CN104826135B - 利用大鼠血瘀模型筛选复方三七中活血化瘀有效成分、协同与拮抗成分的方法 - Google Patents
利用大鼠血瘀模型筛选复方三七中活血化瘀有效成分、协同与拮抗成分的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及一种在体评价中药药理活性的方法，具体的技术方案是：将中药给予实验动物后，评价药理学指标的变化趋势，在中药作用的最佳时间采集给药动物的生物体液，经适当处理后回注实验动物体内，再评价其药理学指标的变化趋势并与直接给予中药后获取的数据比较，以评价中药对药理学指标响应的时滞效应。本发明结合基于现代分析技术的中药整体药代动力学评价中药药效物质中的效应成分与协同或拮抗成分。
Description
技术领域
本发明涉及中药药理学领域，具体涉及一种在体评价中药药理活性的新方法。
背景技术
中药实验药理方法是中药活性评价领域的重要组成部分，传统的中药实验药理评价方法是体外试验法。体外试验法具有条件可控性强，可在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、受体、基因等方面的全面评价。但体外试验法是用中药的粗提物直接加入反应体系中进行试验所获取的评价结果，在许多情况下该评价结果非但不能与体内试验结果相吻合，而且更不能被临床应用所验证，致使假阳性和假阴性结果不断出现。
鉴于上述情况，日本国立京都医院的田代真一等首次用柴苓灌胃家兔，取其血清加入人成纤维母细胞中培养，发现有抑制成纤维母细胞增殖作用，且有时间性和血清浓度依赖性。继而，Hiroko Iwama等发现小柴胡汤煎剂直接加入细胞培养有致有丝分裂的作用，但用小柴胡汤煎剂灌胃后的动物血清培养则无此作用。进而，田代真一于1988年首次提出了“血清药理学”的概念[1,2]，使用含有中药成分的血清替代中药粗提物进行体外试验，该试验方法在某种程度上使评价结果的可信度大大提高[3]。因为这种血清所含的中药成分是经过体内一系列生物转化后能够真正发挥药理作用的有效成分，同时也包含那些在中药有效成分作用下机体所产生的内源性成分；另外，血清的理化性质与细胞所处的内环境基本相同，克服了中药制剂本身的基质与性质对中药活性评价结果的干扰。
然而，亦有学者对血清药理学提出质疑，提出“加强多层次半体内实验研究”[4]。中药血清药理实验方法存在的主要问题是：①试验用含药血清中的具体成分与组成不明确；②无法评价含药血清中的效应成分的药效作用(协同或拮抗)。
发明内容
为了克服传统血清药理评价方法的上述缺陷，本发明建立了一种用含中药组分的生物体液提取物回注的中药活性评价技术。具体的技术方案是：
(1)制备一定浓度的中药溶液；
(2)给予实验动物由步骤(1)制备的中药溶液，获取药代动力学[5-6]与药效动力学数据[7]；采集特定时间点的动物生物体液；
(3)将步骤(2)采集获得的动物生物体液经适当处理，并回注实验动物体内；获取含药血清回注后的药效动力学数据[7]；
(4)比较由步骤(2)与步骤(3)获取的药效动力学数据，评价中药发生药效的时滞效应[7-8]；
(5)将由步骤(2)获取的药代动力学数据与经步骤(4)获取的时滞效应修正后的步骤(2)的药效动力学数据关联[9-11]，评价中药发挥药效的有效成分、协同与拮抗成分[7-8]。
所述的中药为植物、矿物或动物性中药材、中药复方及中药的各种现代剂型。所述的中药溶液为用中药制成的供口服或注射用的溶液。所述的实验动物优选小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬。所述的生物体液优选血清、血浆。所述的特定时间点优选药理学指标发生显著变化的时间点，更优选药理学指标发生最大变化的时间点。
所述的生物体液经适当处理为经沉淀蛋白、液-液萃取、固相萃取、减压干燥、冷冻干燥等方法处理。
所述的回注优选血管内注射给予实验动物。所述的时滞效应为由于给予所选定中药后，实验动物或其离体脏器所产生的与该中药相关的药理指标变化规律与生物体液提取物中该中药相关的所有可检测成分浓度变化规律之间存在的时间滞后效应。
