CN112730681B - 儿童咳液特征图谱及其构建方法和儿童咳液的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体提供了一种儿童咳液特征图谱及其构建方法和儿童咳液的质量检测方法，所述儿童咳液特征图谱的构建方法中，通过对液相色谱条件、流动相组成及洗脱程序的控制，建立了儿童咳液特征图谱，获得8个共有特征峰。该特征图谱色谱峰完全呈现，均匀性佳，特征色谱峰分离度较好，全面的反映了儿童咳液中所含化学成分的种类与数量，实现了儿童咳液质量的整体描述和评价，保证了儿童咳液的有效性和安全性。该特征图谱检测方法具有操作简便、稳定可靠、精密度高、重现性好、易于掌握等优点。

Description

儿童咳液特征图谱及其构建方法和儿童咳液的质量检测方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种儿童咳液特征图谱及其构建方法和儿童咳液的质量检测方法。
背景技术
儿童咳液是一种中药制剂，属于非处方用药，具有清热润肺、宣降肺气、祛痰止咳的功效，常用于治疗咳嗽气喘、吐痰黄稠或咳痰不爽、咽干喉痛、急慢性气管炎。
随着人民群众健康保健意识的增强，人们对中成药产品的质量和安全性等有了更高的要求。儿童咳液现标准为中华人民共和国卫生部药品标准(中药成方制剂)，标准中仅包括简单的性状、薄层鉴别、常规检查等方面，无指纹图谱及特征图谱项，无法对儿童咳液进行全面的质量控制。目前有关儿童咳液的质量检测文献报道主要有《高效液相色谱法测定儿童咳液中盐酸麻黄碱含量》、《儿童咳液质量标准的研究》等。上述文献主要针对儿童咳液薄层鉴别及含量测定方法进行了研究建立，目前暂无指纹图谱或特征图谱方法建立相关研究报道，造成儿童咳液产品质量检测不全面等问题，儿童咳液质量标准有待进一步提高。因此，建立综合的、可量化的全面成分质量监控方法，对提高儿童咳液质量稳定性及一致性具有重要作用。
发明内容
因此，本发明的目的在于解决现有技术所存在的问题，通过提供一种儿童咳液的特征图谱检测方法，可对儿童咳液质量进行整体描述和评价，从而保证产品质量可控、稳定。
因此，本发明公开了一种儿童咳液特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
供试品溶液的制备：取儿童咳液供试样品制备供试品溶液；
测试：取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按照梯度洗脱程序进行色谱分析，梯度洗脱程序包括：0→30-40min，流动相A：流动相B的体积比为3-8％：97-92％→8-12％：92-88％；30-40→55-65min，流动相A：流动相B的体积比为8-12％：92-88％→16-20％：84-80％；55-65→95-105min，流动相A：流动相B的体积比为16-20％：84-80％→38-42％：62-58％；95-105→110-120min，流动相A：流动相B的体积比为38-42％：62-58％→88-92％：12-8％；110-120→111-121min，流动相A：流动相B的体积比为88-92％：12-8％→3-8％：97-92％；111-121→120-130min，流动相A：流动相B的体积比为3-8％：97-92％→3-8％：97-92％；柱温为25-35℃；流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为200-220nm；得到儿童咳液特征图谱。
优选的，测试步骤中，梯度洗脱程序包括：0-40min，流动相A：流动相B的体积比为3-7％：97-93％→8-12％：92-88％；40-65min，流动相A：流动相B的体积比为8-12％：92-88％→16-20％：84-80％；65-105min，流动相A：流动相B的体积比为16-20％：84-80％→38-42％：62-58％；105-120min，流动相A：流动相B的体积比为38-42％：62-58％→88-92％：12-8％；120-121min，流动相A：流动相B的体积比为88-92％：12-8％→3-7％：97-93％；121-130min，流动相A：流动相B的体积比为3-7％：97-93％→3-7％：97-93％。
优选的，还包括儿童咳液对照特征图谱的构建，对多批儿童咳液供试样品检测得到的特征图谱，利用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成儿童咳液对照特征图谱。
优选的，利用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成儿童咳液对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
优选的，所述儿童咳液特征图谱包括8个共有特征峰，共有特征峰为：1号峰为共有特征峰，2号峰为苦杏仁苷，3号峰为共有特征峰，4号峰为甘草苷，5号峰为共有特征峰，6号峰为共有特征峰，7号峰为共有特征峰，8号峰为白花前胡甲素。
优选的，所述儿童咳液特征图谱包括8个共有特征峰，其中8号峰为白花前胡甲素的参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的土5％范围之内；规定值为0.24(峰1)、0.25(峰2)、0.46(峰3)、0.51(峰4)、0.71(峰5)、0.72(峰6)、0.77(峰7)。
优选的，所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：取儿童咳液供试样品，加入溶剂定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
优选的，所述儿童咳液供试样品包括但不限于儿童咳液的合剂、口服溶液剂。
优选的，所述儿童咳液与溶剂的体积比为1-2：3-8。
优选的，所述溶剂选自正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于60％。
优选的，在所述滤过步骤中所采用的滤膜的微孔大小为0.22-0.45μm。
优选的，还包括对照品参照物溶液的制备并按照上述任一所述的高效液相色谱法检测，得到对照品特征图谱。
优选的，所述对照品参照物溶液的制备方法包括如下步骤：取苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素对照品，加溶剂制成每1ml含苦杏仁苷0.1-0.3mg、甘草苷10-30μg、白花前胡甲素5-15μg的混合溶液，摇匀，即得。
优选的，所述溶剂选自正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于60％。
