CN113917029B - 一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药质量检测的技术领域，本发明提供了一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法。本发明采用廉价易得的熊果酸作为参照物进行一测多评，建立熊果酸与去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3‑表去氢土莫酸、3‑O‑乙酰基‑16α‑羟基‑氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸之间的相对校正因子，通过校正因子计算茯苓中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3‑表去氢土莫酸、3‑O‑乙酰基‑16α‑羟基‑氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量，采用液相色谱法进行测定。本发明可以更好更全面的控制茯苓的质量，同时规避由多种成分含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性，耐用性好。

Description

一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法
技术领域
本发明涉及中药质量检测的技术领域，尤其涉及一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法。
背景技术
茯苓为多孔菌科真菌Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，始载于《神农本草经》，列为上品，其味甘淡，性平，有健脾补中、养心安神、利水渗湿的功能。主要用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症。现代研究表明，茯苓的有效成分主要为多糖和三萜类成分，其中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸，具有显著的药理活性，且含量大于万分之一，可作为中药茯苓含量测定的质量评价指标成分。
目前已有许多方法对茯苓多个三萜成分同时进行含量测定，来评价茯苓药材质量，但需要大量对照品，且茯苓三萜对照品不易获得，价格昂贵，并且没有法定对照品，难以在实际中推广应用。近年来，基于以一种成分为参照物，并确定参照物与其他成分间的相对校正因子(fkm)，从而最终通过计算实现对其他多个指标成分进行同步测定的一测多评法(quantitative analysis ofmulti-components by single-maker QAMS)，已应用于多种中药材及复方制剂的质量控制。因此，提供一种合适参照物并得到该参照物与去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸之间的相对校正因子，再计算其他成分含量，对降低检验成本，提高实验效率，最终实现茯苓多指标同步质量控制具有重要意义。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种高实用性、准确度高、操作简单、节约成本的一测多评法测定茯苓中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸含量的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法，包括如下步骤：
(1)将茯苓粉与甲醇混合醇提后，过滤，收集滤液为供试品溶液；
(2)将熊果酸与去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸混合，加入甲醇溶解、稀释，即得混合对照品溶液；
(3)对混合对照品溶液进行高效液相色谱测定，记录混合对照品溶液中熊果酸、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的色谱峰面积；
以混合对照品溶液中的熊果酸为参照物，按照公式fkm＝fk/fm＝(Wm×Ak)/(Wk×Am)分别计算熊果酸与混合对照品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的相对校正因子，其中，Ak为参照物峰面积，Wk为参照物质量，单位为mg，Am为目标物m的峰面积，Wm为目标物m的质量，单位为mg；
(4)对供试品溶液进行高效液相色谱测定，记录供试品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的色谱峰面积，再通过步骤(3)所述混合对照品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸与熊果酸的相对校正因子，按照公式Wm＝fkm×Wk×Am/Ak分别计算供试品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量。
优选的，步骤(1)中所述茯苓粉的粒径为0.17～0.18mm；
所述茯苓粉与甲醇的用量比为1g:4～6mL。
优选的，步骤(1)中所述醇提过程中进行超声处理，所述超声处理的温度为24～26℃，所述超声处理的功率为240～260W，所述超声处理的时间为28～32min；
所述过滤是采用滤膜进行，所述滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
优选的，步骤(2)所述混合对照品溶液中，所述熊果酸、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的浓度分别为0.1～0.2mg/ml、0.07～0.08mg/ml、0.08～0.09mg/ml、0.08～0.09mg/ml、0.07～0.08mg/ml、0.07～0.08mg/ml、0.08～0.09mg/ml、0.1～0.2mg/ml。
优选的，步骤(3)和步骤(4)中所述高效液相色谱测定的条件均为：流动相中乙腈为A成分，0.1％磷酸-水为B成分；