本发明还提供了基于上述方法原理编制的数据采集与处理程序。所述的数据为检测的药理学指标以及由此衍生出来的中药药效动力学参数或药效物质基础数据。所述的药效动力学参数为起效时间、最大效应时间、效应持续时间。所述的药效物质基础数据为体内移行成分中的效应组分、协同作用组分、拮抗作用组分。所述的体内移行成分为血浆或血清中可检测成分。所述的可检测成分为所有可被HPLC、GC、LC-MSn、GC-MSn、LC-NMR检测的中药原始成分及其在动物体内的代谢产物。
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本发明具有以下特点：
(1)本发明采用含药生物体液提取物回注的“在体”评价技术，使中药活性评价结果更加客观与有效。
(2)本发明结合基于现代分析技术的中药整体药代动力学技术可全面评价中药药效物质组中的效应成分与协同或拮抗成分。
本发明的优点在于克服了传统血清药理实验方法无法评价含药血清中效应成分的药效作用(协同或拮抗)的技术瓶颈，为创新中药的药效物质评价提供客观的数据支持。
附图说明
以下结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是血瘀模型大鼠给予原形中药(三七总皂苷27mg/kg配伍葛根总黄酮54mg/kg)(○)与给予含中药组分的血清提取物(●)后全血黏度变化的效应-时间曲线。
图2是血瘀模型大鼠给予原形药物(三七总皂苷配伍葛根总黄酮)后血浆中44个指标成分(与大鼠全血粘度相关)的整体组合浓度-时间曲线((1)-(13))。
图3是血瘀模型大鼠给予原形药物(三七总皂苷配伍葛根总黄酮)后血浆中44个指标成分(与大鼠全血粘度相关)的整体组合浓度-时间曲线((14)-(26))。
图4是血瘀模型大鼠给予原形药物(三七总皂苷配伍葛根总黄酮)后血浆中44个指标成分(与大鼠全血粘度相关)的整体组合浓度-时间曲线((27)-(39))。
图5是血瘀模型大鼠给予原形药物(三七总皂苷配伍葛根总黄酮)后血浆中44个指标成分的整体组合血浆浓度-全血粘度相关曲线。
图6为给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮后血瘀模型大鼠血浆中44个指标成分的“表观效应浓度”-全血粘度相关曲线。
具体实施方式
实施例一、血瘀模型大鼠给予复方三七后含药血清提取物回注评价其活血化瘀作用
1给予原形中药后药效动力学评价
1.1血瘀模型制备
雄性Wistar大鼠，体质量240±20g，按体质量随机分为1.0～6.0h共9个时间组，每组12只。各组大鼠皮下注射给予盐酸肾上腺素0.8mg/kg(2ml/kg)两次，间隔4h，间隔期间将大鼠置于0℃冰浴中游泳5min，制备大鼠急性血瘀模型。
1.2活血化瘀药效动力学评价
造模后18h，每组大鼠分成两小组，分别经尾静脉注射给予生理盐水溶液(M,模型组)与三七总皂苷(27mg/kg)配伍葛根总黄酮(54mg/kg)(T,给药组)，给药后分别于拟定时间点经腹主动脉取血，用血流变测试仪测定全血黏度。
实验结果数据以均数加减标准差表示，采用SPSS 17.0软件包对实验结果进行方差分析，组间比较采用双侧t检验。结果如表1所示，*表示p<0.05；**表示p<0.01。
表1急性血瘀模型大鼠分别经尾静脉注射给予生理盐水与三七总皂苷(27mg/kg)配伍葛根总黄酮(54mg/kg)后全血黏度的测定值(mPa·s)
为了消除可能存在的系统误差，更客观地反映药物对血瘀模型大鼠的治疗效果，在各个时间点全血黏度平均值的基础上，按下述公式计算出该时间点全血黏度的下降率：
式中，D为大鼠某时间点全血黏度的下降率，为该时间点模型大鼠全血黏度的平均值，为该时间点给药大鼠全血黏度的平均值。以时间为横轴，对全血黏度的下降率作图，得到急性血瘀模型大鼠经尾静脉注射给予三七总皂苷(27mg/kg)配伍葛根总黄酮(54mg/kg)后的药效-时间曲线，如图1所示，全血黏度下降率的最大值出现在给药后2.0h。
2含药血清提取物回注药效动力学评价
