CN102058814B - 菖蒲四味总黄酮提取物及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种菖蒲四味黄酮提取物的制备和检测方法，本发明中菖蒲四味黄酮提取物的原料药组成为：高良姜200-600重量份、紫硇砂100-300重量份、木香50-150重量份、石菖蒲50-150重量份；本发明菖蒲四味黄酮提取物的制备方法：可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1)溶剂萃取法；(2)大孔吸附树脂法；(3)聚酰胺法；(4)超临界CO₂流体萃取法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法和聚酰胺色谱法。

Description

菖蒲四味总黄酮提取物及其制备

技术领域

本发明涉及一种蒙药，特别涉及菖蒲四味总黄酮提取物的制备、检测以及应用。

背景技术

菖蒲四味由高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲4味中药组成，蒙医临床较常用，传统蒙医药理论认为菖蒲四味具有镇“巴达干赫依”，消喘止痛的功能。用于治疗膈肌痉挛，胸闷气短，胸肋刺痛，消化不良。菖蒲四味中主要含有黄酮类、苯丙素类、蒽醌类、生物碱、萜类等成分，但是迄今未见涉及菖蒲四味中的黄酮提取及其制备方法和用途的专利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菖蒲四味黄酮提取物的制备和检测方法，还提供一种以菖蒲四味黄酮为活性成分的药物或功能性食品。

本发明中菖蒲四味黄酮提取物的原料药组成为：

高良姜200-600重量份  紫硇砂100-300重量份  木香50-150重量份  石菖蒲50-150重量份；

本发明中菖蒲四味黄酮提取物的原料药组成优选为：

高良姜400重量份、紫硇砂200重量份、木香100重量份、石菖蒲100重量份；

本发明菖蒲四味黄酮提取物的原料药，可以是市售菖蒲四味中各味药材的饮片，也可以是这些植物的茎、叶、花穗、果实、地下根茎及根等任一部位或全部植株，优选的药材来源为：姜科山姜属植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)的干燥根茎，紫硇砂(蒙名：乌莫黑达布素，卡如萨。本品为紫色石盐(Halitum violaceum)的块状结晶体。菊科植物木香(Aucklandia lappa Decne.)干燥根、天南星科植物石菖蒲(Acorustatarinowii Schott)的干燥根茎。其中所述的菖蒲四味各味药材包括未经任何炮制处理的原药材、饮片以及炮制品。

本发明菖蒲四味黄酮提取物的制备方法：可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1)溶剂萃取法；(2)大孔吸附树脂法；(3)聚酰胺法；(4)超临界CO₂流体萃取法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法和聚酰胺色谱法。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1)提取：所用溶剂可以是水或醇类、酮类及脂类溶剂，或这些溶剂组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂。提取方法可以是煎煮法、冷浸法、渗漉法、加热回流法、超声提取法、微波提取法、高压提取法等。优选的提取工艺为：菖蒲四味复方药材加30％-90％乙醇，回流提取2-3次，每次1-2小时，溶剂用量为5-15L/Kg。

(2)过滤：包括离心法、抽滤法、超滤法、压滤法等方法，可使用以下任意一种澄清剂或其组合：醇沉剂，高岭土，明胶，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。

(3)浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发法、旋转蒸发及减压法、煎煮浓缩法等。

(4)干燥：包括真空干燥法、喷雾干燥法、冷冻干燥法等。

本发明菖蒲四味黄酮提取物的制备方法包括如下方法中的一种或几种：

1、溶剂萃取法：取菖蒲四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40％-80％乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1∶3-1∶10，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，进行萃取2-4次，除去脂溶性杂质，再用中等极性的溶剂，溶剂用量为1-3倍提取物的水溶液，经2-5次萃取获得其中的总黄酮成分，得到菖蒲四味黄酮提取物；

2、大孔吸附树脂法：取菖蒲四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40％-80％乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶2.5-1∶10，通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶4～1∶13，1-5倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；5-12倍树脂体积的30％-90％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物；

其中所用的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型，如AB-8、D101、D4020、HPD400、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等。其中所用的洗脱剂为水或含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为0～100％的乙醇。

3、聚酰胺法：取菖蒲四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40％-80％乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶2.5-1∶10，通过相当生药量的6-10体积倍的30-90目聚酰胺，吸附流速2BV/h，聚酰胺柱径高比为1∶4～1∶13，1-5倍聚酰胺体积的水洗脱，流速为2～6BV/h；5-10倍聚酰胺体积的50％-90％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集50％-90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物；

