CN103123344A

CN103123344A - 一种药物组合物的指纹图谱的测定方法

Info

Publication number: CN103123344A
Application number: CN2012102433639A
Authority: CN
Inventors: 柯潇; 邬智刚; 乔怀耀
Original assignee: KANGHONG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Current assignee: KANGHONG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2032-07-13
Also published as: CN103123344B

Abstract

本发明涉及一种药物组合物的指纹图谱的测定方法，该方法包括供试品溶液的制备，取药物组合物适量，溶于一定体积比例的醇水溶液中，超声溶解，加上述一定体积比例的醇水溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液；色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；检测波长210～300nm；测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。此种方法测定的指纹图谱重复性高，可作为松龄血脉康胶囊中化学组分的测定方法。

Description

一种药物组合物的指纹图谱的测定方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物组合物的指纹图谱的测定方法。

背景技术

中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药化学成分的光谱图或色谱图，是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。目前，美国FDA、英国和印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。此外，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。目前中药指纹图谱的建立方法主要有：光谱法，如紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)；色谱法，如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、毛细管电泳法；以及其他方法，如x射线衍射法、核磁共振法等。其中高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法等其他方法应用范围更广，是构建指纹图谱的主要方法之一。

《中华人民共和国药典》（2010版）第一部800-801页记载松龄血脉康胶囊处方及其制备工艺，其处方为：鲜松叶、葛根加水煎煮二次，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，喷雾干燥，加入珍珠层粉和适量淀粉、滑石粉和硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。功能主治为：平肝潜阳、镇心安神，用于肝阳上亢所致的头痛、眩晕、急躁易怒、心悸、失眠；高血压病及原发性高脂血症见上述症候者。自1998年上市以来，松龄血脉康降压作用确切,平稳持久,特别对于收缩压和收缩压负荷值、有效控制血压晨峰现象、降脂作用优于其他降压药，且无不良反应；能够通过增加抑制凋亡基因Bcl-2蛋白的表达,拮抗细胞凋亡,从而起到脑保护作用；同时能够通过降低全血高切黏度、血浆黏度、全血还原黏度来改善血黏度。

中药葛根为豆科多年生落叶藤本植物野葛或甘葛藤的根。始载于《神农本草经》，味甘辛，性凉，归脾、胃经，有发表解肌，透疹生津，升阳止泻的功用。多用于治疗外感表证、麻疹不透、烦热消渴、泄泻等症。通过对葛根主要成分的提取、分离和鉴定，发现葛根的主要成分为如下几类[郭建平,孙其荣.葛根化学成分及临床应用研究概况.药学实践杂志,1996,14(3):146]：①异黄酮类，主要包括大豆苷元(大豆素、大豆黄素、黄豆苷元)、大豆苷、葛根素等；②葛根苷类，主要包括葛根苷A、B、C三种，它们被认为是二氢查尔酮的衍生物；③三贴皂苷类，主要包括以葛根皂醇A、B、C命名的7种新型齐墩果烷型皂角精醇、槐二醇、大豆皂醇B、大豆苷醇A等；④生物碱及其他化合物。

