CN104713953A - 一种药物指纹图谱的测定方法 - Google Patents
一种药物指纹图谱的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种药物指纹图谱的测定方法，该方法包括供试品溶液的制备，取药物组合物适量，溶于0%-100%的甲醇水溶液中，超声溶解，加0%-100%的甲醇水溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液；色谱条件：色谱柱为耐纯水相的十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；检测波长210～300nm；测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。该检测方法操作方便，效率高效，重复性和稳定性好，易于掌握。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物的指纹图谱的测定方法。
背景技术
中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药化学成分的光谱图或色谱图，是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。目前，美国FDA、英国和印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。此外，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。目前中药指纹图谱的建立方法主要有：光谱法，如紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)；色谱法，如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、毛细管电泳法；以及其他方法，如x射线衍射法、核磁共振法等。其中高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法等其他方法应用范围更广，是构建指纹图谱的主要方法之一。
糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾脏疾病的主要原因(Diabeticnephropathy:frommechanismstorationaltherapies.GiuntiS等.MinervaMed,2006;97(3):241-262.)。渴络欣胶囊作为中成药制剂，是第一个被SFDA正式批准用于治疗糖尿病肾病的新药，为国家“九五”攻关项目成果。渴络欣胶囊主要由黄芪、太子参、枸杞子、女贞子、水蛭、大黄等药材组成，具有益气养阴、活血化疲的功效，临床用于治疗糖尿病肾病属于气阴两虚兼夹血瘀症，症见咽干口燥、倦怠乏力、多食易饥、气短懒言、五心烦热、肢体疼痛、尿混或浑油。
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bgevarmongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气固表、利尿托毒、排脓和敛疮生肌的功效。黄芪的化学成分主要有黄酮类、皂苷类、多糖 类和氨基酸类]，目前从黄芪及其同属近缘植物中已分离出40多种皂苷，主要有黄芪皂苷I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ异黄芪皂苷I、Ⅱ、Ⅲ及大豆皂苷I等，黄芩中黄酮类化合物主要有槲皮素、山奈黄素、异鼠李素、鼠李异柠檬素、羟基异黄酮、异黄烷、芦丁、芒柄花素、毛蕊异黄酮等，多糖类成分主要有葡聚糖和杂多糖，此外还含有约25种氨基酸，如γ-氨基丁酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等（黄芪化学成分及药理作用概述,张霞,使用中医药杂志,2013,29(7),608-609)。
太子参别称异叶假繁缕、孩儿参、童参、双批七等，是石竹科繁缕亚族孩儿参属的太子参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)的块根，有生津润肺、补气益血、益气健脾之功效，临床用于脾虚肺燥、食欲不振、体乏无力、心悸自汗、病后衰弱、口渴干咳等症状。现代研究认为太子参中主要活性成分有（太子参的生物学与化学成分的研究进展,彭华胜,中草药,2008,39(3),470-473)：（1）微量元素。太子参富多种微量元素，其中以Fe、Mn、Cu、Zn等含量最高；（2）氨基酸：太子参中氨基酸组成丰富，其中含量较高的是精氨酸，天冬氨酸及谷氨酸；（3）挥发油：GC-MS法分析太子参中挥发油种类达78种，不同产地太子参中均含有吡咯、己醛、糠醛、糠醇、2-戊基呋喃、3-呋喃甲基乙酸酯、4-丁基-3-甲氧基-2，4-环己二烯-1-酮、4-丁基-3-甲氧基-2-环己烯-1-酮、2-环己烯-1-醇-苯甲酸酯、正-十六烷酸等十多种成分；（4）环肽类：太子参含多种环肽类化合物，如太子参环肽A～D(heterophyilinA-D)；（5）苷类：从太子参的正丁醇部分，经柱色谱分得尖叶丝石竹皂苷D、胡萝卜苷、△7-豆甾-3p烯醇-3-O-pD-葡萄糖苷、a-菠菜甾醇-pD-吡喃葡萄糖苷口、刺槐苷；（6）糖类：太子参除含蔗糖、麦芽糖以及a-槐糖外，还从中分得太子参多糖PHP-A和PHP-B等。
枸杞子系茄科植物枸杞（LyciumbarbarumL.）的成熟果实,作为中药药用历史悠久,中医认为其性味甘平,归肝、肾经,具有滋肝补肾、益精明目的功效,主治虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明。枸杞含有多种成分,如胡萝卜素、硫胺素、核黄素、烟酸、抗坏血酸、氨基酸、亚油酸、微量元素、莨菪亭、阿托品、甜菜碱等(枸杞子的现代研究与临床新用途,王平,中国中医基础医学杂志,2000,6(12),41-42)。
女贞子为木犀科植物女贞(FigustruratueidumA.)的干燥成熟果实,味甘苦,性平,有滋补肝肾、强腰膝、聪耳目的功能，女贞子最早见于《神农本草经》，列为上品，具 有养阴气、平肝火、补腰膝、壮筋骨、滋补肝肾、乌须发等功效，临床应用已有2000多年的历史,主治肝肾阴虚、头晕目眩、耳鸣、头发早白、腰膝酸软、老年习惯性便秘等。女贞子含有齐墩果酸、对羟基苯乙醇苷类、裂环环烯醚萜苷类，以及磷脂、多糖、挥发油、微量元素等多种化学成分（女贞子化学成分与药理作用的研究进展,靳晓明,中医药信息,2008,25(1),40-41）。
水蛭始载于《神农本草经》：“主逐恶血，瘀血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道”，其味咸、苦，性平，归肝经，具有破血通经、逐瘀消癥之功，主治血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫、跌打损伤等。2010年版《中华人民共和国药典》收载的水蛭为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全体。水蛭中主要含有两类成分：一类是以水蛭素为代表的多肽及蛋白类大分子成分；另一类是蝶啶等小分子化学成分（水蛭化学成分研究进展,刘玉梅,中国中医药信息杂志,2011,18(12),108-110）；此外，目前文献报道了一系列水蛭具有抗凝作用的多肽类成分，包括水蛭素、肝素、组织胺、氨基酸和其他多肽类物质等（中药水蛭生药学与化学成分的研究进展与展望,刘晓帆,环球中医药,2012,5(8),637-640）。
大黄史载于《神农本草经》，为我国应用最为广泛的中药材之一。2010版药典收载大黄RadixetRhizomaRhei为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄R.tanguticumMaxim.exBalf.或药用大黄R.officinaleBaill.的干燥根和根茎。大黄性味苦、寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，主要活性成分包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等游离蒽醌及其苷类,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经的功效；现代药理学研究表明大黄中活性成分具有泻下、利胆退黄、保肝、止血、抗炎、抗菌抗病毒、降压降脂、抗肿瘤等作用（大黄的主要成分及其临床药理研究进展,庄江能,西南军医,2009,11(5),931-932)。