4、超临界CO₂流体萃取法：取菖蒲四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，采用超临界流体萃取，加60％-80％乙醇作夹带剂，萃取温度为40-45℃，压力为20-30MPa，静态浸泡时间为2-4h，动态循环2-4h，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂萃取除去脂溶性杂质，得菖蒲四味黄酮提取物；

本发明菖蒲四味黄酮提取物的制备方法优选为如下方法中的一种或几种：

取菖蒲四味复方药材饮片1重量份，50％乙醇回流提取2次，溶剂用量为10体积份，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1∶6，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂，溶剂用量为2倍提取物的水溶液，进行萃取3次，除去脂溶性杂质，再用中等极性的溶剂，溶剂用量为2倍提取物的水溶液，经4次萃取获得其中的总黄酮成分，得到菖蒲四味黄酮提取物；

或取菖蒲四味复方药材饮片1重量份，50％乙醇回流提取2次，溶剂用量为10体积份，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶3。通过相当生药量的10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶8，2倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；9倍树脂体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物；

或取菖蒲四味复方药材饮片1重量份，70％乙醇回流提取3次，溶剂用量为10体积份，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶5，通过相当生药量的8体积倍的70目聚酰胺，吸附流速2BV/h，聚酰胺柱径高比为1∶9，3倍聚酰胺体积的水洗脱，流速为2～6BV/h；8倍聚酰胺体积的60％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集60％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物；

或取菖蒲四味复方药材饮片0.5重量份，采用超临界流体萃取法，加70％乙醇作夹带剂，萃取温度和压力为43℃及25MPa，静态浸泡时间为3h，动态循环2h，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂萃取除去脂溶性杂质，得菖蒲四味黄酮提取物。

上述方法中所用的溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂组成的混合溶剂；所述低极性的酯类、烷烃类、醚类溶剂包括石油醚、乙醚、己烷、汽油的一种或几种；所述中等极性溶剂包括氯仿、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇的一种或几种。

本发明所述的重量份与体积份的关系为g/mL的关系。

本发明所述的菖蒲四味黄酮提取物，其中总黄酮类成分百分含量的总和为5～99％(w/w)，其中优选为50～99％(w/w)。

本发明所述的菖蒲四味黄酮提取物中黄酮类活性成分最主要的是高良姜素、槲皮素、芦丁、山柰酚、山柰素-4′-甲醚、高良姜素-3-甲醚、乔松素、二氢高良姜醇、儿茶精、高良姜素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰素-4′-甲醚-3-O-β-D-葡萄糖苷等成分。

本发明所述的菖蒲四味黄酮提取物中主要的黄酮类化合物结构见表1：

表1主要的黄酮类化合物结构

本发明所述的菖蒲四味黄酮提取物可以单独、组合或与其它中西药物、食物配伍，制成胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等药物或功能性食品。

本发明所述的菖蒲四味黄酮提取物的检测方法包括如下含量测定方法中的一种或两种：

1、菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮的含量测定

精密称取高良姜素对照品5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；分别精密吸取高良姜素对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中。将试管置冷水浴(15℃左右)中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管。最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度。以高良姜素对照品取样量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密称取菖蒲四味黄酮提取物样品3份，每份约30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得本发明菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮以高良姜素计为50％～90％。

2.菖蒲四味黄酮提取物中高良姜素、山奈素的含量测定

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A)，流速1.0mL·min^-1；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL。

标准曲线绘制：精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL^-1的混合对照品储备液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。取混合对照品溶液分别进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0μl在上述色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液的质量X(μg)为横坐标绘制标准曲线，得到高良姜素、山奈素的回归方程。

含量测定：取菖蒲四味的原料药材5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入10BV的50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加蒸馏水稀释至15mL。然后通过30mL(径高比1∶8)大孔树脂柱，用树脂体积的1.5倍水洗脱，弃去洗脱液；之后用树脂体积的8倍的50％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，60℃干燥，得菖蒲四味黄酮部位样品，精密称定菖蒲四味黄酮部位样品约30mg于50ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用直径为0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得本发明菖蒲四味黄酮提取物中含高良姜素、山奈素分别为0.8-1.30％、0.25-0.50％。

本发明对菖蒲四味的原料药提取物进行纯化得到菖蒲四味黄酮提取物，使其有效成分的含量大大提高，克服了汤剂、胶囊剂服用剂量大的缺陷；同时，以前的菖蒲四味缺乏具体的质量标准控制指标，未形成系统的质量标准体系，本发明通过纯化得到菖蒲四味黄酮提取物，进行了菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮、高良姜素、槲皮素、芦丁的含量测定，有利于提高产品质量的可控性，对蒙药菖蒲四味的开发具有现实意义。