优选的，所述测试步骤中使用的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自WatersXBridge-C18色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱或Kromasil 100-5-C18色谱柱。
本发明还提供了一种儿童咳液特征图谱，由上述任一所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种儿童咳液对照特征图谱，选自如下(1)-(6)中的任一项：
(1)其具有8个共有特征峰，保留时间分别是28.571min、29.424min、54.573min、61.488min、85.095min、85.871min、92.633min、119.447min；或者所述儿童咳液对照特征图谱的保留时间与上述列举的8个保留时间的RSD<0.3％、<0.1％或者<0.05％；
(2)其具有8个共有特征峰，保留时间分别是31.275min、32.233min、59.370min、66.154min、86.511min、87.521min、92.512min、120.414min；或者所述儿童咳液对照特征图谱的保留时间与上述列举的8个保留时间的RSD<3％、RSD<0.3％、<0.1％或者<0.05％；
(3)其具有8个共有特征峰，保留时间分别是36.857min、37.853min、61.491min、68.548min、88.710min、89.746min、94.774min、121.520min；或者所述儿童咳液对照特征图谱的保留时间与上述列举的8个保留时间的RSD<3％、RSD<0.3％、<0.1％或者<0.05％；
(4)其具有8个共有特征峰，其中8号峰为白花前胡甲素的参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的土5％范围之内；规定值为0.24(峰1)、0.25(峰2)、0.46(峰3)、0.51(峰4)、0.71(峰5)、0.72(峰6)、0.77(峰7)、1.00(峰8)；
(5)其具有8个共有特征峰，其中8号峰为白花前胡甲素的参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的土5％范围之内；规定值为0.24(峰1)、0.25(峰2)、0.46(峰3)、0.51(峰4)、0.71(峰5)、0.72(峰6)、0.77(峰7)、1.00(峰8)，而且其中的3个峰分别与对照品参照物的特征图谱中的3个特征峰的保留时间相同，所述对照品参照物的特征图谱为上述所述的对照品参照物的特征图谱；
(6)使用多批儿童咳液按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照谱图。
至少采用2批儿童咳液得到对照谱图，例如采用3个批次、5个批次、11个批次、20个批次的儿童咳液。
按照本发明的方法测定了11批儿童咳液，确定了8个共有特征峰。共有特征峰的选取可以通过指纹图谱相似度评价软件进行。
本发明还公开了上述任一所述的儿童咳液特征图谱的构建方法或者所述的儿童咳液对照特征图谱在儿童咳液产品的质量检测中的用途。
所述待测儿童咳液产品包括但不局限于儿童咳液合剂或者儿童咳液口服溶液剂。
本发明还提供了一种儿童咳液的质量检测方法，包括将待测儿童咳液产品的特征图谱与儿童咳液对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测儿童咳液产品的特征图谱为使用待测儿童咳液产品按照上述任一所述的构建方法得到，所述儿童咳液对照特征图谱为所述的儿童咳液对照特征图谱。
将待测儿童咳液产品的特征图谱与儿童咳液对照特征图谱的相似度如果不低于0.85，则为质量合格；如果低于0.85，则为不合格；具体地，所述相似度通过国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统得到。
优选的，按照上述任一所述的儿童咳液特征图谱的构建方法同法操作检测待测儿童咳液产品及对照品，得到相应的特征图谱，将待测儿童咳液产品特征图谱与儿童咳液对照特征图谱、对照品特征图谱相对比，评价其质量。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，采用乙腈(A)-水(B)为流动相，在该流动相作用下，色谱图基线平稳，通过反复试验得到洗脱程序，严格控制高效液相色谱的条件，对样品进行全波长检测，根据收集的三维图谱，综合考察，发现200-220nm波长处的各色谱峰相应比较均衡，且在所述的洗脱条件下，克服了由于化学成分复杂造成的干扰以致不能全面的、清楚的对所述儿童咳液相关剂型质量进行检测的缺陷，获得了8个共有特征峰，并实现了8个共有特征峰的有效分离，峰形良好且无干扰，从而实现了全面的、清楚的对所述儿童咳液进行有效性的质量检测，进一步实现了儿童咳液质量的控制，且该质量检测方法具有操作简便、稳定可靠、精密度高、重现性好、易于掌握等优点。
2.本发明所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，取儿童咳液，选用正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇稀释相应倍数，溶解效果好，易过滤，使得获得的供试品溶液更有利于药物的质量检测，使得检测得到的色谱更精确、稳定、可靠，且该处理方法具有方便，操作简单等优点。
3.本发明所述的儿童咳液特征图谱的质量检测方法，通过待测儿童咳液产品的特征图谱与儿童咳液对照特征图谱进行比较，对儿童咳液的特征有效成分进行质量检测，使得对所述儿童咳液相关制剂的质量检测更全面，保证了所述儿童咳液相关制剂质量的有效性和可控性，通过对苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素等8个特征峰进行鉴别，使得对所述儿童咳液相关制剂的质量检测更全面，有利于对有效成分的全面监控，进一步保证了所述儿童咳液相关制剂质量的可控性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中对照品参照物的特征图谱；
图2是本发明实施例1中待测儿童咳液的特征图谱；
图3是本发明实施例1中11个批次儿童咳液样品的对照特征图谱；
图4是本发明实施例2中待测儿童咳液的特征图谱；
图5是本发明实施例3中待测儿童咳液的特征图谱；
图6是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测的三维图谱；
图7是本发明实验例中儿童咳液在210nm波长下的特征图谱；