梯度洗脱条件为：0～26.0min，65.0％A；26.0～34.0min，75.0％A；34.0～45.0min，75.0％A→78.0％A；45.0～53.0min，100.0％A；53.0～59.0min，65.0％A；
检测波长为208～212nm；
流速为0.8～1.2mL/min；
柱温为27～29℃。
本发明还提供了一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法在茯苓质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明选用熊果酸作为参照物进行一测多评法测定茯苓中三萜类成分含量，熊果酸价廉容易得到，不仅可以节省时间成本、劳动成本，而且方法快速、准确，能更全面的知晓茯苓质量。
2、针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本，可以有效检测出茯苓中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸7种成分的含量。
3、通过一测多评法和外标法的结果比较可知一测多评所得的含量计算结果与外标法所得结果相近，在不同的实验条件下，各成分之间的校正因子重现性好(RSD＜5％)，能够有效进行茯苓中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸7种成分含量的测定。
4、在对照品缺乏的情况下，本发明的方法可以应用于茯苓的质量评价，同时测定茯苓中7个化合物的方法简便、快捷，为建立茯苓药材的质量评价提供依据。
5、本发明构建了茯苓三萜类成分的一测多评检测方法，由此可以更好更全面的控制茯苓的质量，同时规避由多种成分含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性，耐用性好。
附图说明
图1为混合对照品的HPLC色谱图(注：1为去氢土莫酸；2为土莫酸；3为猪苓酸C；4为3-表去氢土莫酸；5为3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸；6为去氢茯苓酸；7为茯苓酸；8为熊果酸)；
图2为供试品的HPLC色谱图(注：1为去氢土莫酸；2为土莫酸；3为猪苓酸C；4为3-表去氢土莫酸；5为3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸；6为去氢茯苓酸；7为茯苓酸)。
具体实施方式
本发明提供了一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将茯苓粉与甲醇混合醇提后，过滤，收集滤液为供试品溶液；
(2)将熊果酸与去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸混合，加入甲醇溶解、稀释，即得混合对照品溶液；
(3)对混合对照品溶液进行高效液相色谱测定，记录混合对照品溶液中熊果酸、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的色谱峰面积；
以混合对照品溶液中的熊果酸为参照物，按照公式fkm＝fk/fm＝(Wm×Ak)/(Wk×Am)分别计算熊果酸与混合对照品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的相对校正因子，其中，Ak为参照物峰面积，Wk为参照物质量，单位为mg，Am为目标物m的峰面积，Wm为目标物m的质量，单位为mg；
(4)对供试品溶液进行高效液相色谱测定，记录供试品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的色谱峰面积，再通过步骤(3)所述混合对照品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸与熊果酸的相对校正因子，按照公式Wm＝fkm×Wk×Am/Ak分别计算供试品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量。
在本发明中，步骤(1)中所述茯苓粉的粒径优选为0.17～0.18mm，进一步优选为0.178mm；
所述茯苓粉与甲醇的用量比优选为1g:4～6mL，进一步优选为1g:5mL。
在本发明中，步骤(1)中所述醇提过程中优选进行超声处理，所述超声处理的温度优选为24～26℃，进一步优选为25℃，所述超声处理的功率优选为240～260W，进一步优选为250W，所述超声处理的时间优选为28～32min，进一步优选为30min；
所述过滤优选采用滤膜进行，所述滤膜的孔径优选为0.2～0.5μm，进一步优选为0.45μm。
在本发明中，步骤(2)所述混合对照品溶液中，所述熊果酸、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的浓度分别优选为0.1～0.2mg/ml、0.07～0.08mg/ml、0.08～0.09mg/ml、0.08～0.09mg/ml、0.07～0.08mg/ml、0.07～0.08mg/ml、0.08～0.09mg/ml、0.1～0.2mg/ml，进一步优选为0.1124mg/ml、0.0794mg/ml、0.0834mg/ml、0.0827mg/ml、0.0782mg/ml、0.0794mg/ml、0.0860mg/ml、0.1213mg/ml。
在本发明中，优选取步骤(2)中的混合对照品溶液，分别进样4、6、13、20、31、40μl，以熊果酸为内参，分别计算出去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸七种成分的相对校正因子，分别为1.0435、0.7757、1.0669、1.0801、0.4949、1.3181、0.7291。
在本发明中，步骤(3)和步骤(4)中所述高效液相色谱测定的条件均优选为：液相色谱柱优选采用Thermo Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相中优选乙腈为A成分，优选0.1％磷酸-水为B成分；
梯度洗脱条件优选为：0～26.0min，65.0％A；26.0～34.0min，75.0％A；34.0～45.0min，75.0％A→78.0％A；45.0～53.0min，100.0％A；53.0～59.0min，65.0％A；
