CN103123343B - 一种松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法，该方法包括，采用乙腈：甲酸水为流动相，梯度洗脱程序通过高效液相色谱检测得到松龄血脉康胶囊的指纹图谱，该方法各有效成分的峰能够分离效果理想，没有重叠且峰形优异，峰强度都较大，检测时间合理且检测效率高效，重复性、稳定性好。

Description

一种松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法。 

背景技术

《中华人民共和国药典》（2010版）第一部800-801页记载松龄血脉康胶囊处方及其制备工艺，其处方为：鲜松叶、葛根加水煎煮二次，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，喷雾干燥，加入珍珠层粉和适量淀粉、滑石粉和硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。功能主治为：平肝潜阳、镇心安神，用于肝阳上亢所致的头痛、眩晕、急躁易怒、心悸、失眠；高血压病及原发性高脂血症见上述症候者。自1998年上市以来，松龄血脉康降压作用确切,平稳持久,特别对于收缩压和收缩压负荷值、有效控制血压晨峰现象、降脂作用优于其他降压药,且无不良反应；能够通过增加抑制凋亡基因Bcl-2蛋白的表达,拮抗细胞凋亡,从而起到脑保护作用；同时能够通过降低全血高切黏度、血浆黏度、全血还原黏度来改善血黏度。 

中药葛根为豆科多年生落叶藤本植物野葛或甘葛藤的根。始载于《神农本草经》，味甘辛，性凉，归脾、胃经，有发表解肌，透疹生津，升阳止泻的功用。多用于治疗外感表证、麻疹不透、烦热消渴、泄泻等症。通过对葛根主要成分的提取、分离和鉴定，发现葛根的主要成分为如下几类[郭建平,孙其荣.葛根化学成分及临床应用研究概况.药学实践杂志,1996,14(3):146]：①异黄酮类，主要包括大豆苷元(大豆素、大豆黄素、黄豆苷元)、大豆苷、葛根素等；②葛根苷类，主要包括葛根苷A、B、C三种，它们被认为是二氢查尔酮的衍生物；③三贴皂苷类，主要包括以葛根皂醇A、B、C命名的7种新型齐墩果烷型皂角精醇、槐二醇、大豆皂醇B、大豆苷醇A等；④生物碱及其他化合物。 

松针是我国传统中药，在历代本草中均有记载。《名医别录》谓其：“主风湿疮，生毛发，安五脏”。《本草纲目》记载：“松叶，气味苦、温、无毒，久服令人不老，轻身益气，主风湿疹，生毛发，安五脏，守中，不饥延年”。饮用松针茶可使高血压、高血脂等心脑血管疾病以及糖尿病的症状得到缓解[张志琴，肖培云，刘光明.松针的化学成分和药理活性研究进展[J]，现代药物与临床,2011,26(4):278-281]。张旭等[张旭，及元乔，李萍等.松针的化学成分研究[J]，天然产物研究与开发,2006,18(4):621-623]从马尾松松叶中提取到有机酸和槲皮素，槲皮素具有广泛的药理作用，有抗氧化及清除氧自由基作用、能降低血压，保护心肌缺血再灌注损伤，有免疫增强功能等作用。松针中主要成分分为四大类，挥发油、黄酮类、木脂素及色素维生素。Shen等[Shen ZB,OlofT.Flavonoid glycosides from needles of Pinus assoniana,Phytochemistry[J],1985,24(1):155–158]从马尾松松针中分离出7个黄酮类成分，有花旗松素、花旗松素-3-O-β-D-葡萄糖苷、儿茶素、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷等，王巍等[王巍，王晓华，尹江峰等.马尾松松针的黄酮类化学成分的分 离鉴定[J]，中国医院药学杂志,2008,28(7):549-552]从马尾松松针的60%乙醇提取物的醋酸乙酯和正丁醇萃取部位分离得到7个黄酮类化合物，分别是3,5-二羟基-4-甲氧基二氢黄酮-7-O-α-L-鼠李糖基（1→6）-β-D-葡萄糖苷、3,5-二羟基-4-甲氧基二氢黄酮-7-O-β-D-葡萄糖基（1→2）-α-L-鼠李糖苷、4,5-二羟基二氢黄酮-7-O-L-鼠李糖基（1→2）-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-吡喃葡萄糖苷、槲皮素和双氢槲皮素；松针中一般含有丰富的叶绿素、胡萝卜素和维生素E及维生素C，远高于一般蔬菜和水果[胡丰林，陆瑞利.松针的利用价值分析[J]，生物学杂志,1996(2):25-26]。 