图8是本发明实验例中儿童咳液在245nm波长下的特征图谱；
图9是本发明实验例中儿童咳液在321nm波长下的特征图谱；
图10是本发明实验例中儿童咳液在366nm波长下的特征图谱；
图11是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(1)的供试品色谱图；
图12是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(2)的供试品色谱图；
图13是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(3)的供试品色谱图；
图14是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(4)的供试品色谱图；
图15是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(5)的供试品色谱图；
图16是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(6)的供试品色谱图；
图17是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(7)的供试品色谱图；
图18是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(8)的供试品色谱图；
图19是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(9)的供试品色谱图；
图20是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(10)的供试品色谱图；
图21是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(11)的供试品色谱图；
图22是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(12)的供试品色谱图；
图23是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(13)的供试品色谱图；
图24是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(14)的供试品色谱图；
图25是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(15)的供试品色谱图；
图26是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(16)的供试品色谱图；
图27是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(17)的供试品色谱图；
图28是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(18)的供试品色谱图；
图29是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(19)的供试品色谱图；
图30是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(20)的供试品色谱图；
图31是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中稳定性试验结果；
图32是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中精密度试验结果；
图33是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中重复性试验结果；
图34是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中11批次样品的特征图谱；
图35是本发明实验例中儿童咳液HPLC特征图谱的考察实验中生成的对照特征图谱。
图36是本发明对比例2中甘草酸铵对照品的特征图谱。
图37是本发明对比例2中儿童咳液供试品的特征图谱。
图38是本发明对比例3中白花前胡乙素对照品的特征图谱。
图39是本发明对比例3中儿童咳液供试品的特征图谱。
图40是本发明对比例4中儿童咳液供试品的特征图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明实施例及实验例采用的实验仪器与试剂见表1。
表1实验仪器与试剂统计表
Figure GDA0004164567160000061
Figure GDA0004164567160000071
实施例1
本实施例提供了一种儿童咳液特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
供试品溶液A的制备：精密量取11个批次儿童咳液样品1ml，置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得各样品的供试品溶液A；
参照物溶液的制备：取苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含苦杏仁苷0.2mg、甘草苷20μg、白花前胡甲素10μg的混合溶液，摇匀，即得对照品参照物溶液；
测定：分别吸取对照品参照物溶液、11份样品的供试品溶液A和待测儿童咳液样品的供试品溶液B10μl，注入液相色谱仪，测定得到对照品参照物的特征图谱、待测儿童咳液的特征图谱和根据11份样品生成的对照特征图谱，如图1-3所示。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择Waters XBridge C18(4.6×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按照程序进行梯度洗脱：0-40min，流动相A：流动相B的体积比为5％：95％→10％：90％；40-65min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％→18％：82％；65-105min，流动相A：流动相B的体积比为18％：82％：40％：60％；105-120min，流动相A：流动相B的体积比为40％：60％→90％：10％；120-121min，流动相A：流动相B的体积比为90％：10％→5％：95％；121-130min，流动相A：流动相B的体积比为5％：95％→5％：95％；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为210nm。
