CN114720568A - 一种太子参药材的指纹图谱建立方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种太子参药材的指纹图谱建立方法及其应用,所述方法采用高效液相色谱法,所述高效液相色谱法的条件包括:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以水为流动相B形成混合流动相,按照0至55min内混合流动相中的流动相A与流动相B的体积比从5:95变化至90:10的梯度进行洗脱;检测波长为203nm。另一方面,本发明还提供了一种太子参药材有效成分的检测方法。本发明还提供了太子参药材的HPLC标准指纹图谱。本发明建立了同时测定太子参中多种成分的测定方法,样品前处理简单,色谱条件针对多种类型化合物,且完成了8种化合物鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及一种太子参药材的指纹图谱建立方法,还涉及由所述指纹图谱建立方法获得的标准指纹图谱及它们在太子参药材的有效成分检测和质量控制方面中的应用。
背景技术
中药指纹图谱是指某种中药材或其原料药、制剂所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱图或光谱图。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有十分明确的情况下,指纹图谱的建立对于有效控制中药材及其原料药、制剂的质量具有重要的意义。
太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Paxet Hoffm.的干燥块根,分布于辽宁、内蒙古、河北、陕西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、河南、湖北、湖南、四川等地。其具有益气健脾,生津润肺之功效,常用于脾虚体倦,食欲不振,病后虚弱,气阴不足,自汗日渴,肺燥干咳。
目前,有关太子参药材的指纹图谱的研究已有报道。例如专利申请“一种太子参提取物的制备方法及其制备的太子参提取物和检测方法”(201811382057.7)建立了如下的太子参提取物的质控方法:a.基于苯酚硫酸法的太子参多糖UV含量测定方法;b.基于香草醛冰醋酸高氯酸法的皂苷UV含量测定方法;c.基于HPLC的太子参环肽含量测定方法。专利申请“一种太子参药材与太子参标准汤剂的UPLC特征图谱构建方法和鉴别方法”(201910914035.9)建立了采用乙醇超声提取、C18色谱柱、乙腈-磷酸水溶液体系、200-250nm和180-240nm变波检测的方法。但是,该专利申请中并未公开标准特征图谱,未指认图谱峰,未鉴定化合物成分。易智彪等在《太子参HPLC指纹图谱研究》中报道了采用乙酸乙酯超声提取、聚酰胺柱层析、梯度乙醇洗脱进行样品前处理、C18色谱柱、乙腈-水系统梯度洗脱和203nm波长检测的方法,识别35个共有峰,选择20个共有峰作为质控项。该方法在较快时间内达到较高有机相比例,但是该方法未进行化合物峰鉴定。廖芳平等在《柘荣太子参HPLC指纹图谱的研究》中报道了采用乙醚脱脂、甲醇回流提取、大孔吸附树脂层析、90%乙醇洗脱进行样品前处理、C18色谱柱、乙腈-水体系梯度洗脱和203nm检测波长的分析方法。该方法适用于中等极性到小极性成分的分离检测。
显然,上述研究仅提供了某些或者某几种特定成分的特征指纹峰,在对太子参药材的基础物质的认识上存在一定缺陷,并且对供试品的前处理复杂,以致其应用范围受到限制,不能在太子参原料药及制剂生产过程中很好地进行工艺和质量控制。
所以,基于现有技术的不足之处,还需要建立一种能够更好地进行质量控制的太子参药材的指纹图谱检测方法,以解决太子参药材没有前瞻性的全面检测有效成分的方法的问题。
发明内容
因此,本发明的目的是针对目前太子参药材的指纹图谱中特征指纹峰指认率很低,不能很好地实现太子参药材的工艺和质量控制的不足,提供一种能全面表征太子参药材质量的指纹图谱的建立方法并鉴定其中的化合物峰,其可以用于全面检测太子参药材的有效成分。本发明还提供了太子参药材的标准指纹图谱并鉴定了其中的化学成分,从而实现从太子参药材到太子参药材原料药及制剂的工艺、质量全过程监控,便于对太子参药材、太子参原料药和制剂的基础物质进行确认、生产工艺和质量优劣作出评价,并为后续的工艺改进和完善提供标准指征。
针对上述目的,本发明的技术方案如下:
一方面,本发明提供了一种太子参药材的指纹图谱建立方法,其采用高效液相色谱法,所述高效液相色谱法的条件包括:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以水为流动相B形成混合流动相,按照0至55min内混合流动相中的流动相A与流动相B的体积比从5:95变化至90:10的梯度进行洗脱;检测波长为203nm。
根据本发明所述的指纹图谱建立方法,优选地,所述梯度如下所示:
