CN110632198B

CN110632198B - 一种消炎止咳片的hplc指纹图谱及其构建方法和应用

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Publication number: CN110632198B
Application number: CN201910919206.7A
Authority: CN
Inventors: 何贵全; 唐琳; 潘均华; 劳悦富; 彭丽华; 赵雪婷; 史军杰; 成金乐; 徐吉银; 王义娜
Original assignee: Zhongshan Hengsheng Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhongshan Hengsheng Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: CN110632198A

Abstract

本发明涉及中药制剂质量控制技术领域，具体公开了一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用。本发明对消炎止咳片指纹图谱构建的供试品溶液制备、对照品溶液制备、HPLC分析色谱条件的确定、指纹图谱的测定等进行了研究优化，并通过对多批次消炎止咳片样品HPLC指纹图谱的对比，确定其共有峰，得到标准HPLC指纹图谱。本发明所构建的消炎止咳片指纹图谱具有操作简便、重现性好、特征峰多、准确可靠的优点。本发明所构建的HPLC指纹图谱可以更全面的反映样品的特征峰信息，利用该HPLC指纹图谱可以对消炎止咳片进行质量控制。

Description

一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及中药制剂质量控制技术领域，具体地，涉及一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用。

背景技术

消炎止咳片收录于《中国药典》2015版第一部，其配方由胡颓子叶167g、桔梗125g、太子参167g、百部83g、罂粟壳10g、麻黄21g、黄荆子104g、南沙参31g、穿心莲104g组成，其制法是将以上九味，太子参、桔梗、百部加水煎煮三次，第一次4小时，第二次3小时，第三次2小时；合并煎液，滤过；胡颓子叶加水煎煮4小时，滤过，与上述滤液合并，浓缩成清膏；其余麻黄等五味粉碎成细粉，过筛，混匀，与上述清膏混合，搅匀，加辅料适量，制成颗粒，干燥，压制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。

目前消炎止咳片的质量控制方法有薄层鉴别、含量检测等，但由于中药材的质量良莠不齐，加之复方成分更加复杂，单单依靠薄层鉴别和含量检测很难全面反映消炎止咳片的质量。

因此亟待找到一种操作简便、准确可靠且用于全面监控消炎止咳片产品质量的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有消炎止咳片质量检测方法的缺陷和不足，提供一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用。

本发明的目的是提供一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱的构建方法，该构建方法具有操作简便、重现性好、特征峰多、准确可靠的优点。

本发明的另一目的在于提供一种消炎止咳片HPLC指纹图谱。

本发明的另一目的在于提供一种消炎止咳片标准HPLC指纹图谱。

本发明的另一目的在于提供上述消炎止咳片HPLC指纹图谱或标准HPLC指纹图谱在检测消炎止咳片质量中的应用。

本发明的再一目的是提供一种消炎止咳片的质量控制方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

S1.供试品溶液制备：取消炎止咳片，去除包衣，研细，按质量体积比为1g:(5～30)mL加入30～100％甲醇，超声提取30～60min，冷却至室温，用30～100％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

S2.制备对照品溶液；

S3.运用HPLC技术对供试品溶液和对照品溶液进行分析，构建得到消炎止咳片的HPLC指纹图谱；

其中，步骤S3中HPLC分析的色谱条件如下：

色谱柱柱温25～40℃；

以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；

流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～25min，10％～30％；25min～40min，30％～60％；

流动相0.1％磷酸水溶液在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～25min，90％～70％；25min～40min，70％～40％；

供试品溶液洗脱流速为0.6～1.2mL/min；

检测波长为200nm。

在指纹图谱的建立方法中，为了使操作更为简便，耗时更短，并使指纹图谱中的各特征峰具有较好的分离度、峰形，同时需要合理的控制指纹图谱的检测时间，对于供试品的制备方法和梯度洗脱条件的选择至关重要，本领域技术人员在选择供试品的制备方法和梯度洗脱条件的时候都需要付出大量的实验，不断对供试品的制备方法和梯度洗脱条件进行优化，因为对于不同的中药材及制剂，其中的化学成分千差万别，不同的药材及制剂的提取条件及指纹图谱的洗脱条件并无参考价值，供试品制备条件的选择，不仅影响着指纹图谱的峰的多少，同时一般也是整个指纹图谱操作过程中耗时较长的一个步骤，且流动相比例的微小变化将会对指纹图谱造成很大的影响，如将会影响特征峰的分离度和峰形。