松针是我国传统中药，在历代本草中均有记载。《名医别录》谓其：“主风湿疮，生毛发，安五脏”。《本草纲目》记载：“松叶，气味苦、温、无毒，久服令人不老，轻身益气，主风湿疹，生毛发，安五脏，守中，不饥延年”。饮用松针茶可使高血压、高血脂等心脑血管疾病以及糖尿病的症状得到缓解[张志琴，肖培云，刘光明.松针的化学成分和药理活性研究进展[J]，现代药物与临床，2011,26(4):278-281]。张旭等[张旭，及元乔，李萍等.松针的化学成分研究[J]，天然产物研究与开发，2006,18(4):621-623]从马尾松松叶中提取到有机酸和槲皮素，槲皮素具有广泛的药理作用，有抗氧化及清除氧自由基作用、能降低血压，保护心肌缺血再灌注损伤，有免疫增强功能等作用。松针中主要成分分为四大类，挥发油、黄酮类、木脂素及色素维生素。Shen等[Shen Z B,Olof T.Flavonoid glycosides from needles of Pinus assoniana,Phytochemistry[J],1985,24(1):155–158]从马尾松松针中分离出7个黄酮类成分，有花旗松素、花旗松素-3-O-β-D-葡萄糖苷、儿茶素、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷等，王巍等[王巍，王晓华，尹江峰等.马尾松松针的黄酮类化学成分的分离鉴定[J]，中国医脘药学杂志，2008,28(7):549-552]从马尾松松针的60%乙醇提取物的醋酸乙酯和正丁醇萃取部位分离得到7个黄酮类化合物，分别是3,5-二羟基-4-甲氧基二氢黄酮-7-O-α-L-鼠李糖基（1→6）-β-D-葡萄糖苷、3,5-二羟基-4-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖基（1→2）-α-L-鼠李糖苷、4,5-二羟基二氢黄酮-7-O-L-鼠李糖基（1→2）-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-吡喃葡萄糖苷、槲皮素和双氢槲皮素；松针中一般含有丰富的叶绿素、胡萝卜素和维生素E及维生素C，远高于一般蔬菜和水果[胡丰林，陆瑞利.松针的利用价值分析[J]，生物学杂志，1996(2):25-26]。

珍珠是祖国医药学遗产中的精华,我国早有服用珍珠粉医疗疾病、保健身体的经验,自晋代葛洪著《抱朴子》及《肘后备急方》记载以来,在历代医药文献对珍珠的功用有过明确的论述,总结为珍珠具有镇心定惊、清肝除翳、收敛生肌的功效[卢慧卿.珍珠的药用价值[J]，海洋药物，1987,(2):38]。珍珠层粉的成分除含有少量氨基酸外，绝大部分为无机成分如碳酸钙、氧化钙及少量氧化锌、氧化钠、氧化钾、氧化镁等，成分较为简单[卢慧卿,杨京玉,丛英杰,萧玉霞,张丽彦.珍珠粉、珍珠层粉药用价值的比较[J]，天然产物研究与开发，1991,3(3):35-42]。

随着中药现代化、国际化的不断发展，现代分析技术如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、X光衍射法、毛细管电泳、分子生物技术以及其他分析方法不断在中药鉴定中药质控等方面的应用，建立了一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法即指纹图谱。目前,美国FDA,英国和印度草药典，德国药用植物学会，加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法；2000年第4季度我国下发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》率先要求中药注射剂推行指纹图谱的质控办法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成,每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。其次,这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗,体现了控制某张中药复方指纹图谱,就可确保其相应药效。而松龄血脉康胶囊是由葛根、鲜松叶和珍珠层粉组成，其治疗效果也已经得到临床上充分印证，其中葛根和鲜松叶所含组分众多，如何保证药物的质量，控制其疗效，需要对它的活性物质群进行控制，因此现代手段指纹图谱的引入质控标准变得尤为重要。

发明内容

本发明提供了一种药物组合物指纹图谱的测定方法，包括以下步骤：

（a）供试品溶液的制备

取药物组合物适量，溶于一定体积比例的甲醇水溶液中，超声溶解，加上述一定体积比例的甲醇水溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液；

（b）色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；检测波长210～300nm；

（c）测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

所述药物组合物选自松龄血脉康胶囊、鲜松叶提取物或葛根提取物。

所述（b）中优选检测波长为210-300nm，流速为0.2ml/min，柱温为25-35℃，进样体积为1-10ul；进一步优选检测波长为250nm，流速为0.2ml/min，柱温为30℃，进样体积为1ul；

所述（a）中供试品溶液制备方法优选为：取药物0.20~0.25g，置于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液，超声30min，溶解，加50%（v/v）甲醇水定容至刻度，滤过，即得试品样品溶液。