根据本发明所述的指纹图谱建立方法,优选地,所述混合流动相的流速为1mL/min。
根据本发明所述的指纹图谱建立方法,优选地,所述高效液相色谱法的条件还包括:柱温为20-40℃,更优选地,柱温为25℃;优选地,进样量为10μL。
根据本发明的一个实施方案,所述指纹图谱建立方法包括如下步骤:
(1)对照品溶液的制备:取太子参环肽B对照品,加甲醇制成对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:取太子参药材,加甲醇,超声处理,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(3)测定方法:分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液,注入高效液相色谱仪,按照所述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱。
优选地,根据本发明所述的指纹图谱建立方法包括如下步骤:
(1)对照品溶液的制备:取太子参环肽B对照品,加甲醇制成每1mL含0.02mg太子参环肽B的对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:取太子参药材0.5g,加入甲醇10mL,超声处理10-60分钟,例如30分钟,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(3)测定方法:分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液,注入高效液相色谱仪,按照所述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱。
根据本发明的一个具体实施方案,所述指纹图谱建立方法包括如下步骤:
1.对照品溶液制备:精密称取太子参环肽B对照品1.00mg于50mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,滤过(0.45μm滤膜),即得;
2.供试品溶液制备:取太子参药材,粉碎(过60目筛),称取粉末0.5g,加甲醇10mL,称重,超声处理30min,取出,用甲醇补重,滤过(0.45μm滤膜),取续滤液,即得;
3.测定方法:分别精密取吸取步骤(1)制备的对照品溶液和步骤(2)制备的供试品溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,按照以下高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱:
YMC-Triart C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,日本YMC公司);以乙腈(A)﹣水(B)为混合流动相,洗脱梯度见下表;流速为1mL/min;检测波长为203nm;柱温为25℃。
优选地,根据本发明所述的指纹图谱建立方法还包括按照所述高效液相色谱法的条件获得多个太子参药材样品的高效液相图谱,通过选取高效液相图谱中的参照峰,对其中共有色谱峰的保留时间进行校对和匹配,计算相似度,生成共有峰模式图谱。
另一方面,本发明还提供了一种太子参药材有效成分的检测方法,其包括:采用所述太子参药材指纹图谱建立方法获得高效液相指纹图谱,按照所述高效液相色谱法的条件获得太子参药材待测样品的高效液相图谱,以及将两者进行比较。
优选地,所述太子参药材有效成分的检测方法还包括采用质谱法鉴定太子参药材待测样品的成分。
本发明提供的太子参药材指纹图谱的特征在于所述指纹图谱为HPLC标准指纹图谱,其按照所述高效液相色谱法对太子参药材供试品溶液进行分析比较,得到由样品共有特征峰构成的太子参药材标准指纹图谱。所述指纹图谱可以通过将不同批次太子参药材HPLC图谱导入相关软件,例如“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”中进行对照。可以通过选取参照峰,对共有峰的保留时间进行校对和匹配,计算相似度,采用“中位数法”生成共有模式图谱。
本发明提供的太子参药材指纹图谱至少包括12个共有特征峰,其中5号峰:Pseudostellarin A;6号峰:Pseudostellarin B;7号峰:太子参环肽B;8号峰:Pseudostellarin C;9号峰:Pseudostellarin D;10号峰:太子参环肽A;11号峰:Pseudostellarin G;12号峰:Pseudostellarin E。这12个共有特征峰相对于参照峰太子参环肽B峰的相对保留时间范围分别为:0.505、0.675~0.678、0.709、0.739、0.789~0.790、0.941、1.000、1.067、1.217~1.221、1.956~1.957、2.030、2.146~2.147。
