CN117288870B - 蚁灵口服液指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚁灵口服液指纹图谱的建立方法。以蚁灵口服液制备得供试品，以溶有橙皮苷的溶液为对照品溶液，通过高效液相色谱仪测定液相色谱；将得到的液相色谱导入国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版分析，经多点校正，数据匹配，得到蚁灵口服液指纹图谱，获得的指纹图谱37个特征峰，检测到的化学成分较多，避免了因测定个别化学成分而判定蚁灵口服液整体质量的片面性，能有效地表征蚁灵口服液的质量，有利于全面监控药物的质量。本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，具体涉及一种蚁灵口服液指纹图谱的建立方法。
背景技术
蚁灵口服液由鼎突多刺蚁（君药）、灵芝（臣药）、桑葚（臣药）、大枣（佐药）、陈皮（佐药）、续断（使药）制成，全方六味中药互相配伍，具有补肝肾、强筋骨之功效，主要用于肝肾亏损，筋骨不坚证，症见腰膝酸软，头晕眼花，体倦乏力，食少或兼睡眠不安者。
蚁灵口服液现有质量标准中仅采用薄层色谱法，以橙皮苷作为对照品，以陈皮、黑蚂蚁、灵芝作为对照药材，分别进行定性鉴别，同时采用高效液相色谱法对蚁灵口服液中橙皮苷一个成分进行含量测定，质控指标成分较少，无法全面表征中药复方制剂的物质基础以及化学成分群的整体性和复杂性。为更好地控制蚁灵口服液的质量，本发明针对蚁灵口服液药效成分建立了制剂的指纹图谱。
发明内容
本发明的目的是提供一种蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，通过该方法建立蚁灵口服液的指纹图谱，并可以对蚁灵口服液中多个药材的多个药效成分进行定性分析，能较全面的反映蚁灵口服液的质量信息，保证产品质量均一稳定。
本发明提供的一种蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，所述蚁灵口服液由鼎突多刺蚁、灵芝、桑葚、大枣、续断和陈皮组成；通过采用高效液相色谱法检测蚁灵口服液成分从而建立蚁灵口服液指纹图谱，所述建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取蚁灵口服液，用水饱和的正丁醇提取，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷、柚皮芸香苷、川续断皂苷VI、川陈皮素、橘皮素对照品，加甲醇制成每1ml含有200~500μg橙皮苷、50~150μg柚皮芸香苷、150~200μg川续断皂苷VI、50~150μg川陈皮素、50~150μg橘皮素的对照品溶液；
（3）设置高效液相色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温25-35℃，流速为0.8-1.2ml/min，检测波长为200-400nm，并开启PDA检测；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05-0.15%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在体积比为2~65︰98~35的范围内梯度洗脱；
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5~20μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；
（4）将步骤（3）得到的液相色谱导入国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版分析，得到蚁灵口服液的指纹图谱。
优选地，所述步骤（1）的供试品溶液的制备包括：精密吸取蚁灵口服液20ml，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇20ml溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
优选地，所述步骤（2）的对照品溶液中橙皮苷的浓度为387.63μg·ml-1，柚皮芸香苷的浓度为105.00 μg·ml-1，川续断皂苷VI的浓度为149.07μg·ml-1，川陈皮素的浓度为105.38μg·ml-1，橘皮素的浓度为102.89μg·ml-1。
优选地，所述步骤（3）包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以WatersSymmetry C18为色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm，柱温35℃，流速为1.0ml/min，检测波长为203nm，并开启PDA检测；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为0~40min，A︰B为2%︰98%→30%︰70%；40~50min，A︰B为30%︰70%→44%︰56%；50~60min，A︰B为44%︰56%→65%︰35%；
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。
优选地，所述步骤（4）包括：采用国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版，将步骤（3）得到的液相色谱的数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到蚁灵口服液的指纹图谱。
优选地，所述步骤（4）得到的蚁灵口服液的指纹图谱包括柚皮芸香苷对应的19号峰、橙皮苷对应的21号峰、川续断皂苷VI对应的28号峰、川陈皮素对应的34号峰、橘皮素对应的36号峰，其相对保留时间依次对应为0.933、1.000、1.394、1.658、1.744。