更优选为取松龄血脉康胶囊样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取滤液备用。

所述（b）步骤中优选色谱条件为：流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液。

所述梯度洗脱程序优选为：

其中下述比例为体积比

0-3min时，流动相A：流动相B=95:5

15min时，流动相A：流动相B=90:10

20min时，流动相A：流动相B=80:20

40min时，流动相A：流动相B=60:40

45min时，流动相A：流动相B=0:100。

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。

本发明采用高效液相色谱法测定获得的松龄血脉康胶囊指纹图谱中含有10个单峰面积占总峰面积百分比超过1.5%的吸收峰，分别是：

1号峰，莽草酸，保留时间RT为1.96min；

2号峰，葛根素-4'-O-D-葡萄糖苷，保留时间RT为13.82min；

3号峰，大豆苷元4',7-二葡萄糖苷，保留时间RT为16.65min；

4号峰，3'-羟基葛根素，保留时间RT为17.50min；

7号峰，葛根素，保留时间RT为21.11min；

8号峰，葛根素-7-芹菜糖苷，保留时间RT为21.71min；

9号峰，3'-甲氧基葛根素，保留时间RT为22.06min；

10号峰，葛根素-7-木糖苷，保留时间RT为22.32min；

12号峰，大豆苷原-4'-葡萄糖苷，保留时间RT为23.91min；

23号峰，大豆苷原，保留时间RT为34.01min。

所测得的松龄血脉康胶囊指纹图谱中还含有15个单峰面积占总峰面积百分比未超过1.5%的共有指纹峰，分别为：

5号峰，3'-羟基葛根素木糖苷，保留时间RT为19.92min；

6号峰，（+）-（6s,9R）-9-O-β-D-glucopyranosyloxy-6-hydroxy-3-oxo-α-ionol，保留时间RT为20.69min；

11号峰，3'-羟基葛根素-4'-脱氧葡萄糖苷，保留时间RT为22.98min；

13号峰，异落叶松酯素-9-O-木糖苷，保留时间RT为24.96min；

14号峰，染料木素-7-O-木糖-8-C-葡萄糖苷，保留时间RT为25.48min；

15号峰，异黄酮苷，保留时间RT为26.32min；

16号峰，Massonianoside A/B/E，保留时间RT为27.52min；

17号峰，染料木苷，保留时间RT为28.07min；

18号峰，4',6',7'-三羟基异黄酮-6-甲氧基-7-O-β-D-木糖基-β-D-葡萄糖苷，保留时间RT为28.88min；

19号峰，3'-甲氧基大豆苷，保留时间RT为29.78min；

20号峰，3'-乙酰基大豆苷，保留时间RT为30.89min；

21号峰，5-羟基-3'-乙酰基大豆苷，保留时间RT为31.78min；

22号峰，Massonianoside C/9'-O-对羟基反式桂皮酰基落叶松脂醇酯，保留时间RT为32.67min；

24号峰，鹰嘴豆芽素A，保留时间RT为34.60min；

25号峰，6-甲氧基-7-木糖基-染料木苷，保留时间RT为34.91min。

所测得的松叶提取物指纹图谱中，含有5个指纹峰，分别为：

1号峰，莽草酸，保留时间RT为1.99min；

6号峰，（+）-（6s,9R）-9-O-β-D-glucopyranosyloxy-6-hydroxy-3-oxo-α-ionol，保留时间RT为21.08min；

