CN114563511B - 一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法 - Google Patents
一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法,采用高效液相色谱对柴胡桂枝干姜汤建立指纹图谱,根据所述指纹图谱的特征峰选择黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分,通过所得指纹图谱与指标性成分对柴胡桂枝干姜汤进行检测。本发明能够更为综合的评价柴胡桂枝干姜汤的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
柴胡桂枝干姜汤由柴胡、桂枝、干姜、瓜蒌根、黄芩、牡蛎、炙甘草等七味药物组成,该方原载于《伤寒论》147条:“伤寒五六日,已发汗而复下之,胸胁满微结,小便不利,渴而不呕,但头汗出,往来寒热,心烦者,此为未解也,柴胡桂枝干姜汤主之。”研究表明,柴胡桂枝干姜汤在治疗慢性乙型肝炎方面效果显著,降低ALT、AST、TBIL等方面具有明显优势。同时,柴胡桂枝干姜常用于治疗消化系统疾病,如消化功能紊乱、溃疡性结肠炎、慢性肝炎等疗效确切。但现有文献未见有柴胡桂枝干姜汤的检测方法,影响了该方的进一步开发和应用,亟需采用现代分析方法建立检测标准体系。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的目的是提供一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法,能够更为综合的评价柴胡桂枝干姜汤的质量。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法,采用高效液相色谱对柴胡桂枝干姜汤建立指纹图谱,根据所述指纹图谱的特征峰选择黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分,通过所得指纹图谱与指标性成分对柴胡桂枝干姜汤进行检测。
本发明利用高效液相色谱建立了柴胡桂枝干姜汤指纹图谱,并根据指纹图谱选定黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分,实验表明黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分含量差别较大,更适于作为柴胡桂枝干姜汤检测的指标性成分。
本发明的有益效果为:
本发明建立了HPLC指纹图谱同时测定黄芩和甘草中3个成分的含量,丰富了柴胡桂枝干姜汤的检测方法,为全面评价柴胡桂枝干姜汤质量提供依据。本发明采用HPLC同时测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷,以及甘草中甘草酸,具有操作简单、结果准确等优点,为柴胡桂枝干姜汤质量综合评价提供了科学依据。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤在不同检测波长下的高效液相色谱图;
图2为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤在不同品牌色谱柱检测的高效液相色谱图;
图3为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤在不同流动相下的高效液相色谱图;
图4为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤在254nm波长下高效液相色谱图;
图5为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤在276nm波长下高效液相色谱图;
图6为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤采用蒸发光散射检测器检测的高效液相色谱图;
图7为本发明实施例1中混合标样高效液相色谱图;
图8为本发明实施例1中柴胡桂枝干姜汤与各单味药高效液相色谱图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,采用现代分析方法建立柴胡桂枝干姜汤的检测标准体系,本发明提出了一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法。
本发明的一种典型实施方式,提供了一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法,采用高效液相色谱对柴胡桂枝干姜汤建立指纹图谱,根据所述指纹图谱的特征峰选择黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分,通过所得指纹图谱与指标性成分对柴胡桂枝干姜汤进行检测。
建立指纹图谱的流动相可以为乙腈-水、乙腈-0.09~0.11%乙酸水、乙腈-0.09~0.11%磷酸水、乙腈-0.19~0.21%磷酸水、乙腈-0.09~0.11%甲酸水、乙腈-0.19~0.21%甲酸水,该实施方式的一些实施例中,建立指纹图谱的流动相为乙腈-0.19~0.21%甲酸水。研究表明采用该流动相时,各特征峰的分离效果更好,更有利于建立指纹图谱。
色谱柱可以选择waters C18柱、agilent C18柱、kromasil 100 C18等,然而研究表明,不同色谱柱对于柴胡桂枝干姜汤指纹图谱的特征峰的分离效果不同,为了获得更好的分离效果,该实施方式的一些实施例中,建立指纹图谱的色谱柱为waters C18柱。
该实施方式的一些实施例中,建立指纹图谱时的检测波长为275~277nm。