优选地，所述步骤（4）得到的蚁灵口服液的指纹图谱的共有峰还包括相对保留时间为0.069的1号峰、相对保留时间为0.073的2号峰、相对保留时间为0.085的3号峰、相对保留时间为0.103的4号峰、相对保留时间为0.122的5号峰、相对保留时间为0.145的6号峰、相对保留时间为0.156的7号峰、相对保留时间为0.233的8号峰、相对保留时间为0.292的9号峰、相对保留时间为0.364的10号峰、相对保留时间为0.423的11号峰、相对保留时间为0.451的12号峰、相对保留时间为0.466的13号峰、相对保留时间为0.478的14号峰、相对保留时间为0.502的15号峰、相对保留时间为0.538的16号峰、相对保留时间为0.572的17号峰、相对保留时间为0.651的18号峰、相对保留时间为0.972的20号峰、相对保留时间为1.023的22号峰、相对保留时间为1.246的23号峰、相对保留时间为1.304的24号峰、相对保留时间为1.349的25号峰、相对保留时间为1.354的26号峰、相对保留时间为1.385的27号峰、相对保留时间为1.398的29号峰、相对保留时间为1.408的30号峰、相对保留时间为1.421的31号峰、相对保留时间为1.447的32号峰、相对保留时间为1.504的33号峰、相对保留时间为1.708的35号峰、相对保留时间为1.779的37号峰。
本发明的有益效果是：
1、用本发明所提供的方法所建立的蚁灵口服液指纹图谱，能有效地表征蚁灵口服液的质量，有利于全面监控药味的质量。
2、以蚁灵口服液的指纹图谱作为一个整体对待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因测定个别化学成分而判定蚁灵口服液质量的片面性，又减少了人为主观判断而造成误差的可能性和为质量达标而人为处理的可能性。
3、本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点。
附图说明
图1为橙皮苷对照品的HPLC色谱图；
图2为川续断皂苷Ⅳ对照品的HPLC色谱图；
图3为橘皮素对照品的HPLC色谱图；
图4为柚皮芸香苷对照品的HPLC色谱图；
图5为川陈皮素对照品的HPLC色谱图；
图6为本发明实施例1中16个批次蚁灵口服液指纹图谱叠加图；
图7为本发明实施例1中测得的蚁灵口服液的对照指纹图谱，其中，19号峰：柚皮芸香苷，21号峰：橙皮苷，28号峰：川续断皂苷Ⅳ，34号峰：川陈皮素，36号峰：橘皮素；
图8为本发明实施例1中鼎突多刺蚁药材阳性对照色谱图；
图9为本发明实施例1中鼎突多刺蚁药材阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图；
图10为本发明实施例1中灵芝药材阳性对照色谱图；
图11为本发明实施例1中灵芝药材阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图；
图12为本发明实施例1中陈皮药材阳性对照色谱图；
图13为本发明实施例1中陈皮药材阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图；
图14为本发明实施例1中桑葚药材阳性对照色谱图；
图15为本发明实施例1中桑葚阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图；
图16为本发明实施例1中大枣药材阳性对照色谱图；
图17为本发明实施例1中大枣阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图；
图18为本发明实施例1中续断药材阳性对照色谱图；
图19为本发明实施例1中续断阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例用到的仪器如下：
十万分之一天平（MS205DU，梅特勒）；高效液相色谱仪（WatersArc，美国沃特世公司，PDA检测器）；超声波清洗器（KQ-600E，昆山市超声仪器有限公司）；中药粉碎机（QE-300,浙江屹立工贸有限公司)。
实施例用到的试剂如下：
柚皮芸香苷对照品（批号112080-202201：含量100%）、橙皮苷对照品（批号：110721-202220，含量：97.2%）、川续断皂苷VI（批号111685-201908：含量94.3%），川陈皮素对照品（批号：112055-202102，含量99.7%）、橘皮素对照品（批号：112054-202102，含量：99.7%）。以上对照品均购自于中国食品药品检定研究院。色谱甲醇、乙腈购自ASTOON公司，色谱磷酸购于阿拉丁公司。所用水为纯化水。
共收集16个批次的蚁灵口服液，均由湖南迪诺制药股份有限公司生产。各批次的蚁灵口服液供试样本基本信息见表1。
表1蚁灵口服液供试样本基本信息
实施例1
蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取以上表1的16个批次不同的蚁灵口服液，精密吸取20ml，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇20ml溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷对照品、柚皮芸香苷对照品、川续断皂苷VI对照品、川陈皮素对照品、橘皮素对照品，加入甲醇，配制成对照品溶液，对照品溶液中橙皮苷的浓度为387.63μg·ml-1，柚皮芸香苷的浓度为105.00 μg·ml-1，川续断皂苷VI的浓度为149.07μg·ml-1，川陈皮素的浓度为105.38μg·ml-1，橘皮素的浓度为102.89μg·ml-1；