13号峰，异落叶松酯素-9-O-木糖苷，保留时间RT为25.54min；

16号峰，Massonianoside A/B/E，保留时间RT为28.18min；

22号峰，MassonianosideC/9'-O-对羟基反式桂皮酰基落叶松脂醇酯，保留时间RT为33.25min。

所测得的葛根提取物指纹图谱中含有20个指纹峰，分别为：

2号峰，葛根素-4'-O-D-葡萄糖苷，保留时间RT为13.98min；

3号峰，大豆苷元4',7-二葡萄糖苷，保留时间RT为16.77min；

4号峰，3'-羟基葛根素，保留时间RT为17.62min；

5号峰，3'-羟基葛根素木糖苷，保留时间RT为19.98min；

7号峰，葛根素，保留时间RT为21.17min；

8号峰，葛根素-7-芹菜糖苷，保留时间RT为21.74min；

9号峰，3'-甲氧基葛根素，保留时间RT为22.10min；

10号峰，葛根素-7-木糖苷，保留时间RT为22.35min；

11号峰，3'-羟基葛根素-4'-脱氧葡萄糖苷，保留时间RT为23.00min；

12号峰，大豆苷原-4'-葡萄糖苷，保留时间RT为23.96min；

14号峰，染料木素-7-O-木糖-8-C-葡萄糖苷，保留时间RT为25.52min；

15号峰，异黄酮苷，保留时间RT为26.38min；

17号峰，染料木苷，保留时间RT为28.13min；

18号峰，4',6',7'-三羟基异黄酮-6-甲氧基-7-O-β-D-木糖基-β-D-葡萄糖苷，保留时间RT为28.91min；

19号峰，3'-甲氧基大豆苷，保留时间RT为29.80min；

20号峰，3'-甲氧基大豆苷，保留时间RT为31.09min；

21号峰，5-羟基-3'-乙酰基大豆苷，保留时间RT为31.84min；

23号峰，大豆苷原，保留时间RT为34.06min；

24号峰，鹰嘴豆芽素A，保留时间RT为34.81min；

25号峰，6-甲氧基-7-木糖基-染料木苷，保留时间RT为35.12min。

通过以上松龄血脉康胶囊指纹图谱、鲜松叶提取物指纹图谱、葛根提取物指纹图谱信息可以看出：本发明检测方法得到的松龄血脉康胶囊指纹图谱包含了鲜松叶提取物指纹图谱和葛根提取物指纹图谱中的共有吸收峰，说明采用本方法检测得到的松龄血脉康胶囊指纹图谱可以客观反应松龄血脉康胶囊内在有效成分的含量和有无，便于全面控制产品质量。

同时本申请发明人考察获知，当采用甲酸水-乙腈体系作为流动相时，尤其是0.1%（v/v）甲酸水溶液更适合于高效液相色谱-质谱联用检测松龄血脉康胶囊，松龄血脉康胶囊中主要活性物质能达到较理想的分离，没有重叠，且峰形优异。

本申请发明人通过二极管阵列检测器（DAD检测器检测）检测松龄血脉康吸收波长，获知在210-250nm处均有吸收，其中当检测波长为250nm时样品中的各个成分均有吸收且主要化合物具有较强吸收，且出峰结果稳定。

本申请发明人还考察了不同提取液对待测品的提取效果对检测结果的影响，包括H₂O、25%（v/v）甲醇、50%（v/v）甲醇、75%（v/v）甲醇、和100%甲醇对提取效率的影响，结果表明，H₂O、25%（v/v）甲醇、50%（v/v）甲醇、75%（v/v）甲醇、和100%甲醇对提取效率无明显区别，出峰数量一致，其检测结果均较好，但50%（v/v）甲醇的提取率较其他溶剂略有提高。

本发明优点如下：

1、本发明建立的松龄血脉康胶囊HPLC指纹图谱检测方法及其指纹图谱，对于其有效成分鲜松叶和葛根大部分药理活性物质进行了有效表征，实现了最大可能的对其化学成分进行检测。提供了一种通过整体的指纹图谱信息对松龄血脉康胶囊质量进行评价的方法，避免了只测定其中一、二个化学成分就对松龄血脉康胶囊整体质量判断的片面性，使得松龄血脉康胶囊质量控制更加客观和准确；