随着中药现代化、国际化的不断发展，现代分析技术如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、X光衍射法、毛细管电泳、分子生物技术以及其他分析方法不断在中药鉴定中药质控等方面的应用，建立了一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法即指纹图谱。目前,美国FDA,英国和印度草药典，德国药用植物学会，加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法；2000年第4季度我国下发的《中药注射剂指纹图 谱研究的技术要求》率先要求中药注射剂推行指纹图谱的质控办法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成,每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。其次,这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗,体现了控制某张中药复方指纹图谱,就可确保其相应药效。而渴络欣胶囊是由黄芪、女贞子、水蛭、大黄、太子参和枸杞子组成，其治疗效果也已经得到临床印证，其中每味药材组分所含化学成分众多，如何保证药物的质量，控制其疗效，需要对它的活性物质群进行控制，因此现代手段指纹图谱的引入质控标准变得尤为重要。
发明内容
本发明提供了一种药物指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备
取药物适量，溶于0～100%的甲醇水溶液中，超声溶解，加0～100%的甲醇水溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液；
（2）色谱条件
色谱柱为耐纯水相的十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；检测波长210～300nm；
（3）测定
吸取上述供试品溶液注入液相色谱，使用高效液相色谱法进行测定，得到药物指纹图谱；
所述药物选自黄芪提取物、太子参提取物、枸杞子提取物、女贞子提取物、水蛭提取物、大黄粉末中的一种或多种的混合物。
所述步骤（2）中检测波长为210-300nm，流速为0.2ml/min，柱温为35-45℃，进样体积为1-10ul；优选检测波长为254nm，流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为4ul；所述步骤（1）中优选甲醇水溶液为20%～75%(v/v)的甲醇水溶液；进一步优选为50%(v/v)的甲醇水溶液；
所述步骤（1）中优选供试品溶液制备方法为：取药物0.45～0.55g，置于25ml量瓶中，加入50%(v/v)的甲醇水20ml，超声40min，加50%(v/v)的甲醇水至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
所述步骤（2）中优选流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，所述梯度洗脱程序为：
0-4min时，流动相A：流动相B为100:0，50min时，流动相A：流动相B为:80:20，
100min时，流动相A：流动相B为62:38，120min时，流动相A：流动相B为0:100，
123min时，流动相A：流动相B为0:100，123.1min时，流动相A：流动相B为100:0。
所述高效液相色谱仪的紫外检测器流出液直接进入质谱仪进行物质测定，其中质谱仪检测条件优选为：电喷雾电离，采用正离子模式和负离子两种模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-35V，透镜电压为-200V；全扫描质量范围：150-1000amu，二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。
本发明采用高效液相色谱法测定药物指纹图谱，所述药物为渴络欣胶囊时，其指纹图谱中含有40个指纹峰，分别是：
1号峰，保留时间RT为14.29min；2号峰，保留时间RT为15.08min；
3号峰，保留时间RT为16.84min；4号峰，保留时间RT为20.30min；
5号峰，保留时间RT为21.22min；6号峰，保留时间RT为22.20min；
7号峰，保留时间RT为25.89min；8号峰，保留时间RT为29.04min；
9号峰，保留时间RT为31.15min；10号峰，保留时间RT为34.11min；
11号峰，保留时间RT为34.84min；12号峰，保留时间RT为43.65min；
13号峰，保留时间RT为44.85min；14号峰，保留时间RT为47.06min；
15号峰，保留时间RT为47.39min；16号峰，保留时间RT为48.00min；
17号峰，保留时间RT为49.28min；18号峰，保留时间RT为50.75min；
19号峰，保留时间RT为53.42min；20号峰，保留时间RT为56.35min；
21号峰，保留时间RT为57.12min；22号峰，保留时间RT为57.42min；
23号峰，保留时间RT为59.57min；24号峰，保留时间RT为59.88min；
25号峰，保留时间RT为62.05min；26号峰，保留时间RT为65.43min；
27号峰，保留时间RT为68.63min；28号峰，保留时间RT为70.23min；
29号峰，保留时间RT为71.58min；30号峰，保留时间RT为71.98min；
31号峰，保留时间RT为73.08min；32号峰，保留时间RT为77.70min；
33号峰，保留时间RT为79.80min；34号峰，保留时间RT为80.51min；
35号峰，保留时间RT为82.13min；36号峰，保留时间RT为91.59min；
37号峰，保留时间RT为96.97min；38号峰，保留时间RT为105.47min；
39号峰，保留时间RT为109.92min；40号峰，保留时间RT为113.94min。
所述药物为黄芪提取物时，其指纹图谱中含有12个指纹峰为：
H1号峰，保留时间RT为3.56min，H2号峰，保留时间RT为3.91min，
H3号峰，保留时间RT为8.28min，H4号峰，保留时间RT为9.47min，
H5号峰，保留时间RT为12.76min，H6号峰，保留时间RT为13.42min，
H7号峰，保留时间RT为14.06min，2号峰，保留时间RT为14.99min，
6号峰，保留时间RT为22.22min，H8号峰，保留时间RT为47.18min，
27号峰，保留时间RT为68.85min，H9号峰，保留时间RT为88.81min；
所述药物为太子参提取物时，其指纹图谱中含有15个指纹峰为：
T1号峰，保留时间RT为5.28min，T2号峰，保留时间RT为9.76min，
T3号峰，保留时间RT为13.76min，1号峰，保留时间RT为14.33min，
T4号峰，保留时间RT为15.26min，T5号峰，保留时间RT为16.79min，
T6号峰，保留时间RT为19.57min，5号峰，保留时间RT为21.76min，
T7号峰，保留时间RT为34.49min，10号峰，保留时间RT为34.88min，
T8号峰，保留时间RT为41.98min，12号峰，保留时间RT为44.49min，
20号峰，保留时间RT为56.79min，T9号峰，保留时间RT为76.88min，
33号峰，保留时间RT为80.37min；
所述药物为枸杞子提取物时，其指纹图谱中含有26个指纹峰为：
G1号峰，保留时间RT为3.99min，G2号峰，保留时间RT为4.98min，
