CN108107130B - 一种参枝苓制剂指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药用制剂的检测方法，具体涉及一种中药制剂参枝苓口服液指纹图谱的构建方法。本发明主要采用高效液相色谱法检测，流动相：乙腈‑0.5％冰乙酸水溶液，A为乙腈，流动相B为0.5％冰乙酸水溶液，检测波长203nm，柱温30℃，进样量10μl，所有组分均在60min内被检测完。
Description
技术领域
本发明涉及一种药用制剂的检测方法，具体涉及一种中药制剂参枝苓口服液的指纹图谱测定方法。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是当今社会严重危害老年人健康的一种神经退行性疾病，是老年痴呆中最常见的类型，占痴呆患者的60%~70%。我国正面临人口老龄化的挑战，目前中国的老年痴呆的患者已达到1000万人，居世界第一，我国是已成为世界上痴呆人数最多且增长速度最快的国家。中药治疗阿尔茨海默病有其优势，如已经上市的中药参枝苓口服液，其配方和工艺描述在中国专利201310002188.9“一种治疗阿尔茨海默症的中药制剂”中，临床用于轻中度阿尔茨海默病心气不足证。
参枝苓口服液作为一种中药复方制剂，由党参、桂枝、白芍、炙甘草、茯苓、干姜、制远志、石菖蒲、龙骨、牡蛎等10味药材组成，以益气安神和补中健脾的党参和温通经脉、 助阳化气的桂枝作为君药，白芍敛阴养血、柔肝止痛，甘草益气补脾，养心复脉，茯苓补益心脾之气，渗湿安神，共同作为臣药；干姜回阳通脉，温中散寒，燥湿消痰，远志安神益智，化痰，龙骨收敛固涩，安神定惊，牡蛎重镇安神，潜阳补阴，共为佐药；石菖蒲开窍豁痰，益智醒神，化湿开胃，引诸药直达病所，兼做使药，成分复杂多样。目前其质控技术多采用对一种或少数几种成分的含量测定方法，如中国发明专利CN201510224392.4，公开了一种参枝苓口服液指纹图谱的建立方法，其仅对肉桂酸、芍药苷、甘草苷、芍药内酯苷、 甘草酸铵等有效成分作定量分析，只涉及桂枝、芍药两种原药材，对其他8味药材的主要成分未做研究，特别是对君药党参、臣药甘草、茯苓等对药品疗效有重要影响的药材缺乏检测，难以判定制剂整体质量。 因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映复方制剂所含多成分的指纹图谱检测方法对于参枝苓口服液的质量控制和评价非常必要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种参枝苓口服液的指纹图谱测定方法。本发明通过对参枝苓口服液指纹图谱的研究，提供了一种操作简便、稳定、精密度高和重现性好，可用于参枝苓口服液的质量检测和评价的方法，包含了除龙骨和牡蛎外其他8种原药材有效成分的信息，弥补了现有质量控制方法的不足，使参枝苓口服液的质量控制技术更为完善、科学。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
(1)供试品溶液的制备：取参枝苓口服液，加入甲醇，超声提取，用水饱和正丁醇萃取，萃取液过滤，取续滤液回收正丁醇，加甲醇定容即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的党参炔苷、肉桂酸、芍药苷、甘草酸铵、茯苓酸、姜辣素、远志总糖酯、β-细辛醚对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；
(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得参枝苓口服液指纹图谱；
步骤(3)中，测定的液相色谱条件为：色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％冰乙酸水溶液(体积分数)；梯度洗脱；流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为203nm。
步骤(3)中，梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-10min，流动相A10%～12%，流动相B 90％-88％；
10-15min，流动相A12%～16%,流动相B 88％-84％；
15-26min，流动相A16%～24.2%,流动相B84％-75.8％；
26-45min，流动相A24.2%～30%,流动相B 75.8％-70％；
45-53min，流动相A30%～38.5%,流动相B 70％-61.5％；
53-60min，流动相A38.5%～65.8%,流动相B 61.5％-34.2％。
具体的，步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：精密量取1.0ml参枝苓口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取15min，恢复至室温，用水饱和正丁醇萃取，萃取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液回收正丁醇，转移至10ml容量瓶中加甲醇定容，即得供试品溶液。
步骤(2)中，对照品溶液的制备方法为：
精密称取党参炔苷标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的对照品溶液；
精密称取肉桂酸标准品1.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.125mg/mL的对照品溶液；
精密称取芍药苷标准品1.58mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.158mg/mL的对照品溶液；
精密称取甘草酸铵标准品3.22mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.322mg/mL的对照品溶液；