高效液相色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以WatersSymmetry C18为色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm，柱温35℃，流速为1.0ml/min，检测波长为203nm，并开启PDA检测；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为0~40min，A︰B为2%︰98%→30%︰70%；40~50min，A︰B为30%︰70%→44%︰56%；50~60min，A︰B为44%︰56%→65%︰35%；
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10ul，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。
将液相色谱图导入指纹图谱相似度评价软件分析，以200101-1批次蚁灵口服液作为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1min，采用平均数法计算，多点校正、数据匹配，生成叠加色谱图（见图6）和对照指纹图谱（见图7）。将16批蚁灵口服液的指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度分析，结果见表2。
表2批蚁灵口服液指纹图谱相似度
由表2可知，不同批次蚁灵口服液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.99-1之间，表明不同批次间的相似度较高，工艺相对稳定。
经与5种对照品对比，确认31.162min峰为柚皮芸香苷、33.354min峰为橙皮苷、46.482min峰为川续断皂苷VI、55.349min峰为川陈皮素、58.227min峰为橘皮素，其中选取分离度较好，峰面积较大且稳定，保留时间适中的橙皮苷为参照峰（S）。以橙皮苷为参照峰的高效液相指纹图谱共确定37个共有峰。
以下进行指纹图谱方法学考察：
1、重复性试验
取蚁灵口服液200301-2批，平行吸取6份，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，按实施例1中色谱条件分别进样，得到6张色谱图。以橙皮苷为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对峰面积及相对保留时间，并计算RSD值，结果见表3和表4。
表3 蚁灵口服液指纹图谱重复性试验考察结果（主要共有峰相对峰面积）
表4 蚁灵口服液指纹图谱重复性试验考察结果（主要共有峰相对保留时间）
由表3和表4可知，各共有峰的相对峰面积RSD%小于3%、相对保留时间RSD%小于3%，表明该方法重复性良好。
2、蚁灵口服液与处方药材相关性及共有峰归属分析
按实施例1方法测定蚁灵口服液中鼎突多刺蚁、灵芝、陈皮、桑葚、大枣、续断的阳性对照色谱图，通过PDA检测器对蚁灵口服液指纹图谱与各药材阳性对照色谱图中色谱峰的紫外吸收进行分析，比较色谱峰的保留时间，最终确认蚁灵口服液指纹图谱中共有色谱峰在药材色谱图上的归属峰。
鼎突多刺蚁中的共有峰归属分析：
鼎突多刺蚁的阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图，见图9。通过色谱图对比，可知指纹图谱共有峰的1、2、4号峰来自鼎突多刺蚁药材。
灵芝中的共有峰归属分析：
灵芝的阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图，见图11。通过色谱图对比，可知指纹图谱共有峰的4号峰来自灵芝药材。
陈皮中的共有峰归属分析：
陈皮的阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图，见图13。通过色谱图对比，可知指纹图谱共有峰的3、12、17、19、21、23、27、34、35、36号峰来自陈皮药材。
桑葚中的共有峰归属分析：
桑葚的阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图，见图15。通过色谱图对比，可知指纹图谱共有峰的1、2、4、6、7号峰来自桑葚药材。
大枣中的共有峰归属分析：
大枣的阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图，见图17。通过色谱图对比，可知指纹图谱共有峰的1、2、4、5、6、9、15号峰来自大枣药材。
续断中的共有峰归属分析：
续断的阳性对照色谱图与指纹图谱的色谱对比图，见图19。通过色谱图对比，可知指纹图谱共有峰的6、14、22、24、28号峰来自续断药材。
由上述结果分析可知，蚁灵口服液指纹图谱中的37个共有峰，在处方中鼎突多刺蚁、灵芝、陈皮、桑葚、大枣、续断六味药材阳性对照色谱图中，基本找到明确归属。共有峰中的19、21、27、34、35、36号峰来自陈皮；共有峰中的24、28号峰来自续断；1、2号峰同时存在于鼎突多刺蚁、大枣和桑葚药材中；4号峰同时存在于鼎突多刺蚁、大枣、灵芝和桑葚药材中；6号峰同时存在于大枣、续断和桑葚药材中。由此可见，蚁灵口服液的指纹图谱基本能代表蚁灵口服液的物质基础。
相比现有技术，本发明提供的蚁灵口服液指纹图谱检测方法重复性好，可以客观、全面、准确的评价蚁灵口服液的质量。
以上所述仅是示例本发明实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以根据现有技术做出改进和优化，这些改进和优化也属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述蚁灵口服液由鼎突多刺蚁、灵芝、桑葚、大枣、续断和陈皮组成；通过采用高效液相色谱法检测蚁灵口服液成分从而建立蚁灵口服液指纹图谱，所述建立方法包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取蚁灵口服液，用水饱和的正丁醇提取，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷、柚皮芸香苷、川续断皂苷VI、川陈皮素和橘皮素对照品，加甲醇制成每1ml含有200~500μg橙皮苷、50~150μg柚皮芸香苷、150~200μg川续断皂苷VI、50~150μg川陈皮素和50~150μg橘皮素的对照品溶液；