2、本发明所提供的指纹图谱检测方法对两种药材各自有效成分的峰分离性好；

3、本发明所提供的指纹图谱检测方法所需检测时间合理，主要活性成分的峰在40分钟内出峰，并且峰强度都较大，因此使得检测效率高效；

4、本发明所提供的指纹图谱检测方法其重复性和稳定性好；

5、本发明所提供的指纹图谱检测方法避免了在流动相中使用磷酸，使其能够在经高效液相色谱检测后直接与质谱仪联用，有效确定相关物质的结构，更好的监控相关药物的质量。

附图说明

图1对照品色谱图（1莽草酸，7葛根素）

图2-1松龄血脉康胶囊色谱图（全图）

图2-2松龄血脉康胶囊色谱图（局部放大图1）

图2-2松龄血脉康胶囊色谱图（局部放大图2）

图3-1葛根提取物图谱全图

图3-2葛根提取物图谱局部

图4马尾松松叶提取物图谱

图5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7松龄血脉康胶囊指纹图谱

具体实施方式

以下实施方式仅是对本发明的进一步说明，并不能作为对本发明保护范围的进一步限定。

实施例一、葛根提取物的制备

称取葛根加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣再加入6倍量水（折干含量），同法提取1.5小时，过滤，合并2次滤液，浓缩至适当，喷雾干燥，得到葛根浸膏粉。

实施例二、马尾松松针提取物的制备

称取鲜松叶加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣再加入6倍量水（折干含量），同法提取1.5小时，过滤，合并2次滤液，浓缩至适当，喷雾干燥，得到松叶浸膏粉。

实施例三、松龄血脉康胶囊的制备

原料药重量配比为：

鲜松叶 3600g 葛根 600g 珍珠层粉 90g

取上述用量配比的鲜松叶、葛根药材，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮1.5小时，第二次加6倍量的水，煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，并将滤液减压浓缩成相对密度在70℃时检测为1.2的浸膏，取浸膏液进行喷雾干燥(进塔风温220℃，出塔风温110℃)得干浸膏粉，加入珍珠层粉和适量的淀粉、滑石粉和硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。

实施例四、葛根提取物或马尾松松针提取物的指纹图谱检测

1.样品和试剂

1.1样品：葛根提取物（按照实施例一制备）、马尾松松针提取物（按照实施例二制备）。

对照品葛根素（110752-200912）购自中国药品生物制品检定所；莽草酸（119k1295）购自Sigma公司。

1.2试剂

乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)

甲醇、甲酸为分析纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)

纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）

2.供试品溶液制备

取葛根提取物或鲜松叶提取物0.2g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

3.对照品溶液的制备

取适量的对照品，溶于1ml50%（v/v）甲醇水溶液中即得。

4液相色谱条件

仪器：Agilent infinity1290液相色谱仪(Agilent,USA)