珍珠是祖国医药学遗产中的精华,我国早有服用珍珠粉医疗疾病、保健身体的经验,自晋代葛洪著《抱朴子》及《肘后备急方》记载以来,在历代医药文献对珍珠的功用有过明确的论述,总结为珍珠具有镇心定惊、清肝除翳、收敛生肌的功效[卢慧卿.珍珠的药用价值[J]，海洋药物,1987,(2):38]。珍珠层粉的成分除含有少量氨基酸外，绝大部分为无机成分如碳酸钙、氧化钙及少量氧化锌、氧化钠、氧化钾、氧化镁等，成分较为简单[卢慧卿,杨京玉,丛英杰,萧玉霞,张丽彦.珍珠粉、珍珠层粉药用价值的比较[J]，天然产物研究与开发,1991,3(3):35-42]。 

随着中药现代化、国际化的不断发展，现代分析技术如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、X光衍射法、毛细管电泳、分子生物技术以及其他分析方法不断在中药鉴定中药质控等方面的应用，建立了一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量检测以及对其复杂成分检出的方法即指纹图谱。目前,美国FDA,英国和印度草药典，德国药用植物学会，加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质量检测方法；2000年第4季度我国下发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》率先要求中药注射剂推行指纹图谱的质量检测办法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成,每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。其次，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗,体现了控制某张中药复方指纹图谱,就可确保其相应药效。而松龄血脉康胶囊是由葛根、鲜松叶和珍珠层粉组成，其治疗效果也已经得到临床上充分印证，其中葛根和鲜松叶所含组分众多，如何保证药物的质量，控制其疗效，需要对它的活性物质群进行检测，因此现代手段指纹图谱的检测变得尤为重要。 

发明内容

本发明为了更好检测松龄血脉康胶囊的指纹图谱，提供了一种有效的指纹图谱检测方法。 

本发明一方面提供了一种松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤： 

1）松龄血脉康对照样品溶液的制备 

称适量松龄血脉康，溶于一定体积比例的醇水溶液中，超声溶解，加上述一定体积比例的 醇水溶液定容，摇匀、取适量溶液过滤，取滤液； 

2）松龄血脉康对照指纹图谱的测定 

吸取上述对照样品溶液注入液相色谱，使用高效液相色谱法进行测定，得到松龄血脉康对照指纹图谱，色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；检测波长210～300nm； 

3）松龄血脉康待测产品的检测和质量评价 

取松龄血脉康待测产品，按照上述1）、2）步骤中的条件测定待测产品的指纹图谱；并将待测产品的指纹图谱与上述对照品的指纹图谱进行比较，识别其吸收峰的数量，以确定产品质量是否合格。 

上述的松龄血脉康的指纹图谱检测方法中所述步骤1）中松龄血脉康对照品的制备步骤优选为为：称取松龄血脉康胶囊内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30-40分钟，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜，取滤液，即得。 

所述松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法（2）步骤中所述色谱条件进一步优选为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为乙腈； 