本发明通过大量的实验，对供试品制备方法和梯度洗脱条件进行摸索，最终确定了上述供试品制备方法和梯度洗脱条件。如本发明考察了供试品不同的提取条件，同时还考察了不同的流动相对指纹图谱的影响，结果表明，采用上述供试品制备方法和流动相，指纹图谱中所得峰的信息较多；基线较平稳，分离度、峰形和柱效最佳。还考察了不同的检测波长、柱温对指纹图谱的影响，结果在上述波长和柱温下得到的指纹图谱，其成分相对较多、各峰高比例适中、基线比较平稳。

综上，本发明所述构建方法可快速、准确地鉴别消炎止咳片的质量优劣，具有操作简便、耗时短、稳定、精密度高、重现性好等优点。利用该构建方法检测到的消炎止咳片HPLC指纹图谱化学成分峰相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。

优选地，步骤S1中所述消炎止咳片与甲醇的质量体积比为1g：10mL。

优选地，步骤S1中所述甲醇的体积分数为50％。

优选地，步骤S1中所述超声处理的条件为350W，40kHz，处理的时间为30min。

优选地，步骤S2中所述对照品为穿心莲内酯。

优选地，步骤S2中所述对照品溶液通过以下步骤制备得到：取穿心莲内酯对照品，加甲醇配制成浓度为60μg/mL的对照品溶液。

优选地，步骤S3中所述色谱柱为Shiseido CAP CELL MGⅡC18色谱柱。

优选地，步骤S3中所述色谱柱温为30℃。

优选地，步骤S3中所述供试品溶液洗脱流速为1mL/min。

优选地，步骤S3中所述供试品溶液进样体积为20μL。

本发明还请求保护一种消炎止咳片HPLC指纹图谱，是通过上述构建方法构建得到。

本发明还请求保护一种消炎止咳片标准HPLC指纹图谱，是通过上述构建方法，构建得到多批次消炎止咳片样品的HPLC指纹图谱，将得到的HPLC指纹图谱导入指纹图谱分析软件，生成指纹图谱共有模式即得；所得标准HPLC指纹图谱有12个共有峰，以8号峰的保留时间为参照，其余11个共有峰的相对保留时间分别为0.239、0.345、0.383、0.536、0.767、0.798、0.820、1.022、1.185、1.282、1.293。

由上述构建方法测得的消炎止咳片HPLC指纹图谱，可以更全面的反映样品的特征峰信息，利用该HPLC指纹图谱可以对消炎止咳片进行质量控制。因此，上述消炎止咳片HPLC指纹图谱或标准HPLC指纹图谱在检测消炎止咳片质量中的应用亦在本发明的保护范围之内。

其中具体地，作为一种可选择方案，上述消炎止咳片标准HPLC指纹图谱的构建方法中，所述多批次消炎止咳片样品为中山市恒生药业有限公司的14批消炎止咳片样品，批号分别为S1:20170116、S2:20170117、S3:20170118、S4:20170913、S5:20170915、S6:20180504、S7:20180505、S8:20180506、S9:20190102、S10:20190103、S11:20190104、S12:20190508、S13:20190509、S14:20190510。

本发明还请求保护一种消炎止咳片的质量控制方法，包括如下步骤：取消炎止咳片待检样品，按照上述构建方法构建待检样品的HPLC指纹图谱；然后与上述消炎止咳片标准HPLC指纹图谱进行比较；若待检样品的HPLC指纹图谱中，呈现12个对应特征峰，且按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，待检样品的HPLC指纹图谱与标准HPLC指纹图谱的相似度不低于0.85，且样品图谱中各峰的相对保留时间与标准图谱各峰的相对保留时间的RSD值≤5％，则判断为合格品。本发明具有以下有益效果：

1、本发明所提供的构建方法具有操作简便、供试品溶液制备耗时短、重现性好、特征峰多、准确可靠的优点，可以全面监控消炎止咳片产品的质量，为药品生产及检测提供了质量控制的高标准，以确保产品质量的稳定性，保证药品使用的安全有效。