色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN 959759-902，Agilent；

流动相：流动相A：0.1%（v/v）甲酸水溶液；流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：

0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈；

15min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈；

25min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈；

40min时，流动相A为60%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为40%的乙腈；

45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈；

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。

柱温为30℃，流速为0.2ml/min，检测波长为250nm，进样体积为1ul；

5、检测结果

葛根提取物的指纹图谱见图3-1、3-2，马尾松松针提取物见图4

葛根提取物的主要化学吸收峰：

1号峰，保留时间RT为13.98min，峰面积为319.10，占总峰面积百分比为1.94%；

2号峰，保留时间RT为16.77min，峰面积为285.02，占总峰面积百分比为1.73%；

3号峰，保留时间RT为17.62min，峰面积为1471.86，占总峰面积百分比为8.95%；

4号峰，保留时间RT为19.98min，峰面积为137.41，占总峰面积百分比为0.84%；

5号峰，保留时间RT为21.17min，峰面积为7577.65，占2号峰，保留时间RT为13.98min，峰面积为319.10，占总峰面积百分比为1.94%；

3号峰，保留时间RT为16.77min，峰面积为285.02，占总峰面积百分比为1.73%；

4号峰，保留时间RT为17.62min，峰面积为1471.86，占总峰面积百分比为8.95%；

5号峰，保留时间RT为19.98min，峰面积为137.41，占总峰面积百分比为0.84%；

7号峰，保留时间RT为21.17min，峰面积为7577.65，占总峰面积百分比为46.08%；

8号峰，保留时间RT为21.74min，峰面积为314.60，占总峰面积百分比为1.91%；

9号峰，保留时间RT为22.10min，峰面积为1283.01，占总峰面积百分比为7.80%；

10号峰，保留时间RT为22.35min，峰面积为1434.14，占总峰面积百分比为8.72%；

11号峰，保留时间RT为23.00min，峰面积为40.62，占总峰面积百分比为0.25%；

12号峰，保留时间RT为23.96min，峰面积为1435.06，占总峰面积百分比为8.73%；

14号峰，保留时间RT为25.52min，峰面积为229.77，占总峰面积百分比为1.40%；

15号峰，保留时间RT为26.38min，峰面积为139.31，占总峰面积百分比为0.85%；

17号峰，保留时间RT为28.13min，峰面积为153.40，占总峰面积百分比为0.93%；

18号峰，保留时间RT为28.91min，峰面积为73.18，占总峰面积百分比为0.45%；

19号峰，保留时间RT为29.80min，峰面积为49.33，占总峰面积百分比为0.30%；

20号峰，保留时间RT为31.09min，峰面积为47.78，占总峰面积百分比为0.29%；

21号峰，保留时间RT为31.84min，峰面积为93.73，占总峰面积百分比为0.57%；

23号峰，保留时间RT为34.06min，峰面积为292.07，占总峰面积百分比为1.78%；

24号峰，保留时间RT为34.81min，峰面积为28.59，占总峰面积百分比为0.17%；

25号峰，保留时间RT为35.12min，峰面积为31.24，占总峰面积百分比为0.19%。

马尾松松针提取物的主要化学吸收峰：

1号峰，保留时间RT为1.99min，峰面积为676.76，占总峰面积百分比为39.55%；

6号峰，保留时间RT为21.08min，峰面积为90.31，占总峰面积百分比为5.28%；

13号峰，保留时间RT为25.54min，峰面积为47.11，占总峰面积百分比为2.75%；

16号峰，保留时间RT为28.18min，峰面积为16.23，占总峰面积百分比为0.95%；

22号峰，保留时间RT为33.25min，峰面积为43.49，占总峰面积百分比为2.54%。

实施例五、松龄血脉康胶囊的指纹图谱的测定

1、样品和试剂

1.1样品松龄血脉康胶囊（批号：081217、110324）；

1.2试剂

乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)

甲醇、甲酸为分析纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)

纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）

2、松龄血脉康胶囊供试品溶液制备

取本品胶囊内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

3、对照品溶液的制备

取适量的对照品，溶于1ml50%（v/v）甲醇水溶液中即得。

4、液相色谱-紫外-质谱分析条件

4.1液相色谱条件

仪器：Agilent infinity1290液相色谱仪(Agilent,USA)

色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN959759-902，Agilent；

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。

4.2质谱条件

仪器：Finnigan LTQ离子肼质谱（电喷雾电离源）(San Jose,CA,USA)。

电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-10V，透镜电压为-100V。全扫描质量范围：150-1000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。

5、检测

5.1溶液稳定性试验

按照上述方法，测定提取后溶液在4℃条件下，放置0、4、16和48h的溶液稳定性，测定结果见表3：

表3溶液稳定性实验结果

以上结果显示所有成分峰面积的RSD%<3%，证明该溶液在4℃条件下48h内稳定。

5.2重现性试验

按上述试验方法，平行测定6份，测定结果见表4：

表4重现性实验结果

以上结果显示平行6份样品间峰面积的RSD%<3%，证明该方法重现性良好，具体检测

结果见图2-1、2-2、2-3。

5.3松龄血脉康胶囊指纹图谱中有效成分的鉴定

本发明还对上述得到的松龄血脉康胶囊指纹图谱中化合物的结构进行了研究，通过液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法，鉴定了上述松龄血脉康胶囊指纹图谱中25个共有吸收峰的化学成分，即通过将其质谱数据同文献的质谱数据进行对比，最终确认其结构。

其中液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法为：将有高效液相色谱仪的紫外检测器流出的液体直接进入质谱仪进行物质测；质谱仪检测条件优选为：质谱仪流速为0.2ml/min。电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-10V，透镜电压为-100V。全扫描质量范围：210-1000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。