实验例与实施例

下面实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。

实验例1复方菖蒲四味黄酮提取物制备方法的筛选

取菖蒲四味复方药材饮片4份，每份5g，50％乙醇回流提取3次，溶剂用量为10体积倍，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶6。选择AB-8型大孔吸附树脂(生药量的10体积倍)、聚酰胺(生药量的10体积倍)、反相硅胶(生药量的6体积倍)、活性炭(生药量的10体积倍)等处理菖蒲四味复方提取物，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶10，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为6BV/h，50％乙醇洗脱5-8倍树脂体积，洗脱流速为4～9BV/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

表2提取物含量

由表2可看出，大孔吸附树脂对于总黄酮的富集能力(黄酮部位的含量及吸附-解吸附率)强于聚酰胺、反相硅胶、活性炭，据此，本发明选择大孔吸附树脂为载体富集菖蒲四味的总黄酮、总萜黄酮部位。

实验例2菖蒲四味黄酮部位富集所用树脂工艺的筛选

经查阅文献资料和实际结合，采用4因素3水平正交实验，考察因素：上样量，上样浓度，径高比，流速。以总黄酮提取量为考察指标。具体见下表。

表3因素水平表

2.1.2样品的制备

称取复方菖蒲四味药材共18份，按L9(3)⁴正交实验表，分别制备各样品(重复一份，共18次)，过滤，回收溶剂，真空干燥，称重，见下表。

表4样品制备表

2.1.3样品溶液的制备

将上述18份样品分别置于25mL量瓶，以50％乙醇溶解，超声，分别吸取一定量的待测液，平行操作两份，以高良姜素为对照品，按照本发明中菖蒲四味黄酮部位中总黄酮的含量测定，测定总黄酮的量。因素A、B、C、D均有显著性差异，即提取溶剂、提取次数及提取时间及溶剂倍数均有显著性差异。用SAS软件比较因素A、B、C、D中各水平之间的差异，进行水平相关性分析，可见因素A中水平1、2明显优于3；因素B中2、3水平明显优于1水平，而2、3水平没有明显差异；因素C中3水平明显优于1、2水平，而1、2水平没有明显差异；因素D中1、2水平明显优于3水平，而1、2水平没有明显差异。所以最优工艺为A2B2C3D2。

实验例3菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮的含量测定

1.1仪器与测定条件：

760CRT型紫外可见分光光度计(上海)

SARTORIUS-BS224S型电子分析天平(北京塞多利斯仪器系统公司)

KQ-250DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

测定波长：525nm

1.2对照品与试剂：

槲皮素对照品(批号：100081-200406购于中国药品生物制品检定所)

试剂：水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯

1.3对照品溶液的制备：

精密称取槲皮素对照品5.06mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为0.1012mg/mL的对照品溶液。

1.4样品溶液的制备

精密称取实施1制备的菖蒲四味黄酮提取物样品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液。

1.5菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮的含量测定

分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0mL、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得。

表5黄酮提取物总黄酮含量

实验例4菖蒲四味黄酮提取物中高良姜素、山奈素的含量测定

1.1仪器与测定条件：

日本日立公司LC-2000全自动进样高效液相色谱仪、L-2455紫外检测器，AgilentChemstation；AB135-S型超声清洗仪，AB135-S电子天平(Mettler Toledo公司)电子天平，3mL(200mg)ODS固相萃取柱。

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A)，流速1.0mL·min^-1；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL。在上述色谱条件下，高良姜素、山奈素与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于7000，对称因子在0.95～1.05之间。

1.2对照品与试剂：

高良姜素对照品(中国药品生物制品检定所，批号；111699-200501)；山奈素(中国药品生物制品检定所，批号；110861-200808)；蒙药复方菖蒲四味中各味药材均由安国市康达中药材有限公司提供，乙腈为Fisher色谱纯试剂，水为娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。

1.3对照品溶液的制备：

精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，用甲醇分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.4样品溶液的制备

精密称取实施例2制备的3批菖蒲四味黄酮提取物样品各3份，每份约30mg，于50ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.5菖蒲四味黄酮提取物中槲皮素的含量测定

精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，见表6。

表6高良姜素、山奈素含量

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片1.5kg，50％乙醇10L回流提取3次，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶3.5。通过7.5LAB-8大孔吸附树脂，吸附流速2Bv/h，树脂柱径高比为1∶10，水洗脱1.5倍树脂体积进行除杂，除杂流速为2Bv/h，50％乙醇洗脱8倍树脂体积，洗脱流速为2Bv/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