将得到的11份样品的特征图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.50，由国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照特征图谱(如图3所示)，所述儿童咳液样品的对照特征图谱包括8个共有特征峰，共有特征峰为：1号峰为共有特征峰，2号峰为苦杏仁苷，3号峰为共有特征峰，4号峰为甘草苷，5号峰为共有特征峰，6号峰为共有特征峰，7号峰为共有特征峰，8号峰为白花前胡甲素；以8号峰白花前胡甲素为参照峰，各峰号相对保留时间分别为：1号峰：0.24，2号峰：0.25，3号峰：0.46，4号峰：0.51，5号峰：0.71，6号峰：0.72，7号峰：0.77，8号峰：1.00。8个共有特征峰的保留时间分别为28.571min、29.424min、54.573min、61.488min、85.095min、85.871min、92.633min、119.447min。
本实施例还提供了一种儿童咳液的质量检测方法，包括：
待测样品的供试品溶液B制备：取需要进行特征图谱检测的待测儿童咳液样品，按照上述供试品溶液A的制备方法，制得待测儿童咳液样品的供试品溶液B；按照测试步骤的色谱条件，制得待测儿童咳液样品的特征图谱。
对得到的待测儿童咳液样品的特征图谱进行分析，将其与对照品特征图谱和对照特征图谱进行对比，通过国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，以评价该待测儿童咳液的质量。
实施例2
本实施例提供了一种儿童咳液特征图谱的构建方法，对儿童咳液产品进行质量检测，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：精密量取待测儿童咳液样品1ml，置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；
测试：分别吸取对照品参照物溶液和供试品溶液8μl，注入液相色谱仪，测定，得到待测儿童咳液的特征图谱，其中，待测儿童咳液的特征图谱如图4所示。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0-40min，流动相A：流动相B的体积比为4％：96％→9％：91％；40-65min，流动相A：流动相B的体积比为9％：91％→17％：83％；65-105min，流动相A：流动相B的体积比为17％：83％→39％：61％；105-120min，流动相A：流动相B的体积比为39％：61％→89％：11％；120-121min，流动相A：流动相B的体积比为89％：11％→4％：96％；121-130min，流动相A：流动相B的体积比为4％：96％→4％：96％；柱温为25℃；流速为0.9ml/min；检测波长为205nm。
本实施例还提供了一种儿童咳液的质量检测方法，包括通过儿童咳液特征图谱的构建方法得到的待测儿童咳液的特征图谱，还包括将待测儿童咳液的特征图谱与儿童咳液对照特征图谱进行比较的步骤，待测儿童咳液的特征图谱包括8个共有特征峰，保留时间分别是31.275min、32.233min、59.370min、66.154min、86.511min、87.521min、92.512min、120.414min，判定为质量合格。
实施例3
本实施例提供了一种儿童咳液特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：精密量取待测儿童咳液样品1ml，置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含苦杏仁苷0.2mg、甘草苷20μg、白花前胡甲素10μg的混合溶液，摇匀，即得对照品参照物溶液；
测试：分别吸取对照品参照物溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，得到待测儿童咳液的特征图谱和对照品特征图谱，其中，待测儿童咳液的特征图谱如图5所示。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择Kromasil 100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0-40min，流动相A：流动相B的体积比为6％：94％→11％：89％；40-65min，流动相A：流动相B的体积比为11％：89％→19％：81％；65-105min，流动相A：流动相B的体积比为19％：81％→41％：59％；105-120min，流动相A：流动相B的体积比为41％：59％→91％：9％；120-121min，流动相A：流动相B的体积比为91％：9％→6％：94％；121-130min，流动相A：流动相B的体积比为6％：94％→6％：94％；柱温为35℃；流速为1.1ml/min；检测波长为215nm。
本实施例还提供了一种儿童咳液的质量检测方法，包括通过儿童咳液特征图谱的构建方法得到的待测儿童咳液的特征图谱，还包括将待测儿童咳液的特征图谱与儿童咳液对照特征图谱进行比较的步骤，待测儿童咳液的特征图谱包括8个共有特征峰，保留时间分别是36.857min、37.853min、61.491min、68.548min、88.710min、89.746min、94.774min、121.520min，判定为质量合格。
实验例1
1、儿童咳液HPLC特征图谱的考察
(1)波长的选择
采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，根据收集的三维图谱(见图6)，并同时收集210nm、245nm、321nm、366nm波长处的图谱(图7-图10)，综合考察，样品在210nm波长处的各色谱峰相应比较均衡，因此最后确定210nm为儿童咳液特征图谱的检测波长。
(2)色谱条件的选择
按照本发明实施例1中的方案进行操作，其中梯度洗脱程序分别选择按照表2梯度洗脱程序(1)、表3梯度洗脱程序(2)、表4梯度洗脱程序(3)、表5梯度洗脱程序(4)、表6梯度洗脱程序(5)、表7梯度洗脱程序(6)、表8梯度洗脱程序(7)、表9梯度洗脱程序(8)、表10梯度洗脱程序(9)、表11梯度洗脱程序(10)、表12梯度洗脱程序(11)、表13梯度洗脱程序(12)、表14梯度洗脱程序(13)(洗脱程序(13)为实施例1中的洗脱程序)、表15梯度洗脱程序(14)、表16梯度洗脱程序(15)、表17梯度洗脱程序(16)、表18梯度洗脱程序(17)、表19梯度洗脱程序(18)、表20梯度洗脱程序(19)、表21梯度洗脱程序(20)洗脱，流速均为1.0ml/min，检测波长均为210nm。