所述梯度洗脱程序优选为： 

0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈； 

15min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈； 

25min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈； 

40min时，流动相A为60%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为40%的乙腈； 

45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈； 

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。 

本发明采用高效液相色谱法测定获得的松龄血脉康胶囊对照品指纹图谱中含有5个单峰面积占总峰面积百分比超过5%的吸收峰，分别是： 

3号峰，平均保留时间RT为17.56min，RSD为1.00%，峰面积为323.99，RSD为16.29%； 

4号峰，平均保留时间RT为21.14min，RSD为0.41%，峰面积为5246.75，RSD为2.93%； 

5号峰，平均保留时间RT为22.08min，RSD为0.36%，峰面积为922.34，RSD为3.65%； 

6号峰，平均保留时间RT为22.33min，RSD为0.34%，峰面积为1024.51，RSD为20.99%； 

7号峰，平均保留时间RT为23.93min，RSD为0.32%，峰面积为868.78，RSD为3.43%。 

本发明采用高效液相色谱法测定获得的松龄血脉康胶囊对照品指纹图谱中含有7个单峰面 积占总峰面积的百分比超过2.0%的吸收峰，分别是： 

1号峰，平均保留时间RT为1.96min，RSD为0.09%，峰面积为323.99，RSD为16.29%； 

2号峰，平均保留时间RT为13.92min，RSD为0.72%，峰面积为245.82，RSD为19.76%； 

3号峰，平均保留时间RT为17.57min，RSD为1.16%，峰面积为844.71，RSD为6.11%； 

4号峰，平均保留时间RT为21.14min，RSD为0.41%，峰面积为5246.75，RSD为2.93%； 

5号峰，平均保留时间RT为22.08min，RSD为0.36%，峰面积为922.34，RSD为3.65%； 

6号峰，平均保留时间RT为22.33min，RSD为0.34%，峰面积为1024.51，RSD为20.99%； 

7号峰，平均保留时间RT为23.93min，RSD为0.32%，峰面积为868.78，RSD为3.43%。 

本发明采用如下方法检测松龄血脉康胶囊的指纹图谱：取待测松龄血脉康胶囊，采用与松龄血脉康胶囊对照品的制备方法、色谱条件、测定方法完全相同的方法进行测定，获取指纹图谱，将待测品指纹图谱和对照品指纹图谱比较，二者图谱有5个或5个以上相同的吸收峰时，认为松龄血脉康胶囊待测品质量合格。 

优选，将待测品指纹图谱和对照品指纹图谱比较，二者图谱有7个或7个以上相同的吸收峰时，认为松龄血脉康胶囊待测品质量合格。 

同时本申请发明人考察获知，当采用甲酸水-乙腈体系作为流动相时，尤其是0.1%（v/v）甲酸水溶液更适合于高效液相色谱-质谱联用检测松龄血脉康胶囊，松龄血脉康胶囊中主要活性物质能达到较理想的分离，没有重叠，且峰形优异。 

本申请发明人通过二极管阵列检测器（DAD检测器检测）检测松龄血脉康吸收波长，获知在210-250nm处均有吸收，其中当检测波长为250nm时样品中的各个成分均有吸收且主要化合物具有较强吸收，且出峰结果稳定。 

本申请发明人还考察了不同提取液对待测品的提取效果对检测结果的影响，包括H₂O、25%（v/v）甲醇、50%（v/v）甲醇、75%（v/v）甲醇、和100%甲醇对提取效率的影响，结果表明，H₂O、25%（v/v）甲醇、50%（v/v）甲醇、75%（v/v）甲醇、和100%甲醇对提取效率无明显区别，出峰数量一致，其检测结果均较好，但50%（v/v）甲醇的提取率较其他溶剂略有提高。 

附图说明

图1对照品色谱图（1为莽草酸，4为葛根素） 

图2松龄血脉康胶囊色谱图 

图3葛根提取物图谱全图 

图4马尾松松叶提取物图谱 

图5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7松龄血脉康胶囊指纹图谱 

具体实施方式

以下实施方式仅是对本发明的进一步说明，并不能作为对本发明保护范围的进一步限定。 

实施例一、葛根提取物的制备 

称取葛根加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣再加入6倍量水（折干含量），同法提取1.5小时，过滤，合并2次滤液，浓缩至适当，喷雾干燥，得到葛根浸膏粉。 

