CN112763597B - 芪斛楂颗粒多指标含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，所述含量测定方法是以橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵对照品为对照，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸为流动相B的超高效液相色谱法。本发明针对芪斛楂颗粒制剂中四个成分进行了定量考察，建立含量测定方法，并对方法学进行了验证，所提供的含量测定方法精密度高、重复性好、稳定性好、测量结果准确，可有效控制药物质量，为形成科学的芪斛楂颗粒质量控制体系、完善芪斛楂颗粒的质量评价标准奠定了基础。而且本发明同时测定四个成分的含量，可避免因分开多次测定不同成分含量而产生的误差，还能节省时间和成本，并使得同一系统条件下的测定结果更稳定、可靠。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其涉及芪斛楂颗粒多指标含量测定方法。
背景技术
芪斛楂颗粒收载于国家药品标准[WS-5745(B-0745)-2014Z]，系由黄芪、山药、炙甘草、茯苓、石斛、炒麦芽、山楂、木瓜、党参、陈皮、白术11位中药组成，具有健脾和胃、益气固表，消食导滞之功效。用于改善小儿脾胃气虚、厌食，偏食，汗多，大便调，易感冒等症。产品组方独特，疗效确切，市场前景好。芪斛楂颗粒现行质量标准中收载了5个薄层色谱鉴别和一个含量测定，其量化指标单一，需要进一步提升和完善。鉴于此，本申请人对芪斛楂颗粒的定量测定进行了详细研究，根据方中各味药材所含成分的药典规定和文献资料，对各药材的指标成分进行超高液相测定研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了芪斛楂颗粒中四个成分的含量测定方法，为制剂质量检测的定量测定提供了理论和操作基础。
为达到以上目的，本发明技术方案如下：
芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，所述含量测定方法是以橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵对照品为对照，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸为流动相B的超高效液相色谱法。
前述芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：采用C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％磷酸，梯度洗脱；流速0.2mL/min；柱温40℃；检测波长为：甘草酸铵251nm、橙皮苷和甘草素283nm、异甘草素363nm；理论板数按甘草酸铵峰计算不低于2000；
对照品溶液的制备：分别取橙皮苷、甘草素、异甘草素、甘草酸铵4种对照品，精密称定，置于5mL容量瓶中，以甲醇定容，制成浓度依次为393.12、150.72、41.1、731.28μg/ml的混合对照品溶液，摇匀；
供试品溶液的制备：取装量差异项下的芪斛楂颗粒，精密称定，加入70％甲醇，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定：分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5μL注入超高效液相色谱仪，测定，即得。
前述芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，所述梯度洗脱过程为：0～13min，22％～27％A；13～20min，27％～32％A；20～33min，32％～38％A；33～35min，38％～63％A；35～53min，63％～66％A；53～58min，66％～90％A。
前述芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，所述供试品溶液的制备具体为：取装量差异项下的芪斛楂颗粒，研细，混匀，称取3g，精密称定，精密加入70％甲醇25ml,称定重量，80℃回流提取1h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了芪斛楂颗粒中多个成分的定量测定，根据方中各味药材所含成分的药典规定和文献资料，对各药材的指标成分进行超高液相测定研究，改进和完善了现行质量标准中量化指标单一的问题。本发明对黄芪中的两个指标成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷；炙甘草中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素；石斛中的石斛碱；木瓜中的熊果酸和齐墩果酸；党参中的党参炔苷；陈皮中的橙皮苷；白术中的白术内酯I、Ⅱ和Ⅲ逐一进行了含量测定研究，实验采用测定各味药材单独水煎煮提取液以及芪斛楂颗粒样品，结果显示毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量过低，橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸四个成分的含量较高，于是对此四个指标进行了定量考察，建立含量测定方法，并对方法学进行了验证，所提供的含量测定方法精密度高、重复性好、稳定性好、测量结果准确，可有效控制药物质量，为形成科学的芪斛楂颗粒质量控制体系、完善芪斛楂颗粒的质量评价标准奠定了基础。而且本发明同时测定四个成分的含量，可避免因分开多次测定不同成分含量而产生的误差，还能节省时间和成本，并使得同一系统条件下的测定结果更稳定、可靠。
附图说明
图1为芪斛楂颗粒制剂中橙皮苷含量测定专属性试验，其中A1：制剂中陈皮测定系统适用性HPLC图(上：对照；中：制剂；下：阴性；λ＝283nm)；Ⅰ-1：橙皮苷对照品光谱图；Ⅰ-2：制剂中橙皮苷光谱图；
图2为芪斛楂颗粒制剂中甘草素、异甘草素和甘草酸铵含量测定专属性试验，A2、B2、C2为制剂中炙甘草测定系统适用性HPLC图，其中A2：λ＝283nm；B2:λ＝363nm；C2:λ＝251nm(上：对照；中：制剂；下：阴性)；Ⅱ-1：甘草素对照品光谱图，Ⅱ-2：制剂中甘草素光谱图；Ⅲ-1：异甘草素对照品光谱图，Ⅲ-2：制剂中异甘草素光谱图；Ⅳ-1：甘草酸铵对照品光谱图，Ⅳ-2：制剂中甘草酸铵光谱图；
图3为线性关系考察1(其中上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图4为线性关系考察2(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图5为线性关系考察3(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图6为线性关系考察4(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图7为线性关系考察5(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图8为线性关系考察6(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图9为橙皮苷对照品线性关系工作曲线；