所得液相色谱图见图11(洗脱程序(1)、图12(洗脱程序(2)、图13(洗脱程序(3)、图14(洗脱程序(4)、图15(洗脱程序(5)、图16(洗脱程序(6)、图17(洗脱程序(7)、图18(洗脱程序(8)、图19(洗脱程序(9)、图20(洗脱程序(10)、图21(洗脱程序(11)、图22(洗脱程序(12)、图23(洗脱程序(13)、图24(洗脱程序(14)、图25(洗脱程序(15)、图26(洗脱程序(16)、图27(洗脱程序(17)、图28(洗脱程序(18)、图29(洗脱程序(19)、图30(洗脱程序(20)。
根据结果可知，梯度洗脱程序(11)-(13)、(15)和(16)所得液相色谱图中苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素峰形良好且无干扰，分离度较高，其中梯度洗脱程序(13)分离度更高，各洗脱程序下苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素分离度见表22。
表2洗脱程序(1)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-30 8-10 92-90
30-60 10-18 90-82
60-85 18-40 82-60
85-100 40-90 60-10
100-101 90-8 10-92
101-110 8 92
表3洗脱程序(2)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-30 8-10 92-90
30-50 10-18 90-82
50-75 18-40 82-60
75-90 40-90 60-10
90-91 90-8 10-92
91-100 8 92
表4洗脱程序(3)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-30 8-10 92-90
30-40 10-18 90-82
40-65 18-40 82-60
65-80 40-90 60-10
80-81 90-8 10-92
81-90 8 92
表5洗脱程序(4)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-25 8-10 92-90
25-35 10-18 90-82
35-60 18-40 82-60
60-75 40-90 60-10
75-76 90-8 10-92
76-85 8 92
表6洗脱程序(5)
Figure GDA0004164567160000101
Figure GDA0004164567160000111
表7洗脱程序(6)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-25 7 93
25-50 7-18 93-82
50-90 18-40 82-60
90-105 40-90 60-10
105-106 90-7 10-93
106-115 7 93
表8洗脱程序(7)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-30 5-10 95-90
30-50 10-18 90-82
50-90 18-40 82-60
90-105 40-90 60-10
105-106 90-5 10-95
106-115 5 95
表9洗脱程序(8)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-60 10-18 90-82
60-100 18-40 82-60
100-115 40-90 60-10
115-116 90-8 10-92
116-125 8 92
表10洗脱程序(9)
Figure GDA0004164567160000112
Figure GDA0004164567160000121
表11洗脱程序(10)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-30 8-10 92-90
30-50 10-18 90-82
50-90 18-40 82-60
90-105 40-90 60-10
105-106 90-8 10-92
106-115 8 92
表12洗脱程序(11)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-30 8-10 92-90
30-55 10-18 90-82
55-95 18-40 82-60
95-110 40-90 60-10
110-111 90-8 10-92
111-120 8 92
表13洗脱程序(12)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-35 8-10 92-90
35-60 10-18 90-82
60-100 18-40 82-60
100-115 40-90 60-10
115-116 90-8 10-92
116-125 8 92
表14洗脱程序(13)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-65 10-18 90-82
65-105 18-40 82-60
105-120 40-90 60-10
120-121 90-5 10-95
121-130 5 95
表15洗脱程序(14)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-70 10-18 90-82
70-110 18-35 82-65
110-125 35-90 65-10
125-126 90-5 10-95
126-135 5 95
表16洗脱程序(15)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-65 10-18 90-82
65-95 18-40 82-60
95-110 40-90 60-10
110-111 90-5 10-95
111-120 5 95
表17洗脱程序(16)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-65 10-18 90-82
65-95 18-35 82-65
95-110 35-90 65-10
110-111 90-5 10-95
111-120 5 95
表18洗脱程序(17)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-65 10-18 90-82