2.1含药血清的制备
雄性Wistar大鼠，体质量240±20g，按体质量随机分为空白血清组和含药血清组，每组36只，按“1.1”条下方法复制急性血瘀模型。造模后18h，空白血清组大鼠经尾静脉注射给予生理盐水溶液，含药血清组大鼠给予三七总皂苷(54mg/kg)配伍葛根总黄酮(108mg/kg)，给药2.0h后，各组大鼠由眼眶静脉丛取血约4.5ml于试管中，37℃水浴静置30min。待血液自然凝固后，于室温下10000r/m离心10min，分离血清。-80℃冷冻保存，备用。
2.2含药血清提取物的制备
血清100ml(相当于36只240±20g大鼠的回注量)，分别加入含0.1％甲酸的乙腈200ml，涡旋混合2min，超声(250W,40kHz)提取15min后，于4℃下15000r/m离心15min，分离上清液；上清液减压回收乙腈至原体积的1/3，于-80℃下预冻，-50℃下冷冻干燥。
2.3含药血清提取物回注溶液的制备
取含药血清提取物，加入0.15mol/L氢氧化钠溶液47ml，超声(250W,40kHz)处理15min溶解，用5mol/L盐酸溶液调pH至7.4，室温下15000r/m离心15min，分离上清液，用于静脉注射。
空白血清回注溶液与含药血清回注溶液同法操作，临用现配。
2.3含药血清提取物回注药效动力学评价
雄性Wistar大鼠，体质量240±20g，随机分为0.5～4.0h共6个时间组，每组12只。各组按上述方法复制急性血瘀模型，造模后18h，将每组大鼠按体质量平均分成两小组，分别经尾静脉注射给予空白血清回注溶液(MS)与含药血清回注溶液(Ts)。给药后，大鼠按各组拟定时间点经腹主动脉取血，并于3h内完成全血黏度的测定(方法同“1.2”条下)。
实验结果数据以均数加减标准差表示，采用SPSS 17.0软件包对实验结果进行方差分析，组间比较采用双侧t检验。结果如表2所示，*表示p<0.05。
表2急性血瘀模型大鼠分别经尾静脉注射给予空白血清提取物与含药血清提取物后全血黏度的测定值(mPa·s)
以时间为横轴，对全血黏度的下降率作图，得到急性血瘀模型大鼠经尾静脉注射给予2.0h含药血清提取物后药效-时间曲线，如图1所示，全血黏度下降率的最大值出现在给药后1.0h。经统计学检验发现，按照本发明制备的含中药组分的生物体液提取物回注给生物体后，可发挥明显的药理效应。
3中药药理作用时滞效应与药效作用评价
3.1药理作用时滞效应评价
通过比较直接给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮与给予含药血清的效应-时间曲线，发现急性血瘀模型大鼠经尾静脉注射给予三七总皂苷(27mg/kg)配伍葛根总黄酮(54mg/kg)后，发生药理效应存在1.0h的时间滞后。当进行药代动力学(PK)-药效动力学(PD)相关性评价时应进行PD的时间修正。
3.2整体药代动力学评价
取“1.1”条下不同时间点血浆样品，采用UPLC-MS/MS电喷雾离子源(ESI)，用正离子模式下的多反应监测(MRM)技术，测定44血浆中移行成分的浓度(各待测成分与内标物的定量参数见表1，UPLC-MS/MS色谱图见图2-4)，进行药代动力学评价；并对各时间点血浆组分浓度进行整体组合为“表观效应浓度”。结果见图5。
表1.44个血浆中已形成与内标物的UPLC-MS/MS定量分析MRM参数
3.3 PK-PD相关分析与药效组分评价
将“1.2”条下的药效动力学的效应-时间曲线经时滞效应修正后，再与“3.2”条下的“表观效应浓度”-时间曲线进行相关分析，如图4所示，PK-PD之间存在显著的相关性。并由此确定三七总皂苷配伍葛根总黄酮后，44个血浆移行成分中：
(1)与血浆粘度下降正相关的组分：未知化合物V、未知化合物VII、未知化合物IX、人参皂苷Rb1、七叶胆甙-XII、人参皂苷Rg2、三七皂苷Fc/人参皂苷Ra1/Ra2、人参皂苷Rb2/Rb3、人参皂苷Rd等9个成分。其中：人参皂苷Rb1、七叶胆甙-XII、人参皂苷Rg2等4个成分是降低血浆粘度的主要药效物质。