实施例二、马尾松松针提取物的制备 

称取鲜松叶加入8倍量沸水，称定重量，煮沸提取1.5小时，提取过程中每20分钟称重一次并补水至初始重量，提取完成后趁热用200目筛网过滤药液，药渣再加入6倍量水（折干含量），同法提取1.5小时，过滤，合并2次滤液，浓缩至适当，喷雾干燥，得到松叶浸膏粉。 

实施例三、松龄血脉康胶囊的制备 

原料药重量配比为： 

鲜松叶 3600g 葛根 600g 珍珠层粉 90g 

取上述用量配比的鲜松叶、葛根药材，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮1.5小时，第二次加6倍量的水，煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，并将滤液减压浓缩成相对密度在70℃时检测为1.2的浸膏，取浸膏液进行喷雾干燥(进塔风温220℃，出塔风温110℃)得干浸膏粉，加入珍珠层粉和适量的淀粉、滑石粉和硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。 

实施例四、葛根提取物或马尾松松针提取物的液相图谱检测 

1.样品和试剂 

1.1样品：葛根提取物（按照实施例一制备）、马尾松松针提取物（按照实施例二制备）。 

对照品葛根素（110752-200912）购自中国药品生物制品检定所；莽草酸（119k1295）购自Sigma公司。 

1.2试剂 

乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA) 

甲醇、甲酸为分析纯（Sigma aldrich Company Inc.USA) 

纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA） 

2.供试品溶液制备 

取葛根提取物或鲜松叶提取物0.2g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。 

3.对照品溶液的制备 

取适量的对照品，溶于1ml50%（v/v）甲醇水溶液中即得。 

4.液相色谱-紫外-质谱分析条件 

5.1液相色谱条件 

仪器：Agilent infinity1290液相色谱仪(Agilent,USA) 

色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN959759-902，Agilent； 

流动相：流动相A：0.1%（v/v）甲酸水溶液；流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下： 

0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈； 

15min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈； 

25min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈； 

40min时，流动相A为60%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为40%的乙腈； 

45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈； 

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。 

柱温为30℃，流速为0.2ml/min，检测波长为250nm，进样体积为1ul； 

5、检测结果 

葛根提取物的指纹图谱见图3，马尾松松针提取物见图4 

葛根提取物的主要化学吸收峰： 

1号峰，平均保留时间RT为13.98min，RSD为1.93%，占总峰面积百分比为1.94%； 

2号峰，平均保留时间RT为17.62min，RSD为1.00%，占总峰面积百分比为8.95%； 

3号峰，平均保留时间RT为21.17min，RSD为0.34%，占总峰面积百分比为46.08%； 

4号峰，平均保留时间RT为22.10min，RSD为0.29%，占总峰面积百分比为7.80%； 

5号峰，平均保留时间RT为22.35min，RSD为0.26%，占总峰面积百分比为8.72%； 

6号峰，平均保留时间RT为23.96min，RSD为0.25%，占总峰面积百分比为8.73%； 

马尾松松针提取物的主要化学吸收峰： 

1号峰，平均保留时间RT为1.99min，RSD为1.93%，占总峰面积百分比为39.55%； 

实施例五、松龄血脉康胶囊指纹图谱的检测 

1、样品松龄血脉康胶囊对照品（批号：081215）由成都康弘制药有限公司提供。 

对照品葛根素（110752-200912）购自中国药品生物制品检定所；莽草酸（119k1295）购自Sigma公司。 

2、试剂 

乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA) 

甲醇、甲酸（Sigma aldrich Company Inc.USA) 

超纯水自制 

3、仪器 

Agilent Infinity1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。 

4、色谱柱 

Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN 959759-902，Agilent； 

5、对照品溶液的制备 

取适量的对照品，溶于1ml50%甲醇水中即得。 

6、供试品溶液制备 

取松龄血脉康胶囊内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 

7、检测 

（1）液相色谱条件 

仪器：Agilent infinity 1290液相色谱仪(Agilent,USA) 