G3号峰，保留时间RT为5.76min，G4号峰，保留时间RT为9.07min，
G5号峰，保留时间RT为9.57min，G6号峰，保留时间RT为13.32min，
G7号峰，保留时间RT为13.59min，G8号峰，保留时间RT为15.12min，
G9号峰，保留时间RT为15.40min，3号峰，保留时间RT为16.95min，
G10号峰，保留时间RT为17.41min，4号峰，保留时间RT为20.48min，
7号峰，保留时间RT为26.29min，G11号峰，保留时间RT为28.15min，
G12号峰，保留时间RT为30.98min，9号峰，保留时间RT为31.41min，
G13号峰，保留时间RT为33.07min，G14号峰，保留时间RT为34.95min，
11号峰，保留时间RT为35.25min，G15号峰，保留时间RT为38.26min，
G16号峰，保留时间RT为40.84min，G17号峰，保留时间RT为43.06min，
G18号峰，保留时间RT为44.38min，13号峰，保留时间RT为45.11min，
G19号峰，保留时间RT为46.51min，16号峰，保留时间RT为48.68min，
所述药物为女贞子提取物时，其指纹图谱中含有12个指纹峰为：
11号峰，保留时间RT为35.22min，N1号峰，保留时间RT为43.67min，
18号峰，保留时间RT为51.17min，N2号峰，保留时间RT为52.13min，
19号峰，保留时间RT为53.44min，N3号峰，保留时间RT为55.49min，
25号峰，保留时间RT为62.61min，N4号峰，保留时间RT为68.39min，
28号峰，保留时间RT为70.19min，31号峰，保留时间RT为73.16min，
N5号峰，保留时间RT为74.81min，N6号峰，保留时间RT为82.98min，
所述药物为水蛭提取物时，其指纹图谱中含有16个指纹峰为：
S1号峰，保留时间RT为2.82min，S2号峰，保留时间RT为4.20min，
S3号峰，保留时间RT为4.95min，S4号峰，保留时间RT为5.41min，
S5号峰，保留时间RT为6.27min，S6号峰，保留时间RT为8.16min，
S7号峰，保留时间RT为9.94min，S8号峰，保留时间RT为13.68min，
5号峰，保留时间RT为21.18min，S9号峰，保留时间RT为24.07min，
S10号峰，保留时间RT为25.01min，8号峰，保留时间RT为29.35min，
S11号峰，保留时间RT为30.24min，11号峰，保留时间RT为35.61min，
S12号峰，保留时间RT为38.11min，S13号峰，保留时间RT为38.72min；
所述药物为大黄提取物时，其指纹图谱中含有38个指纹峰为：
D1号峰，保留时间RT为12.55min，D2号峰，保留时间RT为26.16min，
D3号峰，保留时间RT为31.15min，D4号峰，保留时间RT为39.81min，
D5号峰，保留时间RT为42.62min，13号峰，保留时间RT为45.16min，
14号峰，保留时间RT为47.35min，15号峰，保留时间RT为47.72min，
16号峰，保留时间RT为48.44min，D6号峰，保留时间RT为48.84min，
17号峰，保留时间RT为49.63min，D7号峰，保留时间RT为52.36min，
D8号峰，保留时间RT为54.40min，20号峰，保留时间RT为56.66min，
21号峰，保留时间RT为57.42min，22号峰，保留时间RT为57.69min，
23号峰，保留时间RT为59.85min，24号峰，保留时间RT为60.12min，
D9号峰，保留时间RT为61.41min，D10号峰，保留时间RT为62.98min，
26号峰，保留时间RT为65.82min，D11号峰，保留时间RT为67.20min，
D12号峰，保留时间RT为69.50min，28号峰，保留时间RT为70.61min，
D13号峰，保留时间RT为70.93min，29号峰，保留时间RT为72.03min，
30号峰，保留时间RT为72.39min，32号峰，保留时间RT为78.19min，
D14号峰，保留时间RT为79.50min，33号峰，保留时间RT为80.31min，
34号峰，保留时间RT为80.98min，35号峰，保留时间RT为82.59min，
D15号峰，保留时间RT为88.11min，36号峰，保留时间RT为92.22min，
37号峰，保留时间RT为97.59min，38号峰，保留时间RT为105.81min，
39号峰，保留时间RT为110.25min，40号峰，保留时间RT为114.24min；
通过以上渴络欣胶囊指纹图谱、黄芪提取物指纹图谱、太子参提取物指纹图谱、枸杞子提取物指纹图谱、女贞子提取物指纹图谱、水蛭提取物指纹图谱或大黄粉末指纹图谱信息可以看出：本发明检测方法得到的渴络欣胶囊指纹图谱包含了黄芪提取物指纹图谱、太子参提取物指纹图谱、枸杞子提取物指纹图谱、女贞子提取物指纹图谱、水蛭提取物指纹图谱和大黄粉末指纹图谱中的共有吸收峰，说明采用本方法检测得到的渴络欣胶囊胶囊指纹图谱可以客观反应渴络欣胶囊有效成分的含量和有无，便于全面控制产品质量。
本申请发明人通过二极管阵列检测器（DAD检测器检测）检测松龄血脉康吸收波长，获知在210-300nm处均有吸收，其中当检测波长为254nm时样品中的各个成分均有吸收且主要化合物具有较强吸收，且出峰结果稳定。
本申请发明人还考察了不同提取液对待测品的提取效果对检测结果的影响，包括H2O、20%（v/v）甲醇、50%（v/v）甲醇、75%（v/v）甲醇、和100%甲醇对提取效率的影响，结果表明：H2O、20%（v/v）甲醇、50%（v/v）甲醇、75%（v/v）甲醇、和100%甲醇对提取效率无明显区别，出峰数量一致，其检测结果均较好，但50%（v/v）甲醇的提取率较其他溶剂略有提高。
本发明优点如下：
1、本发明建立的渴络欣胶囊HPLC指纹图谱检测方法及其指纹图谱，对于其有效成分黄芪、太子参、枸杞子、女贞子、大黄、水蛭大部分药理活性物质进行了有效表征，实现了最大可能的对其化学成分进行检测。提供了一种通过整体的指纹图谱信息对渴络欣胶囊质量进行评价的方法，避免了只测定其中一、二个化学成分就对渴络欣胶囊整体质量判断的片面性，使得渴络欣胶囊质量控制更加客观和准确；
2、本发明所提供的指纹图谱检测方法对六种药材大部分有效成分的峰分离性好；
3、本发明所提供的指纹图谱检测方法所需检测时间合理，主要活性成分的峰在120分钟内出峰，并且峰强度都较大，因此使得检测效率高效；
4、本发明所提供的指纹图谱检测方法其重复性和稳定性好；
5、本发明所提供的指纹图谱检测方法避免了在流动相中使用磷酸，使其能够在经高效液相色谱检测后直接与质谱仪联用，有效确定相关物质的结构，更好的监控相关药物的质量。
附图说明
图1对照品色谱图
其中，峰1为表儿茶素，峰2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰3为芦丁，峰4为女贞子苷，峰5为特女贞苷，峰6为芦荟大黄素，峰7为大黄酸，峰8为大黄素，峰9为大黄素甲醚。
图2空白基线色谱图
图3渴络欣胶囊色谱图-梯度一（全图）
图4渴络欣胶囊色谱图-梯度二（全图）
图5渴络欣胶囊色谱图-梯度三（全图）
图6渴络欣胶囊色谱图-梯度四（全图）
图7渴络欣胶囊色谱图-梯度四（局部放大图1）
图8渴络欣胶囊色谱图-梯度四（局部放大图2）
图9渴络欣胶囊图谱-梯度四（批号110501、111001、111201、120801）
图10黄芪提取物图谱
图11太子参提取物图谱
图12枸杞子提取物图谱
图13枸杞子提取物图谱（局部放大图）
图14女贞子提取物图谱
图15水蛭提取物图谱
图16大黄粉末图谱
图17大黄粉末图谱（局部放大图）
具体实施方式
以下实施方式仅是对本发明的进一步说明，并不能作为对本发明保护范围的进一步限定。
实施例一、黄芪提取物的制备
称取黄芪加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液，真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后得到黄芪提取物。