检测波长优选为208～212nm，进一步优选为210nm；
流速优选为0.8～1.2mL/min，进一步优选为1.0mL/min；
柱温优选为27～29℃，进一步优选为28℃。
本发明还提供了一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法在茯苓质量控制中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中用到的仪器为戴安U3000高效液相色谱仪(戴安中国有限公司)、Chromeleon色谱工作站、Agilent1260效液相色谱仪(DAD检测器、UV检测器)、FA604C万分之一分析天平(美国奥豪斯公司)、DV215CD十万分之一分析天平(瑞士普利赛思公司)、JP-04OST超声提取机(昆山市超声仪器厂)、色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm，5μm)(赛默飞世尔科技公司)、Agela innoval C18(4.6mm×250mm，5μm)(博纳艾杰尔公司)、Thermo umlsil C18(4.6mm×250mm，5μm)(赛默飞世尔科技公司)、AgilentZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)(安捷伦有限公司)；
以下实施例中的对照品去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸均为实验室自制，经面积归一化法计算质量分数均＞98％，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸为色谱纯；
以下实施例中的茯苓药材收集于各个产地，定量测定的20批次茯苓样品分别采自湖北、云南、安徽、贵州等地，经鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf干燥菌核，详见下表1：
表1 20批茯苓样品信息表
Figure BDA0003298074460000071
实施例1
(1)精密称取样品编号为S1的茯苓细粉(粒径为0.178mm)2g于50mL锥形瓶中，加入甲醇10mL，称重摇匀，于25℃，250W的条件下超声提取30min，静置15min，称重，用甲醇溶液补足损失的溶剂，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
(2)精密称取一定量的去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸，分别置于50ml容量瓶中，作为对照品母液，再分别取一定量的对照品母液于25ml容量瓶中，配置成去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸浓度分别为0.0794mg/ml、0.0834mg/ml、0.0827mg/ml、0.0782mg/ml、0.0794mg/ml、0.0860mg/ml、0.1213mg/ml、0.1124mg/ml的混合对照品溶液。
(3)高效液相色谱条件为：色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相中乙腈为A成分，0.1％磷酸-水为B成分，梯度洗脱条件为：0～26.0min，65.0％A；26.0～34.0min，75.0％A；34.0～45.0min，75.0％A→78.0％A；45.0～53.0min，100.0％A；53.0～59.0min，65.0％A。检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：28℃；进样量20μl。
实施例2
(1)精密称取样品编号为S2的茯苓细粉(粒径为0.17mm)2g于50mL锥形瓶中，加入甲醇8mL，称重摇匀，于24℃，240W的条件下超声提取28min，静置15min，称重，用甲醇溶液补足损失的溶剂，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
(2)精密称取一定量的去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸，分别置于50ml容量瓶中，作为对照品母液，再分别取一定量的对照品母液于25ml容量瓶中，配置成去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸浓度分别为0.0794mg/ml、0.0834mg/ml、0.0827mg/ml、0.0782mg/ml、0.0794mg/ml、0.0860mg/ml、0.1213mg/ml、0.1124mg/ml的混合对照品溶液。
(3)高效液相色谱条件为：色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相中乙腈为A成分，0.1％磷酸-水为B成分，梯度洗脱条件为：0～26.0min，65.0％A；26.0～34.0min，75.0％A；34.0～45.0min，75.0％A→78.0％A；45.0～53.0min，100.0％A；53.0～59.0min，65.0％A。检测波长：208nm；流速：1.0mL/min；柱温：27℃；进样量20μl。
实施例3
(1)精密称取样品编号为S3的茯苓细粉(粒径为0.18mm)2g于50mL锥形瓶中，加入甲醇12mL，称重摇匀，于26℃，260W的条件下超声提取32min，静置15min，称重，用甲醇溶液补足损失的溶剂，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
(2)精密称取一定量的去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸，分别置于50ml容量瓶中，作为对照品母液，再分别取一定量的对照品母液于25ml容量瓶中，配置成去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸浓度分别为0.0794mg/ml、0.0834mg/ml、0.0827mg/ml、0.0782mg/ml、0.0794mg/ml、0.0860mg/ml、0.1213mg/ml、0.1124mg/ml的混合对照品溶液。