（3）设置高效液相色谱条件：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温25-35℃，流速为0.8-1.2ml/min，检测波长为203nm，并开启PDA检测；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05-0.15%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为0~40min，A︰B为2%︰98%→30%︰70%；40~50min，A︰B为30%︰70%→44%︰56%；50~60min，A︰B为44%︰56%→65%︰35%；
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液5~20μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱；
（4）将步骤（3）得到的液相色谱导入国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版分析，得到蚁灵口服液的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（1）的供试品溶液的制备包括：精密吸取蚁灵口服液20ml，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml，合并正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇20ml溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（2）的对照品溶液中橙皮苷的浓度为387.63μg·ml-1，柚皮芸香苷的浓度为105.00 μg·ml-1，川续断皂苷VI的浓度为149.07μg·ml-1，川陈皮素的浓度为105.38μg·ml-1，橘皮素的浓度为102.89μg·ml-1。
4.根据权利要求1所述的蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（3）包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以Waters Symmetry C18为色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm，柱温35℃，流速为1.0ml/min，检测波长为203nm，并开启PDA检测；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流动相A、B的比例变化为0~40min，A︰B为2%︰98%→30%︰70%；40~50min，A︰B为30%︰70%→44%︰56%；50~60min，A︰B为44%︰56%→65%︰35%；
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别得到供试品溶液和对照品溶液的液相色谱。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（4）包括：采用国家药典委中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版，将步骤（3）得到的液相色谱的数据导入、多点校正、数据匹配，分析得到蚁灵口服液的指纹图谱。
6.根据权利要求5所述的蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（4）得到的蚁灵口服液的指纹图谱包括柚皮芸香苷对应的19号峰、橙皮苷对应的21号峰、川续断皂苷VI对应的28号峰、川陈皮素对应的34号峰和橘皮素对应的36号峰，其相对保留时间依次对应为0.933、1.000、1.394、1.658和1.744。
7.根据权利要求6所述的蚁灵口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤（4）得到的蚁灵口服液的指纹图谱的共有峰还包括相对保留时间为0.069的1号峰、相对保留时间为0.073的2号峰、相对保留时间为0.085的3号峰、相对保留时间为0.103的4号峰、相对保留时间为0.122的5号峰、相对保留时间为0.145的6号峰、相对保留时间为0.156的7号峰、相对保留时间为0.233的8号峰、相对保留时间为0.292的9号峰、相对保留时间为0.364的10号峰、相对保留时间为0.423的11号峰、相对保留时间为0.451的12号峰、相对保留时间为0.466的13号峰、相对保留时间为0.478的14号峰、相对保留时间为0.502的15号峰、相对保留时间为0.538的16号峰、相对保留时间为0.572的17号峰、相对保留时间为0.651的18号峰、相对保留时间为0.972的20号峰、相对保留时间为1.023的22号峰、相对保留时间为1.246的23号峰、相对保留时间为1.304的24号峰、相对保留时间为1.349的25号峰、相对保留时间为1.354的26号峰、相对保留时间为1.385的27号峰、相对保留时间为1.398的29号峰、相对保留时间为1.408的30号峰、相对保留时间为1.421的31号峰、相对保留时间为1.447的32号峰、相对保留时间为1.504的33号峰、相对保留时间为1.708的35号峰和相对保留时间为1.779的37号峰。
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