色谱柱：Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN959759-902，Agilent； 

流动相：流动相A：0.1%（v/v）甲酸水溶液；流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下： 

0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈； 

15min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈； 

25min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈； 

40min时，流动相A为60%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为40%的乙腈； 

45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈； 

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。 

柱温为30℃，流速为0.2ml/min，检测波长为250nm，进样体积为1ul； 

（2）质谱条件 

仪器：Finnigan LTQ离子肼质谱（电喷雾电离源）(San Jose,CA,USA)。 

电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。正离子模式下：喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。负离子模式下：喷雾电压5kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为-10V，透镜电压为-100V。全 扫描质量范围：150-1000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度强度最高的3个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。 

（3）检测 

3.1溶液稳定性试验 

按照上述方法，测定提取后溶液在4℃条件下，放置0、4、16和48h的溶液稳定性，测定结果见表1： 

表1溶液稳定性实验结果 

以上结果显示所有成分峰面积的RSD%<3%，证明该溶液在4℃条件下48h内稳定。 

3.2重现性试验 

按上述试验方法，平行测定6份，测定结果见表2： 

表2重现性实验结果 

以上结果显示平行6份样品间峰面积的RSD%<3%，证明该方法重现性良好。质谱鉴定结果见表3： 

表3质谱鉴定结果 

文献： 

[1]刘布鸣,林霄.莽草酸的质谱学研究[J],广西科学院学报,2006,22(S):469～470,474; 

[2]董英,徐斌，林琳，查青.葛根的化学成分研究[J],食品与机械，2005,21(6):85-88,100; 

[3]Junei K,Junichi F,Junko C.Studies on the constituents of Pueraria lobata III.Isoflavonoids and related compounds in the roots and the voluble stems[J].Chem.Pharm Bull,1987,35(12):4846～4850; 

[4]kazohiro Hirakura,Makoto Morita,Kaoru Nakajima,et al.Phenolic glucosides from the root of Pueraria lobala[J].Phytochemistry,1997,46(5):92; 

[5]Koichi Takeya,Hideji Itokawa.Isoflavonoids and the other constituents in callus tissues of pueraria lobala[J].Chem.Pharm Bull,1982,30(4):1496; 

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[7]Hirakura Kazuhiro,Morita Makoto,Nakajima Kaoru.Phenolic glucosides from the root of Pueraria lobata[J].Phytochemistry,1997(5):921～928; 

[8]SANG Yi2shu,SHI Hai2mingz,Min Zhi2da.Studies on chem ical constituents from root of Pueraria omeiensis(Ⅱ)[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2002(9):776～778; 

[9]赵楠,王龙星,易进海,肖红斌.葛根总黄酮提取物中30种异黄酮的HPLC-MS鉴定,《大连国际色谱学术报告会和展览会文集》2007年,016-42:6-8; 

[10]曹钟灵，李建北，张东明.葛属植物中异黄酮类化合物的研究进展〔J〕.中药材，2005,28(1):67～71; 

[11]Prasain JK,Jones K,Kirk M,Wilson L,Smith-Johnson M,Weaver C,Banes S.Profiling and quantification of isoflavonoids in kudzu dietary supplements by high-performance liquid chromtography and electrospray ionization tandem mass spectrometry.J Agric Food Chem.2003 Jul 16;51(15):4213-4218 

实施例六、松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测 

1、样品：按照实施例三制备的松龄血脉康胶囊各批次样品（批号081204、081206、081214、081216、081217、081218、081229、081230、090615、090616、090624、090625、090631、090721、091002、091008、091014、100103、100104、100111、100323、100502、100503、100513、100614、110226、110301、110323、110324、110326、110329、110704、110739、110960），其中松叶和葛根来源于5-6个产地，根据生产进度，随机投料。 