上述12个共有特征峰的各峰面积占总峰面积的百分比范围分别为:1.01~3.70、3.72~9.03、4.37~10.2、3.56~4.88、9.52~16.4、0.79~17.8、1.03~12.0、0.75~3.19、2.48~8.74、1.93~2.54、12.6~15.1、2.29~2.35。
所述指纹图谱包括12个指纹峰,其相对于参照峰太子参环肽B峰(7)的相对保留时间(RRt,单峰与太子参环肽B峰保留时间之比值)范围和相对峰面积分别如下表所示:
其中,6:Pseudostellarin B;7:太子参环肽B;8:Pseudostellarin C;9:Pseudostellarin E。
所述指纹图谱包括12个指纹峰,其中各峰面积占总峰面积的百分比如下表所示
其中,6:Pseudostellarin B;7:太子参环肽B;8:Pseudostellarin C;9-Pseudostellarin E。
本发明提供的太子参药材指纹图谱和化学成分可应用在太子参药材的质量控制中。
在通过上述方法得到太子参药材指纹图谱之后,按照相同条件制备供试品图谱。评价标准为:1.指纹图谱对照:(1)供试品图谱与对照指纹图谱经相似度计算,相似度不得低于0.9;(2)供试品图谱中应有12个指纹峰,与对照品相应的峰7为S峰,计算各指纹峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内;(3)供试品图谱与指纹图谱比较,非共有峰总面积不得大于总峰面积的20%。2.特征图谱对照:特征图谱制备方法同指纹图谱。供试品特征图谱中应有12个特征峰,与对照品相应的峰7为S峰,计算各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内。计算峰1~峰12各峰面积占总峰面积的百分比,其百分比应在规定范围之内,规定范围为(%):80%。
本发明的建立了同时测定太子参中多种成分的测定方法,样品前处理简单,色谱条件针对多种类型化合物,且完成对8种化合物的鉴定。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为根据本发明的实施例1的样品溶剂空白实验的HPLC色谱图。
图2为根据本发明的实施例1的样品测定时间的确定结果的HPLC色谱图。
图3为根据本发明的实施例1的太子参药材的HPLC色谱图,其中R为对照品溶液;S1-S3为样品编号。其中,6:Pseudostellarin B;7:太子参环肽B;8:Pseudostellarin C;9:Pseudostellarin E。
图4显示了根据本发明的实施例1的太子参药材的HPLC图谱及共有峰模式图谱R的生成,其中S1-S3:样品编号(见表1);R:共有峰模式图谱;其中1~12为共有峰;6:Pseudostellarin B;7:太子参环肽B;8:Pseudostellarin C;9:Pseudostellarin E。
图5为实施例2中使用本发明的方法检测不同品质的太子参药材的HPLC色谱图,太子参新货的HPLC色谱图为S4、太子参陈货的HPLC色谱图为S5、水提取过太子参的药渣的HPLC色谱图为S6、掺杂水提取过药渣的太子参的HPLC色谱图为S7,掺杂麦冬的太子参的HPLC色谱图为S8。
图6为对比例1的不同太子参药材的HPLC色谱图,其中太子参新货的HPLC色谱图为S9、太子参陈货的HPLC色谱图为S10、水提取过太子参的药渣的HPLC色谱图为S11、掺杂水提取过药渣的太子参的HPLC色谱图为S12,掺杂麦冬的太子参的HPLC色谱图为S13。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述,根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而,本领域技术人员应容易理解的是,以下实施例只是描述性的,不意味着将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该意识到,本发明涵盖了权利要求书范围内可能包括的所有改进方案、备选方案和等效方案。
实施例1太子参药材标准指纹图谱的建立
一、仪器、试药与样品
Agilent Technologies 1260分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);KH-500DE数控超声波清洗器(中国昆山市-禾创公司);XS105型十万分之一分析天平(瑞士梅特勒公司);AL104型万分之一分析天平(瑞士梅特勒公司)。
对照品:太子参环肽B(heterophyllin B,批号8110741,纯度99%),购于成都普瑞法科技开发有限公司;
乙腈为色谱纯(德国默克公司),水为娃哈哈纯净水,其余试剂均为分析纯。太子参药材样品信息如表1所示。
表1太子参药材样品信息
二、实验方法:
1.供试品溶液制备
取太子参样品药材,粉碎(过60目筛)。称取粉末0.5g,加甲醇10mL,称重,超声处理30min,取出,用甲醇补重,滤过(0.45μm滤膜),取续滤液即得。