精密称取茯苓酸标准品5.82mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.582mg/mL的对照品溶液；
精密称取姜辣素标准品1.48mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.148mg/mL的对照品溶液；
精密称取远志总糖酯标准品4.61mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.461mg/mL的对照品溶液；
精密称取β-细辛醚标准品2.75mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.275mg/mL的对照品溶液。
步骤(3)中，分别精密量取供试品溶液和对照品溶液的体积均为10μL。
需要说明的是，本发明的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本发明主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件，检测波长和分析时间等条件进行了优选。
其中：1)供试品溶液配制方法的考察： 试验比较了不同提取溶剂如丙酮、乙醇、甲醇的水浴回流和索氏提取、超声提取等不同提取方法的提取效果，结果以甲醇超声提取的总体效果为佳；同时还考察了以甲醇为提取溶剂，不同提取时间（10,15，20min）的提取效果，结果表明，超声提取15min，提取较完全；同时还考察了以乙醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇对甲醇提取物进行萃取的效果，结果表明采用水饱和正丁醇萃取后所得图谱信息量较大，既含脂溶性成分也包括水溶性成分，符合指纹图谱整体性的要求，其尽可能反映了药材所含的全部信息。因而供试品溶液制备方法选择甲醇超声15min提取，再采用水饱和正丁醇萃取的方法。此外还比较了提取溶剂稀释倍数对样品溶液检测效果的影响，如稀释20倍，10倍和5倍，结果以甲醇作为提取溶剂稀释10倍的检测效果为佳。
2)色谱条件的选择及优化：洗脱系统的筛选：本发明在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇--0.1%磷酸、乙腈-0.3%磷酸、乙腈-0.1％冰乙酸水、乙腈-0.5％冰乙酸水等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行了等度和梯度洗脱试验；根据色谱峰分离效果和峰型等，优选乙腈-0.5％冰乙酸水为最终洗脱系统。
洗脱程序的筛选：本发明以乙腈-0.5％冰乙酸水做流动相，筛选了程序1-6的洗脱程序，以乙腈百分比表示，括号内表示时间（min）:
程序1：10%（0）～12%（10）～20.5%（26）～24.2%（39）～28%（46）～39.4%（55）～43%（60）
程序2：10%（0）～18%（23）～20.5%（26）～24.2%（39）～28%（43）～39.4%（52）～43%（60）
程序3：10%（0）～18%（23）～20.5%（26）～24.2%（39）～32%（43）～41.2%（52）～57.5%（60）
程序4：10%（0）～18%（23）～20.5%（26）～24.2%（39）～28%（43）～30%（49）～62.4%（60）
程序5：10%（0）～12%（10）～14.4%（15）～20.5%（26）～29.5%（45）～35%（56）～65.8%（60）
程序6：10%（0）～12%（10）～16%（15）～24.2%（26）～30%（45）～38.5%（53）～65.8%（60）
根据色谱图的分离效果进行比较，程序6：10%（0）～12%（10）～16%（15）～24.2%（26）～30%（45）～38.5%（53）～65.8%（60）进行梯度洗脱，色谱峰检测比较全面，基线平稳，峰形对称，分离度较好，峰面积较大，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于指纹图谱的分析，确定为最终洗脱程序。
3)检测波长的选择：采用光电二极管阵列检测器(PDAD)在190～400nm扫描的各波长下的色谱图进行比较分析，结果表明：203nm处检测的色谱图不仅基线平稳，色谱峰较多，信息量大，各色谱峰的分离效果较好，峰面积也较大。因此，选203nm作为检测波长。同时考察了其他波长下的色谱图，其结果显示参枝苓口服液在不同波长下的色谱指纹图谱具有较好的相似度。
4)分析时间的选择：在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了1.5h的色谱图。结果表明55min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择60min作为分析时间。
5)柱温的选择：试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对指纹图谱检测结果的影响。结果显示柱温为30℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为30℃。
6)流速的选择：试验了四个流速(0.6ml/min,0.8ml/min,1.0ml/min和1.2ml/min)对指纹图谱检测结果的影响。结果表明：流速为1.0ml/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为1.0ml/min。
如前所述参枝苓口服液指纹图谱构建方法得到的参枝苓口服液标准指纹图谱（见图1），该指纹图谱中的共有峰为13个。