该实施方式的一些实施例中,建立的柴胡桂枝干姜汤指纹图谱为蒸发光散射图谱。蒸发光散射图谱由蒸发光散射检测器检测获得。
该实施方式的一些实施例中,将柴胡桂枝干姜汤制成供试品溶液,采用高效液相色谱对供试品溶液建立指纹图谱。
在一种或多种实施例中,柴胡桂枝干姜汤制成供试品溶液的过程为:向柴胡桂枝干姜汤的组方中添加水,煮制体积缩小至40~60%,去除药渣后,继续煮制,直至溶液体积为添加水量体积的24~26%。
该实施方式的一些实施例中,进行检测前,利用指标性成分进行仪器适应性试验。防止检测仪器精密度较差,带来检测偏差。具体过程为:取同一供试品溶液连续多次进样检测,检测指标性成分棉结的相对标准偏差。
该实施方式的一些实施例中,进行检测前,利用指标性成分进行稳定性试验。具体过程为:取同一供试品溶液,分别在不同的时间多次进样检测,检测指标性成分棉结的相对标准偏差。
该实施方式的一些实施例中,进行检测前,利用指标性成分进行重复性试验。具体过程为:将黄芩、甘草制成测试溶液,进行多次检测,检测指标性成分棉结的相对标准偏差。
该实施方式的一些实施例中,进行检测前,利用指标性成分进行加样回收率试验。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中的原料均为市售获得。
柴胡桂枝干姜汤供试品溶液的制备。
称取柴胡24g、桂枝9g、干姜6g、瓜蒌根(天花粉)12g、黄芩9g、牡蛎6g、炙甘草6g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得柴胡桂枝干姜汤供试品溶液。
柴胡供试品溶液的制备。
称取柴胡24g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得柴胡供试品溶液。
桂枝供试品溶液的制备。
称取桂枝9g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得桂枝供试品溶液。
干姜供试品溶液的制备。
称取干姜6g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得干姜供试品溶液。
天花粉供试品溶液的制备。
称取天花粉12g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得天花粉供试品溶液。
黄芩供试品溶液的制备。
称取黄芩9g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得黄芩供试品溶液。
牡蛎供试品溶液的制备。
称取牡蛎6g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得牡蛎供试品溶液。
炙甘草供试品溶液的制备。
称取炙甘草6g,加入2400mL水,小火煮取1200mL,去除药渣,煮至600mL,获得炙甘草供试品溶液。
首先,利用不同检测波长(210nm、240nm、254nm、276nm、280nm)获得柴胡桂枝干姜汤供试品溶液的不同高效液相色谱谱图,结果如图1所示,图1表明检测波长为当波长为254nm和276nm时,高效液相色谱的谱图中的出峰数量更多,且峰形较好。
其次,分别选择waters C18柱、agilent C18柱、kromasil 100 C18柱(规格均为250×4.6mm,5μm)对柴胡桂枝干姜汤供试品溶液进行高效液相色谱检测,检测结果如图2所示,可以看出waters C18柱对各成分具有更好的分离效果,因而出峰数量更多。
再次,分别采用乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水作为流动相对柴胡桂枝干姜汤供试品溶液进行高效液相色谱检测,检测结果如图3所示,结果表明乙腈-0.2%甲酸水作为流动相时,对柴胡桂枝干姜汤供试品溶液中各成分的分离效果更好。
优化后的高效色谱条件为:waters C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流速为1.0mL/min;DAD是检测波长为254nm和276nm串联ELSD检测器;进样量为20μL。流动相及梯度洗脱程序如表1所示。
表1柴胡桂枝干姜汤梯度洗脱程序
色谱图如图4~6所示,可以看出276nm波长下,峰的数量较多且峰形较好,因此DAD检测选择276nm。
图7为黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸的混合标样图。采用确定的色谱条件分别对柴胡桂枝干姜汤供试品溶液、柴胡供试品溶液、桂枝供试品溶液、干姜供试品溶液、天花粉供试品溶液、黄芩供试品溶液、牡蛎供试品溶液、炙甘草供试品溶液进行检测,结果如图8所示,通过各峰的保留时间的对比,对各峰的来源进行归属,结果如表2所示。
表2柴胡桂枝干姜汤HPLC指纹图谱特征峰的来源分析
柴胡桂枝干姜汤中指标性成分的含量测定
混合对照品溶液的制备:
如图8所示,黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸为含量较高组分,且黄芩和甘草为柴胡桂枝干姜汤中的主要药味。因而选择黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分精密称取对照品黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸适量,加甲醇分别制成每1mL含黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素各0.4630、0.5210、0.3130mg的对照品储备液。分别精密量取黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸对照品储备液适量,加甲醇制成每1mL含黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸分别为208.0、39.10、26.60μg的混合对照品溶液。