图10为甘草素对照品线性关系工作曲线；
图11为异甘草素对照品线性关系工作曲线；
图12为甘草酸铵对照品线性关系工作曲线；
图13为重复性试验-1(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图14为重复性试验-2(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图15为重复性试验-3(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图16为重复性试验-4(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图17为重复性试验-5(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图18为重复性试验-6(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图19为中间精密度1-1(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图20中间精密度1-2(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图21中间精密度1-3(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图22中间精密度2-1(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图23中间精密度2-2(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图24中间精密度2-3(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图25回收率试验准确度-1(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图26回收率试验准确度-2(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图27回收率试验准确度-3(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图28回收率试验准确度-4(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图29回收率试验准确度-5(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图30回收率试验准确度-6(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图31回收率试验准确度-7(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图32回收率试验准确度-8(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图33回收率试验准确度-9(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图34稳定性0h(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图35稳定性2h(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图36稳定性6h(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图37稳定性12h(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图38稳定性24h(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵；
图39稳定性48h(上：λ＝283nm；中：λ＝363nm；下：λ＝251nm)，1橙皮苷；2甘草素；3异甘草素；4甘草酸铵。
具体实施方式
本实施例中所用材料及试剂：
甲醇、乙腈均为色谱纯(美国默克尔)；水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；甘草酸铵(中国食品药品检定研究院，批号：110731-201619，纯度：93％)；橙皮苷(中国食品药品检定研究院，批号：110721-201818，纯度：96.2％)；甘草素(贵州中润四通科技有限公司，批号：DST190726-010,纯度：98％)；异甘草素(贵州中润四通科技有限公司，批号：DST190719-016,纯度：99％)。
磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)。
芪斛楂颗粒(葵花药业集团(贵州)宏奇有限公司，规格：3g/袋，批号：20190701,20190703；规格：10g/袋，批号：20170903,20170907,20171004,20171005,20171102)
本发明实施例1：芪斛楂颗粒多指标含量测定方法：
色谱条件与系统适应性试验：采用C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％磷酸，梯度洗脱：0～13min，22％～27％A；13～20min，27％～32％A；20～33min，32％～38％A；33～35min，38％～63％A；35～53min，63％～66％A；53～58min，66％～90％A；流速0.2mL/min；柱温40℃；检测波长为：甘草酸铵251nm、橙皮苷和甘草素283nm、异甘草素363nm；理论板数按甘草酸铵峰计算不低于2000；
对照品溶液的制备：分别取橙皮苷、甘草素、异甘草素、甘草酸铵4种对照品适量，精密称定，置于5mL容量瓶中，以甲醇定容，制成浓度依次为393.12、150.72、41.1、731.28μg/ml的混合对照品溶液，摇匀；
供试品溶液的制备：取装量差异项下的芪斛楂颗粒，研细、混匀，称取3g，精密称定，置150ml平底烧瓶中，精密加入70％甲醇25ml,称定重量，80℃回流提取1h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定：分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5μL注入超高效液相色谱仪，测定，即得。
实验例：
芪斛楂颗粒多指标含量测定方法的方法学验证：
1仪器
ACQUITY Arc超高效液相色谱仪系统，包括四元低压泵，二极管阵列检测器，自动进样器；SG8200HE型超声波提取器(上海冠特超声仪器有限公司)、TB-2150D型梅特勒-托利多十万分之一天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：XBridge BEH C18(100mm×3mm，2.5μm，Waters公司)；流动相：甲醇(A)-0.05％磷酸(B)，梯度洗脱(0～13min，22％～27％A；13～20min，27％～32％A；20～33min，32％～38％A；33～35min，38％～63％A；35～53min，63％～66％A；53～58min，66％～90％A)；流速：0.2ml/min；温度：40℃；检测波长：251nm(甘草酸铵)、283nm(橙皮苷、甘草素)、363nm(异甘草素)。