所述液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法测定结果详见表2。

表2松龄血脉康胶囊化合物鉴定表

注：“/”表示该化合物在相应的离子模式下没响应，“a”表示化合物通过与对照品对比确定结构。

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被鉴定的25个化合物结构如下：

其中上述化合物：1、莽草酸；2、葛根素-4'-O-D-葡萄糖苷；3、大豆苷元4',7-二葡萄糖苷；4、3'-羟基葛根素；5、3'-羟基葛根素木糖苷；6、（+）-（6s,9R）-9-O-β-D-glucopyranosyloxy-6-hydroxy-3-oxo-α-ionol；7、葛根素；8、葛根素-7-芹菜糖苷；9、3'-甲氧基葛根素；10、葛根素-7-木糖苷；11、3'-羟基葛根素-4'-脱氧葡萄糖苷；12、大豆苷原-4'-葡萄糖苷；13、异落叶松酯素-9-O-木糖苷；14、染料木素-7-O-木糖-8-C-葡萄糖苷；15、异黄酮苷；16、Massonianoside B；17、染料木苷；18、4',6,7-三羟基异黄酮-6-甲氧基-7-O-β-D-木糖基-β-D-葡萄糖苷；19、3'-甲氧基大豆苷；20、3'-乙酰基大豆苷；21、5-羟基-3'-乙酰基大豆苷；22、9'-O-对羟基反式桂皮酰基落叶松脂醇酯；23、大豆苷元；24、鹰嘴豆芽素A；25、6-甲氧基-7-木糖基-染料木苷。

实施例六、松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测

1、样品：按照实施例三制备的松龄血脉康胶囊各批次样品（批号081204、081206、081214、081216、081217、081218、081229、081230、090615、090616、090624、090625、090631、090721、091002、091008、091014、100103、100104、100111、100323、100502、100503、100513、100614、110226、110301、110323、110324、110326、110329、110704、110739、110960）其中松叶和葛根来源于5-6个产地，根据生产进度，随机投料。

2、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich CompanyInc.USA)、甲醇、甲酸为分析纯（Sigma aldrichCompany Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA）

3、仪器：Agilent Infinity 1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。

4、松龄血脉康胶囊供试品溶液制备：取实施例三制备的松龄血脉康胶囊各批次样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN 959759-902，Agilent）；流动相A：0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下：

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。

6、数据分析

共对34批松龄血脉康胶囊进行了指纹图谱检测，其相似度在90%以上，所有图谱平均保留时间、峰面积平均值以及RSD数据见表5。检测谱图见附图5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7。

表5松龄血脉康胶囊指纹图谱检测结果（34批次）

Claims

1.一种药物指纹图谱的测定方法，其特征在于包含以下步骤：

(a)供试品溶液的制备

取药物组合物适量，溶于一定体积比例的醇水溶液中，超声溶解，加上述溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液；

(b)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；检测波长210～300nm；

(c)测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；

其中所述药物组合物为松龄血脉康胶囊、松叶提取物或葛根提取物。

2.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述检测波长为210-300nm，流速为0.2ml/min，柱温为25-35℃，进样体积为1-10ul；优选为检测波长为250nm，流速为0.2ml/min，柱温为30℃，进样体积为1ul。

3.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于供试品溶液制备方法为：取药物组合物0.20~0.25g，置于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液定容至刻度，滤过，即得试品样品溶液；优选为取松龄血脉康胶囊样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取滤液备用。

4.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，所述梯度洗脱程序为：

其中下述比例为体积比

0-3min时，流动相A：流动相B=95:5

15min时，流动相A：流动相B=90:10

20min时，流动相A：流动相B=80:20

40min时，流动相A：流动相B=60:40

45min时，流动相A：流动相B=0:100。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱仪的紫外检测器流出液体直接进入质谱仪进行物质测定，其中质谱仪检测条件优选为：电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；全扫描质量范围：210-1000amu；二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响度强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev；其中所述正离子模式检测条件：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V；负离子模式检测条件：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-10V，透镜电压为-100V。