2.对照品溶液制备
精密称取太子参环肽B对照品1.00mg于50mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,滤过(0.45μm滤膜),即得。
3.色谱条件
采用YMC-Triart C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,日本YMC公司),以乙腈-水为混合流动相,梯度洗脱(表2),检测波长203nm,柱温25℃,流动相流速1.0mL/min,进样量10μL,理论塔板数按太子参环肽B峰计算应不低于5000。
表2梯度洗脱条件
4.方法学考察
(1)空白试验
精密吸取甲醇10μL,注入高效液相色谱仪,按色谱条件进行测定,结果如图1所示,表明样品溶剂对测定结果无干扰。
(2)测定时间的确定
精密吸取供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,按色谱条件进行测定,55min后,继续保持90%乙腈洗脱30min。结果如图2所示,保留时间55min后无色谱峰,故将时间确定为55min。
(3)精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10μL,连续进样6次,测定指纹图谱,以太子参环肽B(峰7)为参照峰,计算占总峰面积2%以上各主要峰(图3)的相对保留时间(各峰与太子参环肽B保留时间之比)和相对峰面积(各峰与太子参环肽B峰面积之比),结果如表3所示。各主要峰相对保留时间的RSD在0.016%~0.162%之间,相对峰面积的RSD在0.749%~2.746%,说明仪器精密度良好。
表3精密度实验结果
(4)稳定性试验
取同一供试品溶液10μL,分别在0、6、12、24、48h进样,测定指纹图谱,以太子参环肽B为参照峰,计算占总峰面积2%以上各主要峰(如图3所示)的相对保留时间和相对峰面积,结果如表4所示。各主要峰相对保留时间的RSD在0.048%~0.966%,相对峰面积的RSD在0.893%~2.800%,表明供试品溶液在48h内稳定。
表4稳定性实验结果
(5)重复性试验
精密称取同一样品5份,分别制备成供试品溶液,测定指纹图谱,以太子参环肽B为参照峰,计算占总峰面积2%以上各主要峰(图3)的相对保留时间和相对峰面积,结果如表5所示。各主要峰相对保留时间的RSD在0.012%~0.773%,相对峰面积的RSD在1.154%~2.833%,均小于3%,表明该方法重复性良好。
表5重复性实验结果
5.太子参药材HPLC指纹图谱的建立与分析
(1)指纹图谱的建立
如上所述,制备太子参药材对照品溶液和供试品溶液,按照色谱条件进行测定,记录色谱图。从图3可知,太子参环肽B(峰7,保留时间为24.54min)的色谱峰分离良好,且为共有峰,故将太子参环肽B选作为参照峰。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版),对太子参药材的指纹图谱进行考察,共有12个占总峰面积2%以上的共有峰,指认其中4个为特征峰,为pseudostellarin B(峰6)、太子参环肽B(峰7)、pseudostellarin C(峰8)和pseudostellarin E(峰9),其中峰6、峰8和峰9经LC/MS鉴定。
(2)指纹图谱的相似度分析
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版),将三批次太子参药材HPLC图谱导入软件,进行保留时间校对和相似度计算(图4,表6)。通过比较发现,太子参样品S1和S2的相似度是0.985,而S3和S1、S2的相似度是0.593、0.645,说明S1和S2质量一致性好,S3和S1、S2的质量存在较大差异。从本实验结果来看,贵州和江苏(S3)产的太子参中太子参环肽B(峰7)含量较高,而贵州(S1)产的峰7很小,但峰6含量很高。
表6.太子参药材HPLC指纹图谱的相似度
(3)指纹图谱相对保留时间和峰面积比值的分析
对太子参药材中的12个共有峰,以峰7(太子参环肽B)为参照峰,分别求出各共有峰与参照峰的相对保留时间(单峰保留时间/参照峰保留时间)和相对峰面积(单峰峰面积/参照峰峰面积)(表7)。
表7太子参药材共有峰的相对保留时间和相对峰面积
其中,6:Pseudostellarin B;7:太子参环肽B;8:Pseudostellarin C;9:Pseudostellarin E。
(4)共有指纹峰峰面积占比分析
分别对太子参药材中的12个共有峰计算了HPLC图谱中各峰面积占总峰面积的百分比(表8)。
表8共有指纹峰峰面积占比分析
其中,6:Pseudostellarin B;7:太子参环肽B;8:Pseudostellarin C;9:Pseudostellarin E。
6.结果讨论