精密吸取上述混合对照品溶液2、4、8、12、16、20μL按表1中色谱条件进样测定。以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X,μg)为横坐标,绘制标准曲线,得黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸的回归方程见表3。
表3黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸的标准曲线方程、相关系数和线性范围
仪器适应性试验:
精密吸取同一供试品溶液10μL,连续进样5次,测得黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.8%、0.7%、0.8%。结果表明,仪器精密度良好。
稳定性试验:
取同一供试品溶液,分别在0、2、4、8、12h进样10μL,测得黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸峰面积的RSD分别为1.2%、1.3%、1.1%。结果表明供试品溶液中上述3个成分在12h内稳定性良好。
重复性试验:
取黄芩、甘草粉末样品5份,每份约0.2g,精密称定,按表1方法平行制备成供试品溶液,分别进样10μL进行测定。结果黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸含量平均值(n=5)分别为126.12,23.52,12.64mg/g,RSD分别为0.8%、1.3%。
加样回收率试验
取已知含量(黄芩苷127.48mg/g、汉黄芩苷23.49mg/g、甘草酸12.66mg/g)的黄芩、甘草粉末样品9份,每份约0.1g,精密称定,按照低、中、高浓度精密加入一定量对照品溶液,制成加标样品各3份,按表1方法操作,制备供试品溶液,分别进样10μL进行测定,计算回收率。结果黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸平均回收率(n=5)分别为100.2%、100.5%、100.1%,RSD分别为2.2%、2.1%、1.9%。
样品的含量测定
称取柴胡8g、桂枝3g、干姜2g、瓜蒌根(天花粉)4g、黄芩3g、牡蛎2g、炙甘草2g,加入800mL水,小火煮取400mL,去除药渣,煮至200mL,获得柴胡桂枝干姜汤供试品溶液。精密称定,制备10批次的柴胡桂枝干姜汤供试品溶液,按表1色谱条件分别进样10μL进行测定,外标法计算样品中3种指标性成分的含量,结果见表4。
表4方剂10批次样品的含量测定结果(mg/g,n=3)
表4中,3个指标性成分之间含量差别较大,黄芩苷的含量为15.30~15.76mg/g,汉黄芩苷的含量为2.78~2.98mg/g,甘草酸的含量为1.13~1.19mg/g;即黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸检测结果准确。表明黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸可以作为柴胡桂枝干姜汤的检测的指标性成分。
本实施例建立了HPLC同时测定黄芩和甘草中3个成分的含量,丰富了柴胡桂枝干姜汤的检测方法,为全面评价柴胡桂枝干姜汤质量提供依据。本实施例采用HPLC同时测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷,以及甘草中甘草酸,具有操作简单、结果准确等优点,为柴胡桂枝干姜汤质量综合评价提供了科学依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种柴胡桂枝干姜汤的检测方法,其特征是,所述柴胡桂枝干姜汤由柴胡、桂枝、干姜、瓜蒌根、黄芩、牡蛎和炙甘草组成;
柴胡桂枝干姜汤制成供试品溶液的过程为:向柴胡桂枝干姜汤的组方中添加水,煮制体积缩小至40~60%,去除药渣后,继续煮制,直至溶液体积为添加水量体积的24~26%;
采用高效液相色谱对柴胡桂枝干姜汤建立指纹图谱,共测得36个指纹图谱特征峰;根据所述指纹图谱的特征峰选择黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸作为指标性成分,通过所得指纹图谱与指标性成分对柴胡桂枝干姜汤进行检测;
样品含量测定,黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸指标性成分之间含量差别大;
黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸检测结果准确;
高效液相色谱条件为:waters C18色谱柱,规格为250 mm×4.6 mm,5 μm;
流速为1.0 mL/min;进样量为20 μL;
流动相为乙腈-0.2%甲酸水;
梯度洗脱程序如下:
检测器为DAD检测器串联ELSD检测器;
DAD检测波长为276 nm。
2.如权利要求1所述的柴胡桂枝干姜汤的检测方法,其特征是,进行检测前,利用指标性成分进行仪器适应性试验。
3.如权利要求1所述的柴胡桂枝干姜汤的检测方法,其特征是,进行检测前,利用指标性成分进行稳定性试验。
4.如权利要求1所述的柴胡桂枝干姜汤的检测方法,其特征是,进行检测前,利用指标性成分进行重复性试验。
5.如权利要求1所述的柴胡桂枝干姜汤的检测方法,其特征是,进行检测前,利用指标性成分进行加样回收率试验。
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