实施例二、太子参提取物的制备
称取太子参加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液，真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后得到太子参提取物。
实施例三、枸杞子提取物的制备
称取枸杞子加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液，真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后得到枸杞子提取物。
实施例四、女贞子提取物的制备
称取女贞子加入8倍量70%酒精加热回流，提取2小时，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液；药渣加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液；将酒精及沸水两种滤液合并后真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后得到女贞子提取物。
实施例五、水蛭提取物的制备
称取水蛭加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液，真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后得到水蛭提取物。
实施例六、大黄粉末的制备
粉碎成细粉，过筛后即得；
实施例七、渴络欣胶囊的制备
大黄粉碎成细粉后，辐照后即得大黄粉末；黄芪、太子参、枸杞子、水蛭各按8倍量加入沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液，真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后分别得到黄芪、太子参、枸杞子、水蛭提取物浸膏粉；称取女贞子加入8倍量70%酒精加热回流，提取2小时，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液；药渣加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣同法再煮提2次，合并3次滤液；将酒精及沸水两种滤液合并后真空减压浓缩至适当，喷雾干燥后得到女贞子提取物浸膏粉。按适当比例将以上六种粉末混匀，加入适量辅料再混匀后装入胶囊，即得。
实施例八、黄芪提取物指纹图谱/太子参提取物指纹图谱/枸杞子提取物指纹图谱/女贞子提取物指纹图谱/水蛭提取物指纹图谱和大黄粉末指纹图谱指纹图谱检测
1.样品和试剂
1.1样品：黄芪提取物（按照实施例一制备）、太子参提取物（按照实施例二制备）、枸杞子提取物（按照实施例三制备）、女贞子提取物（按照实施例四制备）、水蛭提取物（按照实施例五制备）或大黄粉末提取物（按照实施例六制备）。
对照品表儿茶素（878-200102）购自中国药品生物制品检定所；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（111920-201203）购自中国食品药品检定研究院；芦丁（100080-200707）购自中国药品生物制品检定所；女贞子苷（111918-201102）购自中国药品生物制品检定所；特女贞苷（111926-201102）购自中国食品药品检定研究院；芦荟大黄素（110795-201007）购自中国药品生物制品检定所；大黄酸（110757-200206）购自中国药品生物制品检定所；大黄素（110756-200110）购自中国食品药品检定研究院；大黄素甲醚（110758-201013）购自中国药品生物制品检定所。
1.2试剂
乙腈（HPLC，SigmaaldrichCompanyInc.USA)
乙醇、甲酸为分析纯（SigmaaldrichCompanyInc.USA)
纯净水经Milli-Q纯水系统自制（MilliporeBedford,MA,USA）
甲醇（HPLC，Honeywell）
2.供试品溶液制备
取黄芪提取物、太子参提取物、枸杞子提取物、女贞子提取物、水蛭提取物或大黄粉末0.50g于25ml量瓶中，加入50%(v/v)的甲醇水20ml，超声40min，加50%(v/v)的甲醇水至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
3.对照品溶液的制备
取适量的对照品，溶于1ml50%(v/v)甲醇水溶液中即得。
4.液相色谱分析条件
仪器：Agilentinfinity1290液相色谱仪(Agilent,USA)
色谱柱：采用对极性化合物有较好的保留，且能和纯水相流动相兼容（即耐纯水相）的ACQUITYUPLCHSST3色谱柱柱（1.8μm，150*2.1mm，SN：01353200615685，Waters）；
流动相：流动相A：0.1%甲酸水溶液（0.1%HCOOH）；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液（0.1%HCOOH+ACN），按梯度洗脱，洗脱程序如下：
0-4min时，流动相A：流动相B为100:0，50min时，流动相A：流动相B为:80:20，
100min时，流动相A：流动相B为62:38，120min时，流动相A：流动相B为0:100
123min时，流动相A：流动相B为0:100，123.1min时，流动相A：流动相B为100:0；
柱温为40℃，流速为0.2ml/min，检测波长为254nm，进样体积为4ul；
5、检测结果
黄芪提取物的指纹图谱见图10，太子参提取物指纹图谱见图11，枸杞子提取物指纹图谱见图12-13，女贞子提取物指纹图谱见图14，水蛭提取物指纹图谱见图15，大黄粉末指纹图谱见图16-图17
黄芪提取物的主要化学吸收峰：
H1号峰，保留时间RT为3.56min，峰面积为654.86，占总峰面积百分比为7.79%；H2号峰，保留时间RT为3.91min，峰面积为1630.06，占总峰面积百分比为19.38%； H3号峰，保留时间RT为8.28min，峰面积为527.25，占总峰面积百分比为6.27%；H4号峰，保留时间RT为9.47min，峰面积为1222.08，占总峰面积百分比为14.53%；H5号峰，保留时间RT为12.76min，峰面积为250.55，占总峰面积百分比为2.98%；H6号峰，保留时间RT为13.42min，峰面积610.36，占总峰面积百分比为7.26%；H7号峰，保留时间RT为14.06min，峰面积为845.66，占总峰面积百分比为10.05%；2号峰，保留时间RT为14.99min，峰面积为1468.74，占总峰面积百分比为17.46%；6号峰，保留时间RT为22.22min，峰面积为341.83，占总峰面积百分比为4.06%；H8号峰，保留时间RT为47.18min，峰面积为155.91，占总峰面积百分比为1.85%；27号峰，保留时间RT为68.85min，峰面积为609.23，占总峰面积百分比为7.24%；H9号峰，保留时间RT为88.81min，峰面积为94.44，占总峰面积百分比为1.12%；太子参提取物的主要化学吸收峰：
T1号峰，保留时间RT为5.28min，峰面积为479.64，占总峰面积百分比为6.67%；T2号峰，保留时间RT为9.76min，峰面积为541.36，占总峰面积百分比为7.52%；T3号峰，保留时间RT为13.76min，峰面积为441.87，占总峰面积百分比为6.14%；1号峰，保留时间RT为14.33min，峰面积为923.75，占总峰面积百分比为12.84%；T4号峰，保留时间RT为15.26min，峰面积为570.50，占总峰面积百分比为7.93%；T5号峰，保留时间RT为16.79min，峰面积为177.50占总峰面积百分比为2.47%；T6号峰，保留时间RT为19.57min，峰面积为307.35，占总峰面积百分比为4.27%；5号峰，保留时间RT为21.76min，峰面积为2177.16，占总峰面积百分比为30.26%；T7号峰，保留时间RT为34.49min，峰面积为255.98，占总峰面积百分比为3.56%；10号峰，保留时间RT为34.88min，峰面积为593.85，占总峰面积百分比为8.25%；T8号峰，保留时间RT为41.98min，峰面积为100.27，占总峰面积百分比为1.39%；12号峰，保留时间RT为44.49min，峰面积为278.53，占总峰面积百分比为3.87%；20号峰，保留时间RT为56.79min，峰面积为65.80，占总峰面积百分比为0.91%；T9号峰，保留时间RT为76.88min，峰面积为66.59，占总峰面积百分比为0.93%；33号峰，保留时间RT为80.37min，峰面积为215.01，占总峰面积百分比为2.99%；枸杞子提取物的主要化学吸收峰：