6.根据权利要求1-4所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为松龄血脉康时，其指纹图谱中含有10个单峰面积占总峰面积百分比超过1.5%的吸收峰，分别为：

1号峰，莽草酸，保留时间RT为1.96min；

2号峰，葛根素-4'-O-D-葡萄糖苷，保留时间RT为13.82min；

3号峰，大豆苷元4',7-二葡萄糖苷，保留时间RT为16.65min；

4号峰，3'-羟基葛根素，保留时间RT为17.50min；

7号峰，葛根素，保留时间RT为21.11min；

8号峰，葛根素-7-芹菜糖苷，保留时间RT为21.71min；

9号峰，3'-甲氧基葛根素，保留时间RT为22.06min；

10号峰，葛根素-7-木糖苷，保留时间RT为22.32min；

12号峰，大豆苷原-4'-葡萄糖苷，保留时间RT为23.91min；

23号峰，大豆苷原，保留时间RT为34.01min。

7.根据权利要求6所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为松龄血脉康时，其指纹图谱中还含有15个单峰面积占总峰面积百分比未超过1.5%的共有指纹峰，分别为：

5号峰，3'-羟基葛根素木糖苷，保留时间RT为19.92min；

13号峰，异落叶松酯素-9-O-木糖苷，保留时间RT为24.96min；

15号峰，异黄酮苷，保留时间RT为26.32min；

16号峰，Massonianoside A/B/E，保留时间RT为27.52min；

17号峰，染料木苷，保留时间RT为28.07min；

19号峰，3'-甲氧基大豆苷，保留时间RT为29.78min；

20号峰，3'-乙酰基大豆苷，保留时间RT为30.89min；

21号峰，5-羟基-3'-乙酰基大豆苷，保留时间RT为31.78min；

22号峰，MassonianosideC/9'-O-对羟基反式桂皮酰基落叶松脂醇酯，保留时间RT为32.67min；

24号峰，鹰嘴豆芽素A，保留时间RT为34.60min；

25号峰，6-甲氧基-7-木糖基-染料木苷，保留时间RT为34.91min。

8.根据权利要求1-4所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为葛根提取物时，其指纹图谱中含有20个指纹峰，分别为：

2号峰，葛根素-4'-O-D-葡萄糖苷，保留时间RT为13.98min；

3号峰，大豆苷元4',7-二葡萄糖苷，保留时间RT为16.77min；

4号峰，3'-羟基葛根素，保留时间RT为17.62min；

5号峰，3'-羟基葛根素木糖苷，保留时间RT为19.98min；

7号峰，葛根素，保留时间RT为21.17min；

8号峰，葛根素-7-芹菜糖苷，保留时间RT为21.74min；

9号峰，3'-甲氧基葛根素，保留时间RT为22.10min；

10号峰，葛根素-7-木糖苷，保留时间RT为22.35min；

12号峰，大豆苷原-4'-葡萄糖苷，保留时间RT为23.96min；

15号峰，异黄酮苷，保留时间RT为26.38min；

17号峰，染料木苷，保留时间RT为28.13min；

19号峰，3'-甲氧基大豆苷，保留时间RT为29.80min；

20号峰，3'-甲氧基大豆苷，保留时间RT为31.09min；

21号峰，5-羟基-3'-乙酰基大豆苷，保留时间RT为31.84min；

23号峰，大豆苷原，保留时间RT为34.06min；

24号峰，鹰嘴豆芽素A，保留时间RT为34.81min；

25号峰，6-甲氧基-7-木糖基-染料木苷，保留时间RT为35.12min。

9.根据权利要求1-4所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为松叶提取物时，其指纹图谱中含有5个指纹峰，分别为：

1号峰，莽草酸，保留时间RT为1.99min；

13号峰，异落叶松酯素-9-O-木糖苷，保留时间RT为25.54min；

16号峰，MassonianosideA/B/E，保留时间RT为28.18min；

22号峰，Massonianoside C/9'-O-对羟基反式桂皮酰基落叶松脂醇酯，保留时间RT为33.25min。