通过比对各药材的指纹图谱，可进行各特征峰的归属，其中归属于党参的共有峰为（2）号峰；归属于桂枝的共有峰为（10）号峰；归属于白芍的共有峰为（8）、（9）2个峰；归属于甘草的共有峰为（11）、（13）2个峰；归属于茯苓的共有峰为（3）、（4）2个峰；归属于干姜的共有峰为（1）号峰；归属于远志的共有峰为（5）、（6）2个峰；归属于石菖蒲的共有峰为（7）、（12）号峰。 可见，参枝苓口服液组成药材除龙骨和牡蛎外的主要成分均在本发明得到的指纹图谱中得到了整体表征（龙骨和牡蛎的有效成为为钙、磷等无机盐类，无紫外吸收，故本研究不做涉及）。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用乙腈-冰乙酸水溶液系统，采用梯度洗脱的方法建立了参枝苓口服液的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大。
(2)指纹图谱要充分反映化学成分的信息，因此，本发明选择在203nm波长处进行测定，其出峰较多，各个峰吸收值良好，基线平稳，反映的信息更为完全，参枝苓口服液组成药材除龙骨和牡蛎外的主要成分均在本发明得到的指纹图谱中得到了整体表征，克服了现有技术只涉及桂枝、芍药两种原药材的缺陷。
(3)本发明采用参枝苓口服液的指纹图谱作为参枝苓口服液的质量控制手段，既避免了因只测定一、两个化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学评价参枝苓口服液的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
附图说明
图1为参枝苓口服液标准指纹图谱；
图2为15批次参枝苓口服液HPLC指纹图谱及对照指纹图谱；
图3为参枝苓口服液指纹图谱各成分峰归属图谱。
该图中字母分别代表：a党参；b干姜；c远志；d白芍；e甘草；f桂枝；g石菖蒲；h茯苓
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1、测定方法及方法学验证
本发明的的测定方法包括以下步骤：
（1）制备供试品溶液，
（2）制备对照品溶液，
（3）取上述溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图，
（4）比较上述溶液的色谱图，即可。
其中，步骤（1）供试品溶液的制备：取15批参枝苓口服液，每批精密量取1.0ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取15min，恢复至室温，用水饱和正丁醇萃取，萃取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液回收正丁醇，转移至10ml容量瓶中加甲醇定容，即得供试品溶液。
步骤(2)中，对照品溶液的制备方法为：
精密称取党参炔苷标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的对照品溶液；
精密称取肉桂酸标准品1.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.125mg/mL的对照品溶液；
精密称取芍药苷标准品1.58mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.158mg/mL的对照品溶液；
精密称取甘草酸铵标准品3.22mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.322mg/mL的对照品溶液；
精密称取茯苓酸标准品5.82mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.582mg/mL的对照品溶液；
精密称取姜辣素标准品1.48mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.148mg/mL的对照品溶液；
精密称取远志总糖酯标准品4.61mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.461mg/mL的对照品溶液；
精密称取β-细辛醚标准品2.75mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.275mg/mL的对照品溶液。
其中，步骤（3）高效液相色谱条件：
色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％冰乙酸水溶液(体积分数)；梯度洗脱；流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为203nm。
梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-10min，流动相A10%～12%，流动相B 90％-88％；
10-15min，流动相A12%～16%,流动相B 88％-84％；
15-26min，流动相A16%～24.2%,流动相B84％-75.8％；
26-45min，流动相A24.2%～30%,流动相B 75.8％-70％；
45-53min，流动相A30%～38.5%,流动相B 70％-61.5％；
53-60min，流动相A38.5%～65.8%,流动相B 61.5％-34.2％。
其中，步骤（4）将供试品溶液的指纹图谱和对照品溶液的指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
方法学考察
1、精密度实验
取同一批次（批号：170345）的参枝苓口服液，按供试品溶液的制备方法处理后,连续进样分析6次，记录指纹图谱，结果见表1、表2：
表1：精密度实验共有峰相对保留时间
结论：结果显示，各共有峰的相对保留时间相对标准偏差为0.02%-0.11%，相对峰面积的相对标准偏差为0.10%-5.01%，表明本方法精密度良好。
2、重现性实验
取同一批次（批号：170345）的参枝苓口服液，分取5份，按供试品溶液的制备方法处理后,分别进样分析，记录指纹图谱，结果见表3、表4：
表3：重现性实验共有峰相对保留时间
表4：重现性实验共有峰相对峰面积