G1号峰，保留时间RT为3.99min，峰面积为636.02，占总峰面积百分比为2.11%；G2号峰，保留时间RT为4.98min，峰面积为21632.90，占总峰面积百分比为71.69%； G3号峰，保留时间RT为5.76min，峰面积为720.52，占总峰面积百分比为2.39%；G4号峰，保留时间RT为9.07min，峰面积为761.11，占总峰面积百分比为2.52%；G5号峰，保留时间RT为9.57min，峰面积为732.75，占总峰面积百分比为2.43%；G6号峰，保留时间RT为13.32min，峰面积为518.42，占总峰面积百分比1.72%；G7号峰，保留时间RT为13.59min，峰面积为212.94，占总峰面积百分比为0.71%；G8号峰，保留时间RT为15.12min，峰面积为312.76，占总峰面积百分比为1.04%；G9号峰，保留时间RT为15.40min，峰面积为199.70，占总峰面积百分比为0.66%；3号峰，保留时间RT为16.95min，峰面积为706.66，占总峰面积百分比为2.34%；G10号峰，保留时间RT为17.41min，峰面积为317.83，占总峰面积百分比为1.05%；4号峰，保留时间RT为20.48min，峰面积为409.36，占总峰面积百分比为1.36%；7号峰，保留时间RT为26.29min，峰面积为371.15，占总峰面积百分比为1.23%；G11号峰，保留时间RT为28.15min，峰面积为331.32，占总峰面积百分比为1.10%；G12号峰，保留时间RT为30.98min，峰面积为242.51，占总峰面积百分比为2.99%；9号峰，保留时间RT为31.41min，峰面积为351.62，占总峰面积百分比为1.17%；G13号峰，保留时间RT为33.07min，峰面积为286.95，占总峰面积百分比为0.95%；G14号峰，保留时间RT为34.95min，峰面积为110.51，占总峰面积百分比0.37%；11号峰，保留时间RT为35.25min，峰面积为220.74，占总峰面积百分比为0.73%；G15号峰，保留时间RT为38.26min，峰面积为109.47，占总峰面积百分比为0.36%；G16号峰，保留时间RT为40.84min，峰面积为124.43，占总峰面积百分比0.41%；G17号峰，保留时间RT为43.06min，峰面积为93.76，占总峰面积百分比为0.31%；G18号峰，保留时间RT为44.38min，峰面积为93.46，占总峰面积百分比为0.31%；13号峰，保留时间RT为45.11min，峰面积为141.14，占总峰面积百分比为0.47%；G19号峰，保留时间RT为46.51min，峰面积为122.94，占总峰面积百分比为0.41%；16号峰，保留时间RT为48.68min，峰面积为416.70，占总峰面积百分比为1.38%；女贞子提取物的主要化学吸收峰：
11号峰，保留时间RT为35.22min，峰面积为916.69，占总峰面积百分比为1.60%；N1号峰，保留时间RT为43.67min，峰面积为575.55，占总峰面积百分比为1.00%；18号峰，保留时间RT为51.17min，峰面积为1354.40，占总峰面积百分比为2.36%；N2号峰，保留时间RT为52.13min，峰面积为416.30，占总峰面积百分比为0.73%； 19号峰，保留时间RT为53.44min，峰面积为22298.70，占总峰面积百分比38.93%；N3号峰，保留时间RT为55.49min，峰面积为1140.18，占总峰面积百分比1.99%；25号峰，保留时间RT为62.61min，峰面积为375.52，占总峰面积百分比为0.66%；N4号峰，保留时间RT为68.39min，峰面积为672.98，占总峰面积百分比为1.18%；28号峰，保留时间RT为70.19min，峰面积为23589.10，占总峰面积百分比41.19%；31号峰，保留时间RT为73.16min，峰面积为5166.00，占总峰面积百分比为9.02%；N5号峰，保留时间RT为74.81min，峰面积为230.60，占总峰面积百分比为0.40%；N6号峰，保留时间RT为82.98min，峰面积为537.54，占总峰面积百分比为0.94%；水蛭提取物的主要化学吸收峰：
S1号峰，保留时间RT为2.82min，峰面积为621.61，占总峰面积百分比为2.69%；S2号峰，保留时间RT为4.20min，峰面积为2637.06，占总峰面积百分比为11.40%；S3号峰，保留时间RT为4.95min，峰面积为1006.98，占总峰面积百分比为4.35%；S4号峰，保留时间RT为5.41min，峰面积为812.67，占总峰面积百分比为3.51%；S5号峰，保留时间RT为6.27min，峰面积为10934.60，占总峰面积百分比为47.29%；S6号峰，保留时间RT为8.16min，峰面积为875.67，占总峰面积百分比3.79%；S7号峰，保留时间RT为9.94min，峰面积为617.03，占总峰面积百分比为2.67%；S8号峰，保留时间RT为13.68min，峰面积为801.02，占总峰面积百分比为3.46%；5号峰，保留时间RT为21.18min，峰面积为1538.00，占总峰面积百分比为6.65%；S9号峰，保留时间RT为24.07min，峰面积为315.19，占总峰面积百分比为1.36%；S10号峰，保留时间RT为25.01min，峰面积为86.94，占总峰面积百分比为0.38%；8号峰，保留时间RT为29.35min，峰面积为580.43，占总峰面积百分比为2.51%；S11号峰，保留时间RT为30.24min，峰面积为387.71，占总峰面积百分比为1.68%；11号峰，保留时间RT为35.61min，峰面积为1266.79，占总峰面积百分比为5.48%；S12号峰，保留时间RT为38.11min，峰面积为464.56，占总峰面积百分比为2.01%；S13号峰，保留时间RT为38.72min，峰面积为178.10，占总峰面积百分比为0.77%；大黄提取物的主要化学吸收峰：
D1号峰，保留时间RT为12.55min，峰面积为2427.03，占总峰面积百分比为6.01%；D2号峰，保留时间RT为26.16min，峰面积为219.38，占总峰面积百分比为0.54%；D3号峰，保留时间RT为31.15min，峰面积为539.55，占总峰面积百分比为1.34%； D4号峰，保留时间RT为39.81min，峰面积为247.61，占总峰面积百分比为0.61%；D5号峰，保留时间RT为42.62min，峰面积为422.58，占总峰面积百分比为1.05%；13号峰，保留时间RT为45.16min，峰面积为2008.51，占总峰面积百分比4.97%；14号峰，保留时间RT为47.35min，峰面积为317.12，占总峰面积百分比为0.69%；15号峰，保留时间RT为47.72min，峰面积为689.73，占总峰面积百分比为1.73%；16号峰，保留时间RT为48.44min，峰面积为1004.34，占总峰面积百分比为2.49%；D6号峰，保留时间RT为48.84min，峰面积为306.60，占总峰面积百分比为0.76%；17号峰，保留时间RT为49.63min，峰面积为991.50，占总峰面积百分比为2.46%；D7号峰，保留时间RT为52.36min，峰面积为267.51，占总峰面积百分比为0.66%；D8号峰，保留时间RT为54.40min，峰面积为448.80，占总峰面积百分比为1.11%；20号峰，保留时间RT为56.66min，峰面积为208.92，占总峰面积百分比为0.52%；21号峰，保留时间RT为57.42min，