2、利用本发明的构建方法得到的消炎止咳片HPLC指纹图谱化学成分峰相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好，可以更全面的反映样品的特征峰信息，可应用于消炎止咳片产品的质量控制。

附图说明

图1为14批消炎止咳片的HPLC指纹图谱。

图2为穿心莲内脂对照品的HPLC指纹图谱，其中1号峰为穿心莲内脂。

图3为消炎止咳片的标准HPLC指纹图谱。

图4为消炎止咳片供试品紫外吸收3D图。

图5为消炎止咳片指纹图谱分析流动相系统考察图，其中S1为乙腈-0.1％磷酸水，S2为乙腈-水，S3为甲醇-0.1磷酸水，S4为甲醇-水。

图6为消炎止咳片指纹图谱分析流动相梯度优化色谱图。

图7为消炎止咳片指纹图谱分析不同柱温考察色谱图，其中S1为25℃，S2为30℃，S3为35℃，S4为40℃。

图8为消炎止咳片指纹图谱分析流速考察色谱图，其中S1为0.6mL/min，S2为0.8mL/min，S3为1.0mL/min，S4为1.2mL/min。

图9为消炎止咳片指纹图谱分析进样体积考察色谱图，其中S1为10μL，S2为15μL，S3为20μL。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到。

本发明数据处理采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行色谱相似度评价。

1、仪器

电热恒温水浴锅HWS 24(上海一恒科技有限公司)、电子天平ME204(万分之一，METTLER TOLEOD)、电子天平MS105(十万分之一，METTLER TOLEOD)、高效液相色谱仪(安捷伦1200RRLC，安捷伦科技(中国)有限公司)、高效液相色谱仪(Waters 2695/2988，沃特世科技(上海)有限公司)、高效液相色谱仪(Thermo U3000，赛默飞世尔科技公司)、数控超声波清洗器(KQ-700DE型，昆山市超声仪器有限公司)、超纯水机(明澈D24UV型，美国Milipore公司)Shiseido PAK C18(5μm，250mm×4.6mm)。

2、试剂

乙腈(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、甲醇(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、磷酸(广州化学试剂厂)、重蒸水(自制)。

3、样品

消炎止咳片(批号S1:20170116、S2:20170117、S3:20170118、S4:20170913、S5:20170915、S6:20180504、S7:20180505、S8:20180506、S9:20190102、S10:20190103、S11:20190104、S12:20190508、S13:20190509、S14:20190510)共14批样品，均由中山市恒生药业有限公司提供。

4、对照品

穿心莲内酯(110797-201609，中国食品药品检定研究院)。

实施例1消炎止咳片的HPLC指纹图谱的构建方法

一种消炎止咳片的PLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

S1.供试品溶液制备：取消炎止咳片，去除包衣，研细，精密称定，按质量体积比为1g:10mL加入50％甲醇，超声提取30min，取出冷却至室温，用50％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液；S2.对照品溶液制备：以穿心莲内酯为对照品，加甲醇配制成60μg/mL穿心莲内酯对照品溶液；

其中，HPLC分析的色谱条件为：

Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mmL)色谱柱；

色谱柱柱温30℃；

以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；

乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～25min，10％～30％；25min～40min，30％～60％；

0.1％磷酸水溶液在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～25min，90％～70％；25min～40min，70％～40％；

供试品溶液洗脱流速为1mL/min；供试品溶液进样体积为20μL；

对照品溶液进样体积为10μL；

检测波长为200nm。

所得消炎止咳片的HPLC指纹图谱结果见图1。

实施例2消炎止咳片的HPLC指纹图谱共有模式的构建

1、参照峰的指认

按照实施例1的构建方法，测定对照品溶液穿心莲内酯的HPLC指纹图谱，记录色谱图，并将其与消炎止咳片HPLC指纹图谱进行比较，分析相对应峰的保留时间与紫外吸收情况，如图2所示。

指认出：1号峰为穿心莲内脂。其中8号峰高度适中，分离度好，保留时间适中，可作为参照峰。

2、指纹图谱的建立及共有峰的确认

取14个批次消炎止咳片(批号为S1:20170116、S2:20170117、S3:20170118、S4:20170913、S5:20170915、S6:20180504、S7:20180505、S8:20180506、S9:20190102、S10:20190103、S11:20190104、S12:20190508、S13:20190509、S14:20190510)，按照实施例1的构建方法制备供试品溶液，并测定14批供试品溶液，记录色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得14张图谱进行相似度分析，确定了12个色谱峰为消炎止咳片共有指纹峰，见图3，14批样品的相似度达0.866，结果见表1。