65-95 18-40 82-60
95-105 40-90 60-10
105-106 90-5 10-95
106-115 5 95
表19洗脱程序(18)
Figure GDA0004164567160000131
Figure GDA0004164567160000141
表20洗脱程序(19)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-65 10-18 90-82
65-105 18-40 82-60
105-125 40-90 60-10
125-126 90-5 10-95
126-135 5 95
表21洗脱程序(20)
时间(分钟) A(％) B(％)
0-40 5-10 95-90
40-41 10-18 90-82
41-50 18 82
50-90 18-40 82-60
90-110 40-90 60-10
110-111 90-7 93
111-120 7 93
表22各洗脱程序下苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素分离度
Figure GDA0004164567160000142
Figure GDA0004164567160000151
其中“/”表示分离度小于1.0。
2、方法学考察
(1)稳定性
按照本发明实施例1中的方案进行操作，精密吸取同一儿童咳液样品供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h进样，检测特征图谱，以8号峰为参照峰(S)，各特征峰相对保留时间的RSD＜3.0％，相对峰面积的RSD＜7.0％，表明供试品溶液在制备后24h内基本稳定，稳定性结果见图31，稳定性相对保留时间计算结果见表23，稳定性相对峰面积计算结果见表24。
表23稳定性相对保留时间计算结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
0h 0.24 0.24 0.45 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
2h 0.24 0.24 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
4h 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
6h 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
8h 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
10h 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
12h 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
24h 0.24 0.24 0.45 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
RSD(％) 0.24 0.25 0.07 0.15 0.01 0.02 0.04 0.00
表24稳定性相对峰面积计算结果
Figure GDA0004164567160000152
Figure GDA0004164567160000161
(2)精密度
按照本发明实施例1中的方案进行操作，精密吸取同一儿童咳液样品供试品溶液，连续进样6次，检测特征图谱，以8号峰为参照峰(S)，各特征峰相对保留时间的RSD＜3.0％，相对峰面积的RSD＜7.0％，表明仪器精密度良好，精密度结果见图32，精密度相对保留时间计算结果见表25，精密度相对峰面积计算结果见表26。
表25精密度相对保留时间计算结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
1 0.24 0.24 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
2 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
3 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
4 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
5 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
6 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
RSD(％) 0.16 0.17 0.06 0.10 0.01 0.02 0.04 0.00
表26精密度相对峰面积计算结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
1 2.13 5.48 0.29 2.40 0.36 1.20 1.67 1.00
2 2.13 5.57 0.29 2.39 0.36 1.21 1.67 1.00
3 2.15 5.61 0.30 2.41 0.38 1.23 1.68 1.00
4 2.06 5.51 0.29 2.41 0.37 1.22 1.68 1.00
5 1.82 5.24 0.30 2.46 0.36 1.21 1.68 1.00
6 2.00 5.90 0.29 2.38 0.34 1.17 1.68 1.00
RSD(％) 6.04 3.83 1.32 1.09 3.39 1.53 0.27 0.00
(3)重复性
按照本发明实施例1中的方案进行操作，取同一批儿童咳液样品，平行6份，分别进样，记录特征图谱，以8号峰为参照峰(S)，各特征峰相对保留时间的RSD＜3.0％，相对峰面积的RSD＜5.0％，表明该方法的重复性良好，重复性结果见图33，重复性相对保留时间计算结果见表27，重复性相对峰面积计算结果见表28。
表27重复性相对保留时间计算结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
1 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
2 0.24 0.24 0.45 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