峰面积为248.11，占总峰面积百分比为0.61%；22号峰，保留时间RT为57.69min，峰面积为373.38，占总峰面积百分比为0.92%；23号峰，保留时间RT为59.85min，峰面积为1074.73，占总峰面积百分比为2.66%；24号峰，保留时间RT为60.12min，峰面积为4224.22，占总峰面积百分比为10.46%；D9号峰，保留时间RT为61.41min，峰面积为456.21，占总峰面积百分比为1.13%；D10号峰，保留时间RT为62.98min，峰面积为327.32，占总峰面积百分比为0.81%；26号峰，保留时间RT为65.82min，峰面积为854.41，占总峰面积百分比为2.12%；D11号峰，保留时间RT为67.20min，峰面积为216.42，占总峰面积百分比0.54%；D12号峰，保留时间RT为69.50min，峰面积为483.13，占总峰面积百分比为1.20%；28号峰，保留时间RT为70.61min，峰面积为689.37，占总峰面积百分比为1.71%；D13号峰，保留时间RT为70.93min，峰面积为680.76，占总峰面积百分比为1.69%；29号峰，保留时间RT为72.03min，峰面积为612.22，占总峰面积百分比为1.52%；30号峰，保留时间RT为72.39min，峰面积为1400.18，占总峰面积百分比为3.47%；32号峰，保留时间RT为78.19min，峰面积为521.30，占总峰面积百分比为1.29%；D14号峰，保留时间RT为79.50min，峰面积为869.60，占总峰面积百分比为2.15%；33号峰，保留时间RT为80.31min，峰面积为294.34，占总峰面积百分比为0.73%；34号峰，保留时间RT为80.98min，峰面积为237.22，占总峰面积百分比为0.59%；35号峰，保留时间RT为82.59min，峰面积为1115.50，占总峰面积百分比为2.76%； D15号峰，保留时间RT为88.11min，峰面积为679.63，占总峰面积百分比1.68%；36号峰，保留时间RT为92.22min，峰面积为2873.49，占总峰面积百分比为7.12%；37号峰，保留时间RT为97.59min，峰面积为7335.95，占总峰面积百分比为18.17%；38号峰，保留时间RT为105.81min，峰面积为673.27，占总峰面积百分比为1.67%；39号峰，保留时间RT为110.25min，峰面积为2580.30，占总峰面积百分比为6.39%；40号峰，保留时间RT为114.24min，峰面积为1481.56，占总峰面积百分比为3.67%；
实施例九、渴络欣胶囊对照指纹图谱的测定
1、样品和试剂
1.1样品：渴络欣胶囊（按照实施例七制备，批号：111201）；
对照品：同实施例八。
1.2试剂
同实施例八。
2、供试品溶液制备
取渴络欣胶囊样品内容物0.50g于25ml量瓶中，加入50%(v/v)的甲醇水20ml，超声40min，加50%(v/v)的甲醇水至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
3、对照品溶液的制备
取适量的对照品，溶于1ml50%(v/v)甲醇水溶液中即得。
4、液相色谱检测条件
仪器：AgilentInfinity1290(Agilent,USA)
色谱条件：采用对极性化合物有较好的保留，且能和纯水相流动相兼容（即耐纯水相）的ACQUITYUPLCHSST3色谱柱柱（1.8μm，150*2.1mm，SN：01353200615685，Waters）；
流动相A：0.1%甲酸水溶液（0.1%HCOOH），流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液（0.1%HCOOH+ACN），按梯度洗脱，发明人对比了不同洗脱程序条件下，渴络欣胶囊指纹图谱的检测情况，具体洗脱程序如下：
梯度洗脱程序一：
0-5min时，流动相A:流动相B为95:5，65min时，流动相A:流动相B为40:60，
115min时，流动相A:流动相B为0:100，115.1min时，流动相A:流动相B为95:5，
120min时，流动相A:流动相B为95:5；
梯度洗脱程序二：
0-5min时，流动相A:流动相B为95:5，65min时，流动相A:流动相B为65:35，
100min时，流动相A:流动相B为20:80，115min时，流动相A:流动相B为0:100，
115.1min时，流动相A:流动相B为95:5，120min时，流动相A:流动相B为95:5；梯度洗脱程序三：
0-4.5min时，流动相A:流动相B为100:0，18min时，流动相A:流动相B为95:5，27min时，流动相A:流动相B为85:15，58.3min时，流动相A:流动相B为75:25，71.7min时，流动相A:流动相B为40:60，89.7min时，流动相A:流动相B为20:80，94.2min时，流动相A:流动相B为0:100，103.2min时，流动相A:流动相B为0:100，103.3min时，流动相A:流动相B为100:0，108min时，流动相A:流动相B为100:0；
梯度洗脱程序四：
0-4min时，流动相A:流动相B为100:0，50min时，流动相A:流动相B为:80:20，
100min时，流动相A:流动相B为62:38，120min时，流动相A:流动相B为0:100，
123min时，流动相A:流动相B为0:100，123.1min时，流动相A:流动相B为100:0；
柱温为40℃，流速为0.2ml/min，检测波长为254nm，进样体积为4ul；
5、梯度洗脱程序考察结果
梯度洗脱程序一的指纹图谱见图3，梯度洗脱程序二的指纹图谱见图4，梯度洗脱程序三的指纹图谱见图5，梯度洗脱程序四的指纹图谱见图6。
通过对比试验发现，不同的梯度洗脱程序对渴络欣胶囊指纹图谱检测结果影响较大：梯度一的色谱峰过于集中于前50min，分布极不均匀，基线出现较大波动，且溶剂峰较大；梯度二的色谱峰过于集中于中间的30-70min，分布极不均匀，且溶剂峰较大；梯度三的各阶段梯度变化太快，基线反复出现较大波动，且色谱峰分布不够均匀；梯度四的色谱图中约2-3min处的溶剂峰明显减小，基线平稳，色谱峰分布较为均匀，并分出了新的色谱峰，可以更加全面的反映渴络欣胶囊的活性物质群，因此，梯度四的洗脱程序更适合于渴络欣胶囊的指纹图谱检测分析。
6、检测
6.1渴络欣胶囊指纹图谱
渴络欣胶囊指纹图谱见图6，其含有40个指纹峰如下：
1号峰，保留时间RT为14.29min；2号峰，保留时间RT为15.08min；
3号峰，保留时间RT为16.84min；4号峰，保留时间RT为20.30min；
5号峰，保留时间RT为21.22min；6号峰，保留时间RT为22.20min；
7号峰，保留时间RT为25.89min；8号峰，保留时间RT为29.04min；
9号峰，保留时间RT为31.15min；10号峰，保留时间RT为34.11min；
11号峰，保留时间RT为34.84min；12号峰，保留时间RT为43.65min；
13号峰，保留时间RT为44.85min；14号峰，保留时间RT为47.06min；
15号峰，保留时间RT为47.39min；16号峰，保留时间RT为48.00min；
17号峰，保留时间RT为49.28min；18号峰，保留时间RT为50.75min；
19号峰，保留时间RT为53.42min；20号峰，保留时间RT为56.35min；
21号峰，保留时间RT为57.12min；22号峰，保留时间RT为57.42min；
23号峰，保留时间RT为59.57min；24号峰，保留时间RT为59.88min；
25号峰，保留时间RT为62.05min；26号峰，保留时间RT为65.43min；
27号峰，保留时间RT为68.63min；28号峰，保留时间RT为70.23min；
29号峰，保留时间RT为71.58min；30号峰，保留时间RT为71.98min；
31号峰，保留时间RT为73.08min；32号峰，保留时间RT为77.70min；
33号峰，保留时间RT为79.80min；34号峰，保留时间RT为80.51min；
35号峰，保留时间RT为82.13min；36号峰，保留时间RT为91.59min；