(3)高效液相色谱条件为：色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相中乙腈为A成分，0.1％磷酸-水为B成分，梯度洗脱条件为：0～26.0min，65.0％A；26.0～34.0min，75.0％A；34.0～45.0min，75.0％A→78.0％A；45.0～53.0min，100.0％A；53.0～59.0min，65.0％A。检测波长：212nm；流速：1.0mL/min；柱温：29℃；进样量20μl。
实验例1
系统适用性实验：
在实施例1的色谱条件下，取实施例1中的混合对照品溶液、供试品溶液，分别进样20μL，去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10000，色谱峰对称因子在0.95-1.05之间，如图1、2所示。
实验例2
线性关系考察：
精密吸取实施例1中的混合对照品溶液4，6，13，20，31，40μl，按实施例1的色谱条件进行测定，记录峰面积，以进样量为X(μg)，峰面积积分为Y，得各成分回归方程，如表2所示。由表2可知，各成分在各自浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表2 8种对照品成分的线性方程与线性范围
Figure BDA0003298074460000101
实验例3
精密度试验：
取实施例1中的混合对照品溶液，按照实施例1的色谱条件及检测条件连续进样6次，测定峰面积，结果显示，去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、熊果酸的峰面积的RSD(n＝6)分别为0.60％、0.54％、0.48％、0.41％、0.89％、1.44％、0.33％、0.33％，表明仪器精密度良好。
实验例4
重复性试验：
制备6份实施例1中样品编号为S1的供试品溶液，按照实施例1的色谱条件及检测条件测定。结果显示，去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量RSD(n＝6)分别为1.67％、0.30％、2.67％、0.81％、2.08％、0.49％、0.46％，表明本发明方法重复性良好。
实验例5
稳定性试验：
取实施例1中的供试品溶液，按照实施例1的色谱条件及检测条件，分别于0，3，6，9，12，15，20，24h进行测定，结果显示，去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的峰面积的RSD(n＝6)分别为1.29％、0.99％、0.77％、1.13％、0.29％、0.66％、0.44％。表明本发明供试液在24h内稳定。
实验例6
加样回收率试验：
称取实施例1中样品编号为S1的茯苓粉1g，精密称定，平行6份，精密加入一定量混合对照品。按照实施例1中的供试品制备方法、色谱条件及检测条件，将样品进样测定，以(测得量-基础量)/加入量×100％计算回收率。茯苓中的去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸平均加样回收率(n＝6)分别为99.09％(RSD＝2.15％)、96.00％(RSD＝0.46％)、100.41％(RSD＝2.11％)、99.06％(RSD＝0.72％)、100.88％(RSD＝0.58％)、98.72％(RSD＝2.52％)、96.02％(RSD＝0.92％)。结果表明本发明方法准确度良好。
实验例7
相对校正因子计算：
精密吸取实施例1中的混合对照品溶液4，6，13，20，31，40μl，按实施例1的色谱条件进行测定，以熊果酸为参照物，取其余7个成分，记录峰面积，计算各个成分所得的相对校正因子RCF值，取平均值作为定量用fkm，采用QAMS法计算待测组分去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的相对校正因子，分别为1.0435、0.7757、1.0669、1.0801、0.4949、1.3181、0.7291。可见，各相对校正因子的RSD均小于2.0％。
实验例8
不同色谱柱对相对校正因子影响：
本发明考察了Thermo Acclaim 120 C18(4.6mm×250mm，5μm)(赛默飞世尔科技公司)、Agela innoval C18(4.6mm×250mm，5μm)(博纳艾杰尔公司)、Thermo umlsil C18(4.6mm×250mm，5μm)(赛默飞世尔科技公司)、、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)(安捷伦有限公司)4种色谱柱对相对校正因子(f)的影响，结果表明不同色谱柱所测得的各成分的相对校正因子无显著性差异，RSD＜5％。
实验例9
不同实验室对相对校正因子影响：
试验考察了三个实验室不同的高效液相色谱仪器(戴安U3000高效液相色谱仪(戴安中国有限公司)、Chromeleon色谱工作站、Agilent1260效液相色谱仪(DAD检测器、UV检测器))对相对校正因子的影响，结果表明三个实验室不同的高效液相色谱仪器所测得的去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的相对校正因子平均值分别为1.0435、0.7757、1.0669、1.0801、0.4949、1.3181、0.7291，RSD＜5％。
实验例10
七种成分色谱峰定位专属性考察：
通过相对保留时间对待测7种三萜化合物进行指认，以熊果酸为参照物，预实验中分别考察了去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的相对保留时间在不同色谱柱的重现性。结果表明，不同色谱柱的色谱峰相对保留时间变异大。
在不同实验室试验中，通过统一色谱柱，相对保留时间的RSD在5％以内。
实验例11
一测多评法与外标法结果的比较：