3 0.24 0.24 0.45 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
4 0.24 0.24 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
5 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
6 0.24 0.25 0.46 0.51 0.71 0.72 0.77 1.00
RSD(％) 0.27 0.29 0.12 0.19 0.01 0.03 0.05 0.00
表28重复性相对峰面积计算结果
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
1 2.01 5.64 0.30 2.45 0.35 1.23 1.69 1.00
2 2.03 5.89 0.29 2.47 0.36 1.21 1.71 1.00
3 1.80 5.19 0.29 2.35 0.36 1.19 1.72 1.00
4 2.00 5.55 0.29 2.41 0.36 1.22 1.68 1.00
5 1.99 5.51 0.30 2.43 0.37 1.23 1.68 1.00
6 2.05 5.48 0.30 2.47 0.38 1.23 1.68 1.00
RSD(％) 4.59 4.08 1.47 1.99 2.92 1.19 1.01 0.00
(4)耐用性
按照本发明实施例1中的方法进行操作，取同一批儿童咳液样品，制备供试品溶液，在Waters柱、Agilent柱和Kromasil柱进样，记录特征图谱，检测各峰分离度。Waters柱、Agilent柱和Kromasil柱三种柱子分离度良好，表明该方法的耐用性良好，结果见表29。
表29 3种柱子的苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素分离度
Figure GDA0004164567160000171
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Figure GDA0004164567160000181
3、特征图谱采集
采用国家药典委员编制的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(V2.0)，对儿童咳液各批次特征图谱的检测结果进行了分析。采用中位数法，时间窗参数为0.50，由软件生成对照特征图谱(R指纹图谱)。
(1)特征峰标定
按照本发明实施例1中的方案构建11批儿童咳液供试品的特征图谱并进行分析，取每批供试品特征图谱中都出现的典型色谱峰作为特征峰。
在210nm，共8个特征峰，1号峰；2号峰：苦杏仁苷；3号峰；4号峰：甘草苷；5号峰；6号峰；7号峰；8号峰：白花前胡甲素，各色谱峰分别以1～8的序号表示。
(2)各批次样品的测定
各批次样品的特征图谱见图34，生成的对照特征图谱见图35，相似度见结果见表30。
表30 11批儿童咳液相似度计算结果
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 对照指纹图谱
S1 1 0.966 0.965 0.986 0.981 0.954 0.978 0.97 0.97 0.972 0.971 0.983
S2 0.966 1 0.997 0.976 0.983 0.969 0.983 0.983 0.984 0.978 0.98 0.99
S3 0.965 0.997 1 0.976 0.984 0.965 0.981 0.984 0.982 0.977 0.979 0.989
S4 0.986 0.976 0.976 1 0.994 0.978 0.988 0.99 0.99 0.985 0.986 0.995
S5 0.981 0.983 0.984 0.994 1 0.972 0.983 0.988 0.985 0.975 0.976 0.992
S6 0.954 0.969 0.965 0.978 0.972 1 0.977 0.983 0.985 0.972 0.972 0.983
S7 0.978 0.983 0.981 0.988 0.983 0.977 1 0.993 0.996 0.992 0.993 0.996
S8 0.97 0.983 0.984 0.99 0.988 0.983 0.993 1 0.996 0.987 0.989 0.996
S9 0.97 0.984 0.982 0.99 0.985 0.985 0.996 0.996 1 0.992 0.993 0.997
S10 0.972 0.978 0.977 0.985 0.975 0.972 0.992 0.987 0.992 1 0.998 0.993
S11 0.971 0.98 0.979 0.986 0.976 0.972 0.993 0.989 0.993 0.998 1 0.993
对照指纹图谱 0.983 0.99 0.989 0.995 0.992 0.983 0.996 0.996 0.997 0.993 0.993 1
(3)对照特征图谱的建立
各批次样品的特征图谱中应呈现8个特征峰，以S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8为标记。结果如图35。
对比例1
以甘草酸铵为参照物，取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含甘草酸铵0.15mg的溶液，摇匀，即得对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备：精密量取待测儿童咳液样品1ml，置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；
测试：分别吸取对照品参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得到对照品参照物特征图谱和儿童咳液供试品特征图谱，如图36和37所示。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0-60min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％→95％：5％；60-61min，流动相A：流动相B的体积比为95％：5％→10％：90％；61-70min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为237nm；
结果显示，甘草酸铵峰形较差，无法准确表征。
对比例2