2.2对照品溶液的制备同实施例1
2.3供试品溶液的制备同实施例1
2.4阴性样品溶液制备按照芪斛楂颗粒处方比例及其制备工艺，分别制成缺陈皮和炙甘草的阴性样品，按照2.3项下方法制备相应的溶液，即得。
2.5超高效液相色谱测定
分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、缺炙甘草药材和缺陈皮药材的阴性对照液各5μL注入液相色谱仪，记录色谱(图1～2)。从图中可见，橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵的保留时间分别为27、30、41、51分钟左右，在本试验条件下各指标成分峰与其他组分峰的分离度大于1.5，阴性对照无干扰，理论板数以甘草酸铵计算约为5000，故规定理论板数以甘草酸铵峰计算，应不低于2000。
2.6方法学考察
2.6.1线性关系考察
精密量取“2.2”项下制备的混合对照品储备液，以甲醇为溶剂依次2倍稀释成6个浓度的系列对照品溶液，分别精密吸取不同浓度对照品溶液各3μL，注入液相色谱仪，记录色谱(图3～图8)。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表1和(图9～图12)。
表1 4种成分线性范围
2.6.2精密度试验
重复性试验
取芪斛楂颗粒(批号20190703)，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，共6份，按照“2.1”项下色谱条件进样测定(图13～图18)，记录峰面积并计算含量。结果显示橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵的含量RSD分别为2.18％，1.22％，1.54％和1.43％，表明该方法的重复性良好，结果见表2～表5。
表2橙皮苷重复性试验
表3甘草素重复性试验
表4异甘草素重复性试验
表5甘草酸铵重复性试验
中间精密度
在不同时间按上述方法分别制备3份供试品溶液，测定(图19～图24)。第一次测定橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵结果的平均值分别为0.5131mg/g、0.2061mg/g、0.0392mg/g、1.1722mg/g，RSD分别为1.06％、1.16％、0.16％、0.25％(n＝3)；第二次测定橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵结果的平均值分别为0.5100mg/g、0.2076mg/g、0.0393mg/g、1.1899mg/g，RSD分别为1.05％、0.75％、0.89％、0.54％(n＝3)，说明方法的中间精密度良好，结果见表6～表9。
表6橙皮苷中间精密度试验
表7甘草素中间精密度试验
表8异甘草素中间精密度试验
表9甘草酸铵中间精密度试验
2.6.3回收率试验准确度
采用加样回收率试验考察方法的准确度，精密称取已测定橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵含量的制剂(含量分别为0.5163mg/g、0.2059mg/g、0.0395mg/g和1.1928mg/g)，分别按所取样品量中4个指标含量数的50％、100％和150％的量精密加入对照品，照供试品溶液制备方法制备供试液，测定，结果平均回收率分别为100.14％、99.8％、100.85％和100.31％，RSD分别为0.79％、0.90％、0.98％和1.61％。(表10～13；图25～图33)。
表10橙皮苷回收率试验结果
表11甘草素回收率试验结果
表12异甘草素回收率试验结果
表13甘草酸铵回收率试验结果
2.6.4稳定性考察
取同一供试品，按供试品溶液制备方法制备供试液，分别于0、2、6、12、24、48小时进样(图34～图39)，结果峰面积平均值分别为1554481、959229、447987、1774697，RSD分别为0.14％、0.86％、1.11％、0.73％，表明供试品溶液在48小时内稳定(表14)。
表14供试品溶液稳定性考察
3制剂中4种指标成分的含量测定及甘草酸铵的限度规定
按“2.2”和“2.3”项分别制备对照品溶液和供试品溶液，分别进样，记录色谱，测定峰面积，橙皮苷、甘草素、异甘草素按(1)式计算含量，
甘草酸按(2)式计算含量：
式中：
C对：对照品溶液浓度(mg/ml)
A样：供试品溶液峰面积
A对：对照品溶液峰面积
W：供试品称样量(g)
25：供试品溶液稀释体积(ml)
0.98：甘草酸铵转换为甘草酸的转换系数
5批含糖中试样品(20170903、20170907、20171004、20171005、20171102规格：10g/袋)，1批无糖中试样品(20190701；规格：3g/袋)4种指标成分的含量测定结果(表15～18)。
表15 6批样品橙皮苷含量测定结果(mg/g)
表16 6批样品甘草素含量测定结果(mg/g)
表17 6批样品异甘草素含量测定结果(mg/g)
表18 6批样品甘草酸含量测定结果(mg/g)
Claims (2)
1. 芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，其特征在于：所述含量测定方法是以橙皮苷、甘草素、异甘草素和甘草酸铵对照品为对照，以甲醇为流动相A，0 .05％磷酸为流动相B的超高效液相色谱法，具体按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：采用C18色谱柱；流动相A为甲醇，流动相B为0 .05％磷酸，梯度洗脱；流速0 .2mL/min；柱温40℃；检测波长为：甘草酸铵251nm、橙皮苷和甘草素283nm、异甘草素363nm；理论板数按甘草酸铵峰计算不低于2000；
对照品溶液的制备：分别取橙皮苷、甘草素、异甘草素、甘草酸铵4种对照品，精密称定，置于5mL容量瓶中，以甲醇定容，制成浓度依次为393 .12、150 .72、41 .1、731 .28μg/ml的混合对照品溶液，摇匀；
供试品溶液的制备：取装量差异项下的芪斛楂颗粒，精密称定，加入70％甲醇，称定重量，回流提取1h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定：分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液各5μL注入超高效液相色谱仪，测定，即得；
所述梯度洗脱过程为：0～13min，22％～27％A；13～20min，27％～32％A；20～33min，32％～38％A；33～35min，38％～63％A；35～53min，63％～66％A；53～58min，66％～90％A。
2. 根据权利要求1所述芪斛楂颗粒多指标含量测定方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备具体为：取装量差异项下的芪斛楂颗粒，研细，混匀，称取3g，精密称定，精密加入70％甲醇25ml ,称定重量，80℃回流提取1h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
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