选取采自不同产地的茯苓20批药材，按实施例1中的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取20μL注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件测定。分别采用外标法和QAMS计算茯苓药材中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量。结果显示，QAMS与外标法所计算的各指标成分含量的相对标准差均小于5％，表明2种测定方法得到的量之间无显著性差异，由此说明QAMS用于茯苓药材中多种三萜酸类成分含量测定是可行的，结果如表3所示。
表3 一测多评法与外标法结果比较(mg·g-1)(以干燥品计)
Figure BDA0003298074460000121
Figure BDA0003298074460000131
Figure BDA0003298074460000141
茯苓三萜类成分具有显著的药理活性，本发明所选的7种三萜成分，含量均大于万分之一，具有测定的意义。与此同时，根据中药标准物质替代测定法技术指导原则，本发明选用熊果酸为参照物，因其对照品容易获得，性质稳定，研究中发现熊果酸对照品溶液可长期放置，峰面积并无明显变化，而茯苓的7种三萜成分较难得到，且无法定对照品，因此选择以熊果酸为参照物，建立了茯苓有效成分的一测多评方法。
本发明在前期研究基础上选择的是甲醇超声提取30min，此条件下7种三萜成分含量最高。在波长的选择上，依据7种活性成分的吸收波长，我们考察了210nm、212nm、208nm，结果表明210nm下，7种三萜fkm值稳定。在流动相的选择上，我们考察了乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水，结果发现，乙腈-0.1％磷酸水下的峰型、分离度等最好，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10000。
本发明为了验证所建立的7种茯苓三萜成分的一测多评法的适用性及可行性，进行了方法学考察、方法耐用性以及系统适应性试验。通过考察了不同色谱系统、不同色谱柱对相对校正因子及相对保留时间的影响，并以RSD％值作为指标，结果表明，在上述条件下，茯苓酸与去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、松苓新酸之间的相对校正因子具有良好的重现性，相对保留时间均在5％以内。同时，采用外标法测定了20批茯苓药材中7种有效成分的含量，比较了其与QAMS法测定值之间的差异，结果显示，二者之间无显著差异。
综上所述，表明本方法可以熊果酸为对照品，实现茯苓有效成分的多指标测定，能更全面而真实地评价茯苓药材的内在质量，为茯苓药材及制剂的多指标质量控制提供参考。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将茯苓粉与甲醇混合醇提后，过滤，收集滤液为供试品溶液；
（2）将熊果酸与去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸混合，加入甲醇溶解、稀释，即得混合对照品溶液；
（3）对混合对照品溶液进行高效液相色谱测定，记录混合对照品溶液中熊果酸、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的色谱峰面积；
以混合对照品溶液中的熊果酸为参照物，按照公式fkm=fk/fm=(Wm×Ak)/(Wk×Am)分别计算熊果酸与混合对照品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸和茯苓酸的相对校正因子，其中，Ak为参照物峰面积，Wk为参照物质量，单位为mg，Am为目标物m的峰面积，Wm为目标物m的质量，单位为mg；
（4）对供试品溶液进行高效液相色谱测定，记录供试品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的色谱峰面积，再通过步骤（3）所述混合对照品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸与熊果酸的相对校正因子，按照公式Wm=fkm×Wk×Am/Ak分别计算供试品溶液中去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的含量；
步骤（3）和步骤（4）中所述高效液相色谱测定的条件均为：
色谱柱：Thermo Acclaim 120 C18；
流动相中乙腈为A成分，0.1%磷酸-水为B成分；
梯度洗脱条件为：0~26.0min，65.0％A；26.0~34.0min，75.0％A；34.0~45.0min，75.0％A→78.0％A；45.0~53.0min，100.0％A；53.0~59.0min，65.0％A；
检测波长为208~212nm；
流速为0.8~1.2mL/min；
柱温为27~29℃。
2.根据权利要求1所述的一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法，其特征在于，步骤（1）中所述茯苓粉的粒径为0.17~0.18mm；
所述茯苓粉与甲醇的用量比为1g:4~6mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法，其特征在于，步骤（1）中所述醇提过程中进行超声处理，所述超声处理的温度为24~26℃，所述超声处理的功率为240~260W，所述超声处理的时间为28~32min；
所述过滤是采用滤膜进行，所述滤膜的孔径为0.2~0.5μm。
4.根据权利要求3所述的一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法，其特征在于，步骤（2）所述混合对照品溶液中，所述熊果酸、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、3-O-乙酰基-16α-羟基-氢化松苓酸、去氢茯苓酸、茯苓酸的浓度分别为0.1~0.2mg/ml、0.07~0.08mg/ml、0.08~0.09mg/ml、0.08~0.09mg/ml、0.07~0.08mg/ml、0.07~0.08mg/ml、0.08~0.09mg/ml、0.1~0.2mg/ml。
5.权利要求1所述的一种一测多评法测定茯苓中多种三萜类成分含量的方法在茯苓质量控制中的应用。
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