以白花前胡乙素为参照物，取白花前胡乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含白花前胡乙素45μg的溶液，摇匀，即得对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备：精密量取待测儿童咳液样品1ml，置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；
测试：分别吸取对照品参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得到对照品特征图谱和供试品特征图谱，如图38和39所示。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0-60min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％→95％：5％；60-61min，流动相A：流动相B的体积比为95％：5％→10％：90％；61-70min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为321nm；
结果显示，白花前胡乙素含量较低，因此响应较低。
对比例3
本对比例提供了一种儿童咳液特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：精密量取待测儿童咳液样品1ml，置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；
测试：吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，得到待测儿童咳液供试品特征图谱，如图40所示。色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0-60min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％→95％：5％；60-61min，流动相A：流动相B的体积比为95％：5％→10％：90％；61-70min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为210nm；
结果显示，甲醇基线不稳，分离效果差。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
供试品溶液的制备：取儿童咳液供试样品制备供试品溶液；
对照品参照物溶液：取苦杏仁苷、甘草苷、白花前胡甲素对照品，加溶剂制成每1ml含苦杏仁苷0.1-0.3mg、甘草苷10-30μg、白花前胡甲素5-15μg的混合溶液，摇匀，即得；
测试：取供试品溶液和对照品参照物溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按照程序进行梯度洗脱：0-40min，流动相A：流动相B的体积比为5％：95％→10％：90％；40-65min，流动相A：流动相B的体积比为10％：90％→18％：82％；65-105min，流动相A：流动相B的体积比为18％：82％→40％：60％；105-120min，流动相A：流动相B的体积比为40％：60％→90％：10％；120-121min，流动相A：流动相B的体积比为90％：10％→5％：95％；121-130min，流动相A：流动相B的体积比为5％：95％→5％：95％；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为210nm；得到儿童咳液特征图谱和对照品参照物的特征图谱；
所述儿童咳液特征图谱具有8个共有特征峰，其中8号峰为白花前胡甲素的参照峰S；各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的土5％范围之内；规定值为0.24(峰1)、0.25(峰2)、0.46(峰3)、0.51(峰4)、0.71(峰5)、0.72(峰6)、0.77(峰7)、1.00(峰8)。
2.根据权利要求1所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：取儿童咳液供试样品，加入溶剂定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，所述儿童咳液供试样品选自儿童咳液的合剂或者口服溶液剂。
4.根据权利要求2所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，所述溶剂选自正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于60％。
5.根据权利要求2所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，所述儿童咳液与溶剂的体积比为1-2：3-8。
6.根据权利要求2所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，在所述滤过步骤中所采用的滤膜的微孔大小为0.22-0.45μm。
7.根据权利要求1所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，在对照品参照物溶液的制备过程中，所述溶剂选自正己烷、甲醇水溶液或者纯甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数不小于60％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的儿童咳液特征图谱的构建方法，其特征在于，所述测试步骤中使用的色谱柱选自Waters XBridge-C18色谱柱、AgilentZORBAX SB-C18色谱柱或Kromasil 100-5-C18色谱柱。
9.一种儿童咳液的质量检测方法，其特征在于，包括将待测儿童咳液产品的特征图谱与儿童咳液对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测儿童咳液产品的特征图谱为使用待测儿童咳液产品按照权利要求1-8中任一所述的构建方法得到，所述儿童咳液对照特征图谱为使用儿童咳液按照权利要求1-8中任一所述的构建方法得到。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，所述待测儿童咳液产品选自儿童咳液合剂或者儿童咳液口服溶液剂。
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