2、试剂：乙腈（HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)、甲醇、甲酸为分析纯（Sigma aldrich Company Inc.USA)、纯净水经Milli-Q纯水系统自制（Millipore Bedford,MA,USA） 

3、仪器：Agilent Infinity1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。 

4、松龄血脉康胶囊供试品溶液制备：取实施例三制备的松龄血脉康胶囊各批次样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30min，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。 

5、色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，150*2.1mm，SN959759-902，Agilent）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，按梯度洗脱，洗脱程序如下： 

0-3min时，流动相A为95%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5%的乙腈； 

15min时，流动相A为90%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为10%的乙腈； 

25min时，流动相A为80%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为20%的乙腈； 

40min时，流动相A为60%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为40%的乙腈； 

45min时，流动相A为0%的0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%的乙腈； 

45min开始冲洗并平衡色谱柱15min。 

柱温为30℃，流速为0.2ml/min，检测波长为250nm，进样体积为1ul； 

6、数据分析 

共对34批松龄血脉康胶囊进行了指纹图谱检测，其相似度在90%以上，所有图谱平均保留时间、峰面积平均值以及RSD数据见表4。其中十批次检测谱图见附图5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7。 

表4松龄血脉康胶囊指纹图谱检测结果（34批次） 

Claims (2)

1.一种松龄血脉康胶囊的指纹图谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）松龄血脉康样品溶液的制备：称取松龄血脉康胶囊样品内容物0.25g于25ml量瓶中，加入50%（v/v）甲醇水溶液约20ml，超声30分钟，加50%（v/v）甲醇水溶液至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜，取滤液，即得；

2）松龄血脉康指纹图谱的测定：吸取上述样品溶液注入液相色谱，使用高效液相色谱法进行测定，色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为乙腈；检测波长210～300nm；其中所述梯度洗脱程序为：

0-3min时，流动相A：流动相B=95:5

15min时，流动相A：流动相B=90:10

25min时，流动相A：流动相B=80:20

40min时，流动相A：流动相B=60:40

45min时，流动相A：流动相B=0:100；

其中所述松龄血脉康的指纹图谱中含有5个单峰面积占总峰面积百分比超过5%的吸收峰，分别是：

3号峰，平均保留时间RT为17.56min，RSD为1.00%，峰面积为323.99，RSD为16.29%；

4号峰，平均保留时间RT为21.14min，RSD为0.41%，峰面积为5246.75，RSD为2.93%；

5号峰，平均保留时间RT为22.08min，RSD为0.36%，峰面积为922.34，RSD为3.65%；

6号峰，平均保留时间RT为22.33min，RSD为0.34%，峰面积为1024.51，RSD为20.99%；

7号峰，平均保留时间RT为23.93min，RSD为0.32%，峰面积为868.78，RSD为3.43%。

2.根据权利要求1所述的松龄血脉康的指纹图谱检测方法，其特征在于所述松龄血脉康胶囊的指纹图谱中含有7个单峰面积占总峰面积的百分比超过2.0%的吸收峰，分别是：

1号峰，平均保留时间RT为1.96min，RSD为0.09%，峰面积为323.99，RSD为16.29%；

2号峰，平均保留时间RT为13.92min，RSD为0.72%，峰面积为245.82，RSD为19.76%；

3号峰，平均保留时间RT为17.57min，RSD为1.16%，峰面积为844.71，RSD为6.11%；

4号峰，平均保留时间RT为21.14min，RSD为0.41%，峰面积为5246.75，RSD为2.93%；

5号峰，平均保留时间RT为22.08min，RSD为0.36%，峰面积为922.34，RSD为3.65%；

6号峰，平均保留时间RT为22.33min，RSD为0.34%，峰面积为1024.51，RSD为20.99%；

7号峰，平均保留时间RT为23.93min，RSD为0.32%，峰面积为868.78，RSD为3.43%。

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