(2)与血浆粘度下降程负相关的组分：染料木素-8-C-(6”-O-芹菜糖基)-葡萄糖苷、未知化合物①、大豆苷元-4’-O-葡萄糖苷和未知化合物III等4个成分(具有拮抗作用)。
(3)与血浆粘度下降无显著相关性的组分：大豆苷元-3’-甲氧基-4’,7-O-葡萄糖苷、3’-甲氧基-6”-O-木糖/芹菜糖基葛根素和大豆苷元等3个成分。
(4)与血浆粘度下降具有一定相关性的组分：其他28个成分与血浆粘度下降存在一定的相关性(具有协同作用)。
Claims (1)
1.利用大鼠血瘀模型筛选复方三七中活血化瘀有效成分、协同与拮抗成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)给予原形中药后药效动力学评价
血瘀模型制备
雄性Wistar大鼠，体质量240±20g，按体质量随机分为1.0～6.0h共9个时间组，每组12只，各组大鼠皮下注射给予盐酸肾上腺素0.8mg/kg两次，间隔4h，间隔期间将大鼠置于0℃冰浴中游泳5min，制备大鼠急性血瘀模型；
活血化瘀药效动力学评价
造模后18h，每组大鼠分成两小组，模型组分别经尾静脉注射给予生理盐水溶液，给药组分别经尾静脉注射给予三七总皂苷27mg/kg配伍葛根总黄酮54mg/kg，给药后分别于拟定时间点经腹主动脉取血，用血流变测试仪测定全血黏度；
(2)含药血清提取物回注药效动力学评价
含药血清的制备
雄性Wistar大鼠，体质量240±20g，按体质量随机分为空白血清组和含药血清组，每组36只，按“血瘀模型制备”项下方法复制急性血瘀模型，造模后18h，空白血清组大鼠经尾静脉注射给予生理盐水溶液，含药血清组大鼠给予三七总皂苷54mg/kg配伍葛根总黄酮108mg/kg，给药2.0h后，各组大鼠由眼眶静脉丛取血约4.5ml于试管中，37℃水浴静置30min，待血液自然凝固后，于室温下10000r/m离心10min，分离血清，-80℃冷冻保存，备用；
含药血清提取物的制备
相当于36只240±20g大鼠的回注量的血清100ml，分别加入含0.1％甲酸的乙腈200ml，涡旋混合2min，250W,40kHz超声提取15min后，于4℃下15000r/m离心15min，分离上清液；上清液减压回收乙腈至原体积的1/3，于-80℃下预冻，-50℃下冷冻干燥；
含药血清提取物回注溶液的制备
取含药血清提取物，加入0.15mol/L氢氧化钠溶液47ml，250W,40kHz超声处理15min溶解，用5mol/L盐酸溶液调pH至7.4，室温下15000r/m离心15min，分离上清液，用于静脉注射；
含药血清提取物回注药效动力学评价
雄性Wistar大鼠，体质量240±20g，随机分为0.5～4.0h共6个时间组，每组12只，各组按上述方法复制急性血瘀模型，造模后18h，将每组大鼠按体质量平均分成两小组，分别经尾静脉注射给予空白血清回注溶液与含药血清回注溶液，给药后，大鼠按各组拟定时间点经腹主动脉取血，并于3h内完成全血黏度的测定
(3)中药药理作用时滞效应与药效作用评价
药理作用时滞效应评价
通过比较直接给予三七总皂苷配伍葛根总黄酮与给予含药血清的效应-时间曲线，发现急性血瘀模型大鼠经尾静脉注射给予三七总皂苷27mg/kg配伍葛根总黄酮54mg/kg后，发生药理效应存在1.0h的时间滞后，当进行药代动力学(PK)-药效动力学(PD)相关性评价时应进行PD的时间修正；
整体药代动力学评价
取“血瘀模型制备”项下不同时间点血浆样品，采用UPLC-MS/MS电喷雾离子源ESI，用正离子模式下的多反应监测MRM技术，测定44血浆中移行成分的浓度，进行药代动力学评价；并对各时间点血浆组分浓度进行整体组合为“表观效应浓度”；
PK-PD相关分析与药效组分评价
将“活血化瘀药效动力学评价”项下的药效动力学的效应-时间曲线经时滞效应修正后，再与“整体药代动力学评价”项下的“表观效应浓度”-时间曲线进行相关分析，以筛选出复方三七中发挥药效的有效成分、协同与拮抗成分。
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