从三批次太子参药材的相似度评价结果来看,在采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)得到的相似度评价结果中,太子参样品S1和S2的相似度是0.985,可能都是产于贵州的;而产于江苏的S3与S1、S2的相似度仅为0.593、0.645,说明质量差异很大。从相对保留时间和相对峰面积来看,三批次太子参药材的12个共有峰的相对保留时间的RSD在0.004%~0.240%,说明各峰的相对保留时间稳定,可以用来标定各峰的位置,即只要有太子参环肽B对照品,就可采用该方法对太子参药材质量的一致性或稳定性进行评价。
从三批次药材12个共有峰的相对峰面积来看,其RSD均在64%以上,说明药材质量差异很大。从药材共有峰和非共有峰占总峰面积的比值来看,三批次太子参药材的共有峰面积占比分别是77.1%、80.8%、70.3%;其中,4个特征峰的峰面积占比差异很大,峰6(pseudostellarin B)在S1、S2中峰面积占比为17.8%、15.7%,而在S3中为0.79%;峰7(太子参环肽B)在S1、S2中峰面积占比为1.37%、1.03%,而在S3中为12.0%;峰8(pseudostellarin C)和峰9(pseudostellarin E)在S1、S2中峰面积占比远大于S3中的,这反映了太子参S1、S2与S3存在很大差异,同时也说明该方法可以很好地反映太子参药材的质量一致性或差异。
实施例2使用本发明的方法检测不同品质的太子参药材
除色谱柱更换为Agilent EC-C18(4.6mm×250mm,5μm),其余色谱条件同实施例1。
对照品溶液的制备:同实施例1。
供试品选择了太子参新货、太子参陈货、水提取过太子参的药渣、掺杂水提取过药渣的太子参、掺杂麦冬的太子参。其中,掺杂水提取过药渣的太子参药渣占总质量的30%,被掺杂的太子参和用来提取制备药渣的太子参均为同一批新货太子参;
掺杂麦冬的太子参中麦冬占总质量的20%;
太子参陈货为2017年1月份采购留样;
太子参新货为2020年11月采购。
供试品溶液的制备:分别取太子参新货、太子参陈货、水提取过太子参的药渣、掺杂水提取过药渣的太子参、掺杂麦冬的太子参,粉碎(过60目筛)。分别称取粉末0.5g,加甲醇10mL,称重,超声处理30min,取出,用甲醇补重,滤过(0.45μm滤膜),取续滤液即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得,同实施例1。
实验结果:见图5,其中太子参新货的HPLC色谱图为S4、太子参陈货的HPLC色谱图为S5、水提取过太子参的药渣的HPLC色谱图为S6、掺杂水提取过药渣的太子参的HPLC色谱图为S7,掺杂麦冬的太子参的HPLC色谱图为S8。
实验结果:由图5可见,太子参新货及陈货均表征出12个特征峰,但太子参新货中11号特征峰峰面积显著高于太子参陈货,水提取过太子参药渣缺失2、3、4、6号特征峰,掺杂水提取过药渣的太子参的2、3、4、6号特征峰峰面积与7号峰峰面积的比例和太子参新货以上特征峰峰面积比例不符,掺杂麦冬的太子参在2至7号峰处检出未知色谱峰。
由此可见,根据本发明的方法具有较好的分离效果,本发明提供的太子参指纹图谱基线平稳,色谱峰数量多,不同极性段的化合物均得到较好的体现。并且,根据本发明的方法和本发明的指纹图谱对于不同品质的太子参和掺假的太子参药材实现了较好鉴定效果,更易于实现太子参药材中各种复杂组分的表征。
对比例1使用现有技术的方法检测不同品质的太子参药材
参照易智彪等在《太子参HPLC指纹图谱研究》报道的方法,其具体方法如下所示:
色谱条件:采用Agilent EC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),柱温25℃,乙腈作为A相,水作为B相,梯度洗脱,流速1ml/min,检测波长为203nm。
洗脱梯度如表9所示:
表9洗脱梯度
供试品选择了太子参新货、太子参陈货、水提取过太子参的药渣、掺杂水提取过药渣的太子参、掺杂麦冬的太子参。其中,掺杂水提取过药渣的太子参药渣占总质量的30%,被掺杂的太子参和用来提取制备药渣的太子参均为同一批新货太子参;
掺杂麦冬的太子参中麦冬占总质量的20%;
太子参陈货为2017年1月份采购留样;
太子参新货为2020年11月采购。
供试品溶液的制备:
分别取太子参新货、太子参陈货、水提取过太子参药渣、掺杂水提取过药渣的太子参、掺杂麦冬的太子参,加乙酸乙酯30mL,300W超声提取40min,放冷,滤过,滤渣加乙酸乙酯30mL分3次洗涤,合并滤液及洗液,60℃蒸至近干,加0.3g聚酰胺(60~80目)拌匀,加至1g聚酰胺柱(1.5cm滤液及洗液)上,分别用50mL水、50mL 30%乙醇,50mL 80%乙醇洗脱,收集80%乙醇的洗脱液,蒸干,甲醇溶解并定容于2mL量瓶中。临用前过0.45m微孔滤膜,作为供试品。
测定法:精密吸取供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