其中，8号峰高度适中，分离度好，保留时间适中，可作为参照峰。其余11个共有色谱峰与参照峰的平均相对保留时间分别为：0.239、0.345、0.383、0.536、0.767、0.798、0.820、1.022、1.185、1.282、1.293，结果见表2。

表1 14批消炎止咳片指纹图谱的相似度

表2消炎止咳片指纹图谱共有峰的相对保留时间

实施例3方法学验证

1、专属性考察

取批号为20160405的消炎止咳片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液及空白供试品溶液，进样，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，结果显示溶剂在色谱条件下基本无吸收，对样品的色谱图影响较小，表明建立的方法专属性好。

2、仪器精密度

取批号为20160405的消炎止咳片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液，连续进样6次，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图。采用采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表3，相似度均达0.99以上，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3％，考察结果表明仪器精密度符合要求。

表3仪器精密度考察色谱图的相似度

3、重复性试验

取批号为20160405的消炎止咳片，按实施例1提供的方法制备6份供试品溶液，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图。，采用采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表4，相似度均达0.99以上，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于5％，考察结果表明方法的重复性符合要求。

表4重复性考察色谱图的相似度

4、稳定性试验

取批号为20160405的消炎止咳片，按实施例1提供的方法制备供试品溶液，在0、2、4、8、12、24h分别进样，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表5，相似度均达0.99以上，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于5％考察结果表明方法的稳定性(耐用性)符合要求。

表5稳定性考察图谱的相似度

实施例4供试品溶液制备方法的优化

在色谱条件固定的条件下，优化供试品溶液的制备方法。固定的色谱条件如下：

色谱柱：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mmL)；

流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；

梯度洗脱0min～25min～40min，乙腈的变化10％～30％～60％，0.1％磷酸水溶液的变化90％～70％～40％；

流速：1mL/min；

色谱柱柱温：30℃；

供试品进样量：20μL；对照品进样量：5μL；

检测波长：210nm。

1、提取溶剂考察

考察乙醇、甲醇两种溶剂对消炎止咳片提取率的影响，具体步骤如下：

样品处理：取消炎止咳片10片，去除包衣，研细，分别取1g，共2份，精密称定，置于具塞锥形瓶中分别加入70％甲醇和70％乙醇10mL，密塞，称定重量，超声提取(350W，40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品。

采用上述固定的色谱条件，分析上述2份样品，比较不同溶剂提取的差异。以样品谱图出峰数目多，峰分布均匀且穿心莲内酯含量高为选择标准，筛选出最佳的提取溶剂。

结果显示70％甲醇提取的色谱图与70％乙醇提取的色谱图无异，主峰种类几倍一致，相似度达到0.9，但70％甲醇提取的穿心莲内酯含量为0.28mg，高于70％乙醇提取的穿心莲内酯含量为0.23mg，因此选择提取溶剂为甲醇。

2、甲醇提取浓度的考察

分别考察30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇4种不同浓度甲醇溶液对消炎止咳片样品化学成分提取的影响，具体步骤如下：

样品处理：取消炎止咳片10片，去除包衣，研细，分别取1g，共4份，精密称定，置于具塞锥形瓶中分别加入30％甲醇、50％乙醇、70％甲醇、甲醇各10mL，密塞，称定重量，超声提取(350W，40kHz)30min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品。

采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较不同浓度甲醇提取差异，以样品谱图出峰数目多，峰分布均匀且穿心莲内酯含量高为选择标准，筛选出甲醇浓度。

结果显示50％～70％甲醇提取的色谱出峰数目多，且50％甲醇提取的穿心莲内酯含量为0.31mg，高于70％甲醇提取的穿心莲内酯含量为0.28mg，因此选择提取溶剂为50％的甲醇。

3、提取方式的考察

取消炎止咳片10片，去除包衣，研细，分别取1g，共2份，分别采用以下2种方法提取样品：

(1)超声提取：其中1份放置于具塞锥形瓶中，加入10mL50％甲醇，称定重量，超声提取(350W，40kHz)30min，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)水浴加热回流提取：另外1份样品放置于圆底烧瓶中，加入50％甲醇10mL，称量重量，80℃水浴加热回流1h，取出，冷却后补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