结论：结果显示各共有峰的相对保留时间相对标准偏差为0.12%-0.35%，相对峰面积的相对标准偏差为0.10%-1.98%，表明方法的重现性较好。
3、供试品溶液的稳定性实验
取同一批次（批号：170345）的参枝苓口服液，按供试品溶液的制备方法处理后,分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样分析，记录指纹图谱，结果如表5、表6：
表5：稳定性实验共有峰相对保留时间
表6：稳定性实验共有峰相对峰面积
结论：结果显示各共有峰的相对保留时间相对标准偏差为0.06%-0.68%，相对峰面积的相对标准偏差为0.53%-2.13%，表明参枝苓口服液溶液在24h内稳定。
4、成品与各原料药材的相关性及特征峰归属
4.1供试品溶液的制备：取各药材粉碎至细粉过60目筛，取约1.0g，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取15min，恢复至室温，用水饱和正丁醇萃取，萃取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液回收正丁醇，转移至10ml容量瓶中加甲醇定容，即得；
4.2各原药材HPLC指纹图谱测定：分别精密吸取各原药材溶液10μl，进样，用高效液相色谱仪测定，见附图3。
所述参枝苓口服液HPLC指纹图谱的共有峰为（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）、（8）、（9）、（10）、（11）、（12）、（13）13个峰；其中，归属于党参的共有峰为（2）号峰；归属于桂枝的共有峰为（10）号峰；归属于白芍的共有峰为（8）、（9）2个峰；归属于甘草的共有峰为（11）、（13）2个峰；归属于茯苓的共有峰为（3）、（4）2个峰；归属于干姜的共有峰为（1）号峰；归属于远志的共有峰为（5）、（6）2个峰；归属于石菖蒲的共有峰为（7）、（12）号峰。
5、批间相似度评价
取15批不同批号的参枝苓口服液，按供试品溶液制备项下方法制备，分别进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件进行数据处理：以15批供试品溶液指纹图谱作为样品集，经软件系统生成对照图谱，以此为基准，计算样本图谱与对照图谱的相似度，评价批次间稳定性，结果显示15批样品的相似度良好，均在0.8以上，见表7，附图2。
表7批间相似度结果
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | S11 | S12 | S13 | S14 | S15 | 对照指纹图谱 | |
| S1 | 1.000 | 0.996 | 0.809 | 0.889 | 0.869 | 0.869 | 0.870 | 0.869 | 0.993 | 0.996 | 0.999 | 0.942 | 0.873 | 0.852 | 0.979 | 0.922 |
| S2 | 0.996 | 1.000 | 0.824 | 0.808 | 0.879 | 0.879 | 0.878 | 0.877 | 0.996 | 0.989 | 0.995 | 0.955 | 0.886 | 0.861 | 0.975 | 0.930 |
| S3 | 0.809 | 0.824 | 1.000 | 0.990 | 0.970 | 0.971 | 0.963 | 0.961 | 0.819 | 0.899 | 0.804 | 0.896 | 0.987 | 0.952 | 0.888 | 0.967 |
| S4 | 0.889 | 0.808 | 0.990 | 1.000 | 0.981 | 0.982 | 0.973 | 0.973 | 0.803 | 0.880 | 0.885 | 0.902 | 0.979 | 0.962 | 0.869 | 0.963 |
| S5 | 0.869 | 0.879 | 0.970 | 0.981 | 1.000 | 0.999 | 0.994 | 0.993 | 0.876 | 0.865 | 0.867 | 0.835 | 0.952 | 0.979 | 0.850 | 0.988 |
| S6 | 0.869 | 0.879 | 0.971 | 0.982 | 0.999 | 1.000 | 0.994 | 0.993 | 0.877 | 0.865 | 0.867 | 0.837 | 0.954 | 0.980 | 0.850 | 0.989 |
| S7 | 0.870 | 0.878 | 0.963 | 0.973 | 0.994 | 0.994 | 1.000 | 1.000 | 0.875 | 0.866 | 0.868 | 0.815 | 0.945 | 0.974 | 0.851 | 0.984 |
| S8 | 0.869 | 0.877 | 0.961 | 0.973 | 0.993 | 0.993 | 1.000 | 1.000 | 0.875 | 0.865 | 0.867 | 0.813 | 0.944 | 0.973 | 0.850 | 0.983 |
| S9 | 0.993 | 0.996 | 0.819 | 0.803 | 0.876 | 0.877 | 0.875 | 0.875 | 1.000 | 0.994 | 0.993 | 0.850 | 0.881 | 0.859 | 0.973 | 0.927 |
| S10 | 0.996 | 0.989 | 0.899 | 0.880 | 0.865 | 0.865 | 0.866 | 0.865 | 0.994 | 1.000 | 0.997 | 0.833 | 0.864 | 0.848 | 0.977 | 0.917 |