实验结果:见图6,其中太子参新货的HPLC色谱图为S9、太子参陈货的HPLC色谱图为S10、水提取过太子参的药渣的HPLC色谱图为S11、掺杂水提取过药渣的太子参的HPLC色谱图为S12,掺杂麦冬的太子参的HPLC色谱图为S13。
由此可见,该方案因为前处理采用了柱层析方法,对太子参药材成分存在高度的选择性,对于不同品质、掺假太子参均获得相似度较高的图谱,反而不能较好的区分太子参药材的内在质量。实施例1相较于该方案,样品处理简单,色谱峰表征较好,不同品质太子参色谱图具有显著差异,可以较好地区分太子参掺假情况。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种太子参药材的指纹图谱建立方法,其采用高效液相色谱法,所述高效液相色谱法的条件包括:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以水为流动相B形成混合流动相,按照0至55min内混合流动相中的流动相A与流动相B的体积比从5:95变化至90:10的梯度进行梯度洗脱;检测波长为203nm。
3.根据权利要求1或2所述的指纹图谱建立方法,其中,所述混合流动相的流速为1mL/min。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的指纹图谱建立方法,其中,所述高效液相色谱的条件还包括:柱温为20-40℃;进样量为10μL;优选地,柱温为25℃。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的指纹图谱建立方法,其包括如下步骤:
(1)对照品溶液的制备:取太子参环肽B对照品,加甲醇制成对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:取太子参药材,加甲醇,超声处理,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(3)测定方法:分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液,注入高效液相色谱仪,按照所述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱;
更优选地,所述指纹图谱建立方法包括如下步骤:
(1)对照品溶液的制备:取太子参环肽B对照品,加甲醇制成每1mL含0.02mg太子参环肽B的对照品溶液;
(2)供试品溶液的制备:取太子参药材0.5g,加入甲醇10mL,超声处理10-60分钟,例如30分钟,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
(3)测定方法:分别取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液,注入高效液相色谱仪,按照上述高效液相色谱法的条件获得高效液相图谱;
优选地,所述方法还包括按照所述高效液相色谱法的条件获得多个太子参药材样品的高效液相图谱,通过选取高效液相图谱中的参照峰,对其中共有色谱峰的保留时间进行校对和匹配,计算相似度,生成共有峰模式图谱。
6.一种太子参药材有效成分的检测方法,其包括:
1)采用如根据权利要求1-5中任一项所述的太子参药材指纹图谱建立方法获得高效液相指纹图谱,按照权利要求1-5中任一项所述的高效液相色谱法的条件获得太子参药材待测样品的高效液相图谱,以及将两者进行比较;
2)采用质谱法鉴定太子参药材待测样品的成分。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的太子参药材指纹图谱建立方法建立的太子参药材指纹图谱。
8.根据权利要求7所述的太子参药材指纹图谱,其中所述太子参药材指纹图谱至少包括12个共有特征峰;其相对于参照峰太子参环肽B峰的相对保留时间范围分别为:0.505、0.675~0.678、0.709、0.739、0.789~0.790、0.941、1.000、1.067、1.217~1.221、1.956~1.957、2.030、2.146~2.147;
优选地,其中5号峰:Pseudostellarin A、6号峰:Pseudostellarin B、7号峰:太子参环肽B、8号峰:Pseudostellarin C、9号峰:Pseudostellarin D、10号峰:太子参环肽A、11号峰:Pseudostellarin G、12号峰:Pseudostellarin E;
优选地,所述12个共有特征峰的各峰面积占总峰面积的百分比范围分别为:1.01~3.70、3.72~9.03、4.37~10.2、3.56~4.88、9.52~16.4、0.79~17.8、1.03~12.0、0.75~3.19、2.48~8.74、1.93~2.54、12.6~15.1、2.29~2.35。
9.如权利要求7或8所述的太子参药材指纹图谱在太子参药材的质量控制中的用途。
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