采用上述固定的色谱条件，分析上述2份样品，比较不同提取方法的提取效果。以样品谱图出峰数目多，峰分布均匀且穿心莲内酯含量高为选择标准，筛选提取方式。由结果可见，超声提取及回流提取差异不大，且二者的平均谱图相似度也达到0.9以上，从操作上来讲，超声提取相对简单易行，为最佳条件。

4、超声提取时间考察

分别考察超声提取30min、45min、60min对消炎止咳片提取效率的影响。

样品制备：取消炎止咳片10片，去除包衣，研细，分别取1g，共3份，提取样品分别加入10mL50％甲醇，称定重量，1号超声提取30min，2号超声提取45min，3超声提取60min，取出，冷却至室温，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

采用上述固定的色谱条件，分析上述3份样品，比较提取时间对消炎止咳片提取效率的差异。以样品谱图出峰数目多，峰分布均匀且穿心莲内酯含量高为选择标准，筛选出最佳的超声提取时间。由结果可见，超声时间对于提取的效果影响不明显，以上3组方案的平均谱图的相似度在0.9以上，三种提取时间的穿心莲内酯含量无显著性差异，但从节约资源和时间成本的角度出发，超声30min为供试品制备的提取最佳时间，足以将成分提取完全。

5、提取样品料液比的考察

分别考察(消炎止咳片:提取溶剂的体积)1g:5mL、1g:10mL、1g:20mL、1g:30mL四组不同液料比对提取效果的影响。

样品制备：取消炎止咳片10片，去除包衣，研细，分别取1g，共4份，提取样品分别加入相应料液比体积的50％甲醇，称定重量，超声提取30min，取出，冷却至室温，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较料液比对消炎止咳片提取效率的差异，以样品谱图出峰数目多，峰分布均匀且穿心莲内酯含量高为选择标准，筛选出最佳料液比。

由结果可见，四组料液比的平均谱图的相似度在0.9以上，但1g:5mL穿心莲内酯含量为0.26mg，低于1g:10mL提取的穿心莲内酯含量为0.31mg，1g:10mL、1g:20mL、1g:30mL提取效果的差异不明显，从节约物料及提取溶剂的角度出发，最终选择1g:10mL为最佳料液比。

6、供试品溶液最终制备方法

根据以上各项考察内容，最终确定消炎止咳片HPLC指纹图谱分析用供试品溶液的制备方法为：

取消炎止咳片10片，去除包衣，研细，取1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声提取(350W，40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

实施例5色谱条件优化

1、检测波长考察

对供试品溶液进行全波长扫描，从其3D图中选择最佳检测波长。考察指标为：该波长下分析信号响应值大，峰信息量多，峰分布均匀且基线平稳，各峰分离度较好。

根据药典和文献报道，消炎止咳片的HPLC分析常用的波长有210nm、251nm；通过调用3D谱图(见图4)分析发现，在200nm处，消炎止咳片中色谱峰信息量大，且响应值较高，最终选择200nm作为消炎止咳片指纹图谱分析的波长。

2、流动相系统的考察

依次考察下列流动相系统：(1)乙腈-水；(2)乙腈-0.1％磷酸水溶液；(3)甲醇-水；(4)甲醇-0.1％磷酸水溶液。

其它色谱条件：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mml)色谱柱；流动相洗脱梯度：0min～37min～40min，有机相变化10％-57％-80％；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：200nm；供试品进样量：20μL。比较不同洗脱系统对银黄颗粒的分离效果，以样品谱图的出峰数目多、峰分布均匀、基线平稳，为选择标准。

结果如图5所示：采用流动相乙腈-0.1％磷酸得到的供试品的峰信息较多，基线较平稳，分离度、峰形较好，故最终确定流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液。

3、流动相洗脱梯度优化

依次考察下表6所示洗脱梯度的分析效果。

其它色谱条件：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mml)色谱柱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：200nm；供试品进样量：20μL。以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B，按表6所示梯度洗脱，记录色谱图。分析不同洗脱梯度对消炎止咳片分离效果的差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀，且主成分峰基本分开为选择标准。