37号峰，保留时间RT为96.97min；38号峰，保留时间RT为105.47min；
39号峰，保留时间RT为109.92min；40号峰，保留时间RT为113.94min。
6.2稳定性试验
按照梯度洗脱程序四的方法，测定提取后溶液在4℃条件下，放置0、4、16和48h的溶液稳定性，测定结果见表1：
表1溶液稳定性实验结果
以上结果显示所有成分峰面积的RSD%<3%，证明该溶液在4℃条件下48h内稳定。6.2重现性试验
按梯度洗脱程序四的方法，平行测定6份，测定结果见表2：
表2重现性实验结果
以上结果显示平行6份样品间峰面积的RSD%<3%，证明该方法重现性良好。
5.3渴络欣胶囊指纹图谱中有效成分的鉴定
本发明还对上述得到的渴络欣胶囊指纹图谱中化合物的结构进行了研究，通过液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法，鉴定了上述渴络欣胶囊指纹图谱中29个共有吸收峰的化学成分，即通过将质谱数据同文献的质谱数据对比，进行结构鉴定。
其中液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法为：将有高效液相色谱仪的紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪(FinniganLTQIon离子肼质谱，SanJose,CA，USA)进行物质测定；质谱仪检测条件优选为：电喷雾电离采用正离子模式和负离子两种模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-35V，透镜电压为-200V。全扫描质量范围：150-1000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。
所述液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法测定结果详见表3。
表3渴络欣胶囊化合物鉴定表
注：“/”表示该化合物在相应的离子模式下没响应，“a”表示化合物通过与对照品对比确定结构。
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被鉴定的29个化合物的结构如下：
其中上述化合物名称为：1、hirudinoidinesB；2、毛蕊异黄酮；3、hirudinoidinesA；4、hirudonucleodisulfideA；5、表儿茶素；6、莨菪碱；7、表儿茶素-3-O-没食子酸酯；8、毛蕊异黄酮葡萄糖苷；9、芦丁；10、土大黄苷；11、女贞苷；12、特女贞苷；13、羟基酸模素-8-O-β-D-葡萄糖苷；14、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；15、莲花掌苷； 16、大黄酚；17、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷；18、Torachrysone-8-O-β-D-glucopyranoside；19、2'-羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D葡萄糖苷；20、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；21、桂皮酰-没食子酰葡萄糖苷；22、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷；23、4-(4'-羟苯基)-2-丁酮-4'-O-β-D-(2”-没食子酰-6”-肉桂酰)葡萄糖苷；24、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷；25、芦荟大黄素；26、大黄酸；；27、4-(4'-羟苯基)-2-丁酮-4'-O-β-D-(2”-桂皮酰-6”-没食子酰)葡萄糖苷；28、大黄素；29、大黄素甲醚。
实施例十渴络欣胶囊的指纹图谱检测
1、样品和试剂
1.1样品：渴络欣胶囊（按照实施例七制备，批号：110501、111001、111201、120801）；
对照品：同实施例八。
1.2试剂
同实施例八。
2、供试品溶液制备
取渴络欣胶囊样品内容物0.50g于25ml量瓶中，加入50%(v/v)的甲醇水20ml，超声40min，加50%(v/v)的甲醇水至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。
3、对照品溶液的制备
取适量的对照品，溶于1ml50%(v/v)甲醇水溶液中即得。
4、液相色谱检测条件
同实施例八。
5、数据分析
对4批渴络欣胶囊进行了指纹图谱检测，其相似度在90%以上。所有图谱平均保留时间、峰面积平均值以及RSD数据见表4。其中四批次检测谱图见图9。
表4渴洛欣胶囊指纹图谱检测结果（4批次）
Claims (7)
1.一种药物指纹图谱的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备
取药物适量，溶于0～100%的甲醇水溶液中，超声溶解，加0～100%的甲醇水溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液；
（2）色谱条件
色谱柱为耐纯水相的十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；检测波长210～300nm；
（3）测定
吸取上述供试品溶液注入液相色谱，使用高效液相色谱法进行测定，得到药物指纹图谱；
所述药物选自黄芪提取物、太子参提取物、枸杞子提取物、女贞子提取物、水蛭提取物、大黄粉末中的一种或多种的混合物。
2.根据权利要求1所述的药物指纹图谱测定方法，其特征在于：步骤（2）中检测波长为210-300nm，流速为0.2ml/min，柱温为35-45℃，进样体积为1-10ul；优选检测波长为254nm，流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为4ul；步骤（1）中优选甲醇水溶液为20%～75%的甲醇水溶液；进一步优选为50%(v/v)的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的药物指纹图谱测定方法，其特征在于：步骤（1）中优选供试品溶液制备方法为：取药物0.45～0.55g，置于25ml量瓶中，加入50%(v/v)的甲醇水20ml，超声40min，加50%(v/v)的甲醇水至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的药物指纹图谱测定方法，其特征在于：步骤（2）中流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，所述梯度洗脱程序为：
0-4min时，流动相A：流动相B为100:0
50min时，流动相A：流动相B为:80:20
100min时，流动相A：流动相B为62:38
120min时，流动相A：流动相B为0:100
123min时，流动相A：流动相B为0:100
123.1min时，流动相A：流动相B为100:0。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪的紫外检测器流出液直接进入质谱仪进行物质测定，其中质谱仪检测条件优选为：电喷雾电离，采用正离子模式和负离子两种模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-35V，透镜电压为-200V；全扫描质量范围：150-1000amu，二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的药物指纹图谱测定方法，其特征在于所述药物为渴洛欣胶囊时，其指纹图谱中含有40个指纹峰，分别为：
1号峰，保留时间RT为14.29min；2号峰，保留时间RT为15.08min；
3号峰，保留时间RT为16.84min；4号峰，保留时间RT为20.30min；
5号峰，保留时间RT为21.22min；6号峰，保留时间RT为22.20min；
7号峰，保留时间RT为25.89min；8号峰，保留时间RT为29.04min；
