现性良好,为雪胆的系统评价和质量控制提供依据,可更全面地保障雪胆药材的质量。
Claims (8)
1.一种测定雪胆中3种活性成分的HPLC方法,其特征在于:所述活性成分为雪胆甲素、雪胆乙素和齐墩果酸,包括如下操作步骤:
a、取待检雪胆粉末,以乙醇提取,过滤,制备供试品溶液;
b、取雪胆甲素、雪胆乙素、齐墩果酸对照品,混合,加乙醇溶解,制备对照品溶液;
c、分别将供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪检测,色谱条件如下:
色谱柱:C18色谱柱;
流动相:流动相A为体积分数为0.1%的磷酸水溶液,B为乙腈,梯度洗脱程序为:
0~20min,5%~20%B;
20~60min,20%~30%B;
60~95min,30%~90%B;
95~100min,90%B;
检测波长:203nm;
d、根据检测结果计算得到雪胆中的3种成分含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤a中,提取的方法为:回流、超声和/或浸渍。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤a中,乙醇提取的方法如下:
取雪胆粉末1重量份,先用25体积份无水乙醇回流提取3小时,然后超声提取60min,即可。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤c中,所述色谱柱的规格为:内径4.6mm,长度250mm,填料粒径5μm;优选的色谱柱型号为InertSustain C18色谱柱。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法,其特征在于:所述梯度洗脱程序为:
0~20min,5%B;
20~60min,20%B;
60~95min,30%B;
95~100min,90%B。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法,其特征在于:所述色谱条件的检测波长为203nm;柱温为35℃;流速为1.0mL/min。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法,其特征在于:所述供试品溶液的进样量为10μL。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法,其特征在于:所述雪胆为长果雪胆(H.dolichocarpa)或巨花雪胆(H.gigantha)。
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