结果如图6所示：各梯度的出峰数目基本一致，但梯度4的峰分布均匀，且主成分峰基本能分开，故选梯度4。

表6流动相梯度表

4、色谱柱柱温的考察

本项考察柱温分别为25℃、30℃、35℃、40℃时的样品分析效果，以期通过柱温优化进一步提高峰分离度。

其它色谱条件：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mml)色谱柱；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液；按表6所示梯度4洗脱；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：200nm；供试品进样量：20μL。

结果如图7所示：柱温在25～40℃时，各主要色谱峰的分离度差异不大；结合实验实际环境，最终选择30℃作为最终的色谱柱温。

5、流速的考察

考察供试品溶液洗脱流速分别为0.6mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.2mL/min流速时的分析效果。

其他色谱条件：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mmL)色谱柱；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液；按表6所示梯度4洗脱；柱温：30℃；检测波长：200nm；供试品进样量：20μL。考察不同洗脱流速对消炎止咳片分离效果的影响，以样品谱图出峰时间适中，主成分峰分离度高、分布均匀作为选择标准。

结果如图8所示，与其他流速相比，当流动相的流速为1mL/min时，供试品的谱图出峰时间适中，峰分离度较高、分布均匀，选择为最佳流速。

6、供试品溶液进样体积的考察

其他色谱条件：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mmL)色谱柱；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液；按表6所示梯度4洗脱；柱温：30℃；检测波长：200nm；流速：1.0mL/min。考察供试品不同进样体积对消炎止咳片分离效果的影响，以样品色谱图中峰的响应度高并分离度好作为选择标准。

结果如图9所示，3组进样体积色谱图无明显差异，随进样体积的增加，各峰的响应值变高，故最终选择进样体积20μL。

7、最终色谱条件

色谱柱：Shiseido CAP CELL MGⅡ C18(5μm，250mm×4.6mmL)；流速：1.0mL/min；检测波长：200nm；柱温：30℃；供试品进样体积：20μL；流动相及梯度如表7所示：

表7梯度洗脱过程中各流动相的体积分数

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种消炎止咳片的HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 供试品溶液制备：取消炎止咳片，去除包衣，研细，按质量体积比为1g：10～30mL加入50～70%甲醇，超声提取30～60min，冷却至室温，用50～70%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

S2. 制备对照品溶液；

S3. 运用HPLC技术，对供试品溶液和对照品溶液进行分析，构建得到消炎止咳片的HPLC指纹图谱；

其中，步骤S3中HPLC分析的色谱条件如下：

色谱柱柱温25～40℃；

以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；

流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0→25min，10%→30%；25min→40min，30%→60%；

流动相0.1%磷酸水溶液在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0→25min，90%→70%；25min→40min，70%→40%；

供试品溶液洗脱流速为0.6～1.2mL/min；

检测波长为200nm。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中所述消炎止咳片与甲醇的质量体积比为1g：10mL；步骤S1中所述甲醇的体积分数为50%；步骤S1中所述超声处理的条件为350W，40kHz，处理的时间为30min。

3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S2中所述的对照品为穿心莲内酯。

4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S2中所述的对照品溶液通过以下步骤制备得到：取穿心莲内酯对照品，加甲醇配制成浓度为60μg/mL对照品溶液。

5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S3中所述色谱柱为Shiseido CAPCELL MGⅡ C18色谱柱；步骤S3中所述色谱柱温为30℃；步骤S3中所述供试品溶液洗脱流速为1mL/min；步骤S3中所述供试品溶液进样体积为20μL。

6.权利要求1至5任一项所述构建方法构建得到的消炎止咳片HPLC指纹图谱在检测消炎止咳片质量中的应用。

7.一种消炎止咳片的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：取消炎止咳片待检样品，按照权利要求1至5任一项所述构建方法构建待检样品的HPLC指纹图谱；然后与权利要求1至5任一项所述构建方法构建得到的样品标准HPLC指纹图谱进行比较；若待检样品的HPLC指纹图谱中，呈现12个对应特征峰，且按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，待检样品的HPLC指纹图谱与标准HPLC指纹图谱的相似度不低于0.85，且样品图谱中各峰的相对保留时间与标准图谱各峰的相对保留时间的RSD值≤5%，则判断为合格品。