9号峰，保留时间RT为31.15min；10号峰，保留时间RT为34.11min；
11号峰，保留时间RT为34.84min；12号峰，保留时间RT为43.65min；
13号峰，保留时间RT为44.85min；14号峰，保留时间RT为47.06min；
15号峰，保留时间RT为47.39min；16号峰，保留时间RT为48.00min；
17号峰，保留时间RT为49.28min；18号峰，保留时间RT为50.75min；
19号峰，保留时间RT为53.42min；20号峰，保留时间RT为56.35min；
21号峰，保留时间RT为57.12min；22号峰，保留时间RT为57.42min；
23号峰，保留时间RT为59.57min；24号峰，保留时间RT为59.88min；
25号峰，保留时间RT为62.05min；26号峰，保留时间RT为65.43min；
27号峰，保留时间RT为68.63min；28号峰，保留时间RT为70.23min；
29号峰，保留时间RT为71.58min；30号峰，保留时间RT为71.98min；
31号峰，保留时间RT为73.08min；32号峰，保留时间RT为77.70min；
33号峰，保留时间RT为79.80min；34号峰，保留时间RT为80.51min；
35号峰，保留时间RT为82.13min；36号峰，保留时间RT为91.59min；
37号峰，保留时间RT为96.97min；38号峰，保留时间RT为105.47min；
39号峰，保留时间RT为109.92min；40号峰，保留时间RT为113.94min。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的药物指纹图谱测定方法，其特征在于：
所述药物为黄芪提取物时，其指纹图谱中含有12个指纹峰为：
H1号峰，保留时间RT为3.56min，H2号峰，保留时间RT为3.91min，
H3号峰，保留时间RT为8.28min，H4号峰，保留时间RT为9.47min，
H5号峰，保留时间RT为12.76min，H6号峰，保留时间RT为13.42min，
H7号峰，保留时间RT为14.06min，2号峰，保留时间RT为14.99min，
6号峰，保留时间RT为22.22min，H8号峰，保留时间RT为47.18min，
27号峰，保留时间RT为68.85min，H9号峰，保留时间RT为88.81min；
所述药物为太子参提取物时，其指纹图谱中含有15个指纹峰为：
T1号峰，保留时间RT为5.28min，T2号峰，保留时间RT为9.76min，
T3号峰，保留时间RT为13.76min，1号峰，保留时间RT为14.33min，
T4号峰，保留时间RT为15.26min，T5号峰，保留时间RT为16.79min，
T6号峰，保留时间RT为19.57min，5号峰，保留时间RT为21.76min，
T7号峰，保留时间RT为34.49min，10号峰，保留时间RT为34.88min，
T8号峰，保留时间RT为41.98min，12号峰，保留时间RT为44.49min，
20号峰，保留时间RT为56.79min，T9号峰，保留时间RT为76.88min，
33号峰，保留时间RT为80.37min；
所述药物为枸杞子提取物时，其指纹图谱中含有26个指纹峰为：
G1号峰，保留时间RT为3.99min，G2号峰，保留时间RT为4.98min，
G3号峰，保留时间RT为5.76min，G4号峰，保留时间RT为9.07min，
G5号峰，保留时间RT为9.57min，G6号峰，保留时间RT为13.32min，
G7号峰，保留时间RT为13.59min，G8号峰，保留时间RT为15.12min，
G9号峰，保留时间RT为15.40min，3号峰，保留时间RT为16.95min，
G10号峰，保留时间RT为17.41min，4号峰，保留时间RT为20.48min，
7号峰，保留时间RT为26.29min，G11号峰，保留时间RT为28.15min，
G12号峰，保留时间RT为30.98min，9号峰，保留时间RT为31.41min，
G13号峰，保留时间RT为33.07min，G14号峰，保留时间RT为34.95min，
11号峰，保留时间RT为35.25min，G15号峰，保留时间RT为38.26min，
G16号峰，保留时间RT为40.84min，G17号峰，保留时间RT为43.06min，
G18号峰，保留时间RT为44.38min，13号峰，保留时间RT为45.11min，
G19号峰，保留时间RT为46.51min，16号峰，保留时间RT为48.68min；
所述药物为女贞子提取物时，其指纹图谱中含有12个指纹峰为：
11号峰，保留时间RT为35.22min，N1号峰，保留时间RT为43.67min，
18号峰，保留时间RT为51.17min，N2号峰，保留时间RT为52.13min，
19号峰，保留时间RT为53.44min，N3号峰，保留时间RT为55.49min，
25号峰，保留时间RT为62.61min，N4号峰，保留时间RT为68.39min，
28号峰，保留时间RT为70.19min，31号峰，保留时间RT为73.16min，
N5号峰，保留时间RT为74.81min，N6号峰，保留时间RT为82.98min；
所述药物为水蛭提取物时，其指纹图谱中含有16个指纹峰为：
S1号峰，保留时间RT为2.82min，S2号峰，保留时间RT为4.20min，
S3号峰，保留时间RT为4.95min，S4号峰，保留时间RT为5.41min，
S5号峰，保留时间RT为6.27min，S6号峰，保留时间RT为8.16min，
S7号峰，保留时间RT为9.94min，S8号峰，保留时间RT为13.68min，
5号峰，保留时间RT为21.18min，S9号峰，保留时间RT为24.07min，
S10号峰，保留时间RT为25.01min，8号峰，保留时间RT为29.35min，
S11号峰，保留时间RT为30.24min，11号峰，保留时间RT为35.61min，
S12号峰，保留时间RT为38.11min，S13号峰，保留时间RT为38.72min；
所述药物为大黄提取物时，其指纹图谱中含有38个指纹峰为：
D1号峰，保留时间RT为12.55min，D2号峰，保留时间RT为26.16min，
D3号峰，保留时间RT为31.15min，D4号峰，保留时间RT为39.81min，
D5号峰，保留时间RT为42.62min，13号峰，保留时间RT为45.16min，
14号峰，保留时间RT为47.35min，15号峰，保留时间RT为47.72min，
16号峰，保留时间RT为48.44min，D6号峰，保留时间RT为48.84min，
17号峰，保留时间RT为49.63min，D7号峰，保留时间RT为52.36min，
D8号峰，保留时间RT为54.40min，20号峰，保留时间RT为56.66min，
21号峰，保留时间RT为57.42min，22号峰，保留时间RT为57.69min，
23号峰，保留时间RT为59.85min，24号峰，保留时间RT为60.12min，
D9号峰，保留时间RT为61.41min，D10号峰，保留时间RT为62.98min，
26号峰，保留时间RT为65.82min，D11号峰，保留时间RT为67.20min，
D12号峰，保留时间RT为69.50min，28号峰，保留时间RT为70.61min，
D13号峰，保留时间RT为70.93min，29号峰，保留时间RT为72.03min，
30号峰，保留时间RT为72.39min，32号峰，保留时间RT为78.19min，
D14号峰，保留时间RT为79.50min，33号峰，保留时间RT为80.31min，
34号峰，保留时间RT为80.98min，35号峰，保留时间RT为82.59min，
D15号峰，保留时间RT为88.11min，36号峰，保留时间RT为92.22min，
37号峰，保留时间RT为97.59min，38号峰，保留时间RT为105.81min，
39号峰，保留时间RT为110.25min，40号峰，保留时间RT为114.24min。
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