| S11 | 0.999 | 0.995 | 0.804 | 0.885 | 0.867 | 0.867 | 0.868 | 0.867 | 0.993 | 0.997 | 1.000 | 0.836 | 0.867 | 0.850 | 0.980 | 0.920 |
| S12 | 0.942 | 0.955 | 0.896 | 0.902 | 0.835 | 0.837 | 0.815 | 0.813 | 0.850 | 0.833 | 0.836 | 1.000 | 0.916 | 0.820 | 0.819 | 0.806 |
| S13 | 0.873 | 0.886 | 0.987 | 0.979 | 0.952 | 0.954 | 0.945 | 0.944 | 0.881 | 0.864 | 0.867 | 0.916 | 1.000 | 0.935 | 0.850 | 0.948 |
| S14 | 0.852 | 0.861 | 0.952 | 0.962 | 0.979 | 0.980 | 0.974 | 0.973 | 0.859 | 0.848 | 0.850 | 0.820 | 0.935 | 1.000 | 0.895 | 0.945 |
| S15 | 0.979 | 0.975 | 0.888 | 0.869 | 0.850 | 0.850 | 0.851 | 0.850 | 0.973 | 0.977 | 0.983 | 0.819 | 0.850 | 0.895 | 1.000 | 0.883 |
| 对照指纹图谱 | 0.922 | 0.930 | 0.967 | 0.963 | 0.988 | 0.989 | 0.984 | 0.983 | 0.927 | 0.917 | 0.920 | 0.806 | 0.948 | 0.945 | 0.883 | 1.000 |
Claims (3)
1.一种参枝苓口服液指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取参枝苓口服液，加入甲醇，超声提取，用水饱和正丁醇萃取，萃取液过滤，取续滤液回收正丁醇，加甲醇定容即得供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取减压干燥至恒重的党参炔苷、肉桂酸、芍药苷、甘草酸铵、茯苓酸、姜辣素、远志总糖酯、β-细辛醚对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图；
其中，色谱条件为：色谱柱为PHENOMENEX LUNA C-18色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％冰乙酸水溶液；梯度洗脱；流动相流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为203nm；
其中，梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的变化为：
0-10min，流动相A10％～12％，流动相B 90％-88％；
10-15min，流动相A12％～16％,流动相B 88％-84％；
15-26min，流动相A16％～24.2％,流动相B84％-75.8％；
26-45min，流动相A24.2％～30％,流动相B 75.8％-70％；
45-53min，流动相A30％～38.5％,流动相B 70％-61.5％；
53-60min，流动相A38.5％～65.8％,流动相B 61.5％-34.2％；
(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得参枝苓口服液指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：精密量取1.0ml参枝苓口服液于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声提取15min，恢复至室温，用水饱和正丁醇萃取，萃取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液回收正丁醇，转移至10ml容量瓶中加甲醇定容，即得供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，对照品溶液的制备方法为：精密称取党参炔苷标准品3.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.325mg/mL的对照品溶液；
精密称取肉桂酸标准品1.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.125mg/mL的对照品溶液；
精密称取芍药苷标准品1.58mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.158mg/mL的对照品溶液；
精密称取甘草酸铵标准品3.22mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.322mg/mL的对照品溶液；
精密称取茯苓酸标准品5.82mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.582mg/mL的对照品溶液；
精密称取姜辣素标准品1.48mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.148mg/mL的对照品溶液；
精密称取远志总糖酯标准品4.61mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.461mg/mL的对照品溶液；
精密称取β-细辛醚标准品2.75mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为0.275mg/mL的对照品溶液。
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