实施例2：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片0.5kg，加70％乙醇15L超声提取3次，每次提取1.5小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶5。通过10L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2Bv/h，树脂柱径高比为1∶6，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为4Bv/h，50％乙醇洗脱7倍树脂体积，洗脱流速为1Bv/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

实施例3：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片1.2kg，7％乙醇回流提取2次，溶剂用量为10体积份，每次提取2.5小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶10，通过相当生药量的7体积倍的90目聚酰胺，吸附流速2BV/h，聚酰胺柱径高比为1∶10，3倍聚酰胺体积的水洗脱，流速为4BV/h；7倍聚酰胺体积的70％乙醇洗脱，洗脱流速为7BV/h，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

实施例4：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片0.7kg，40％乙醇回流提取4次，溶剂用量为5体积份，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶2.5，通过相当生药量的6体积倍的30目聚酰胺，吸附流速2BV/h，聚酰胺柱径高比为1∶4，4倍聚酰胺体积的水洗脱，流速为6BV/h；5倍聚酰胺体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为4BV/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

实施例5：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片0.9kg，80％乙醇回流提取3次，溶剂用量为15体积份，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1∶7，然后用低极性的乙醚溶剂，溶剂用量为2倍提取物的水溶液，进行萃取3次，除去脂溶性杂质；再用中等极性的乙酸乙醋溶剂，溶剂用量为2倍提取物的水溶液，经4次萃取获得其中的总黄酮成分，得到菖蒲四味黄酮提取物。

实施例6：菖蒲四味黄酮提取物的制备

菖蒲四味复方药材饮片1.5kg，40％乙醇回流提取2次，溶剂用量为5体积份，每次提取3小时，减压回收溶剂，得提取物，先将混悬于水中，使药材与分散后溶液体积比为1∶10，然后用低极性的己烷溶剂，溶剂用量为3倍提取物的水溶液，进行萃取4次，除去脂溶性杂质，再用中等极性的正丁醇溶剂，溶剂用量为3倍提取物的水溶液，经4次萃取获得其中的总黄酮成分，得到菖蒲四味黄酮提取物。

实施例7：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片0.5kg，采用超临界流体萃取，加60％乙醇作夹带剂，萃取温度为40℃，压力为20MPa，静态浸泡时间为2h，动态循环2h，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的石油醚溶剂萃取除去脂溶性杂质，得菖蒲四味黄酮提取物。

实施例8：菖蒲四味黄酮提取物的制备

取菖蒲四味复方药材饮片1.5kg，采用超临界流体萃取，加80％乙醇作夹带剂，萃取温度为45℃，压力为30MPa，静态浸泡时间为4h，动态循环4h，将所得的提取物混悬于水中，然后用低极性的汽油溶剂萃取除去脂溶性杂质，得菖蒲四味黄酮提取物。

实施例9：菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮的含量测定

精密称取取高良姜素对照品5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；分别精密吸取高良姜素对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中。将试管置冷水浴(15℃左右)中，缓慢滴加浓HCl3mL，并不时振摇试管。最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度。以高良姜素对照品取样量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密称取菖蒲四味黄酮部位样品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0mL、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得本发明菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮以高良姜素计为82％。

实施例10：菖蒲四味黄酮提取物中高良姜素、山奈素的含量测定

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.5％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A)，流速1.0mL·min^-1；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL。

标准曲线绘制：

精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL^-1的混合对照品储备液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。取混合对照品溶液分别进样2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0μl在上述色谱条件下进行HPLC分析，以峰面积Y为纵坐标，溶液的质量X(μg)为横坐标绘制标准曲线，得到高良姜素、山奈素的回归方程。

含量测定：精密称取菖蒲四味黄酮部位样品各3份，每份约30mg，于50ml容量瓶中，加70％乙醇少许，超声使其溶解，70％乙醇定容，摇匀后用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得本发明菖蒲四味黄酮提取物中含高良姜素、山奈素分别为1.16％、0.39％。

Claims (17)

1.一种菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法为：

取菖蒲四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40％-80％乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶2.5-1∶10，通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶4～1∶13，1-5倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；5-12倍树脂体积的30％-90％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物；

其中，该药物组合物菖蒲四味的原料药组成为：

高良姜200-600重量份  紫硇砂100-300重量份  木香50-150重量份  石菖蒲50-150重量份。

2.如权利要求1所述的菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法为：

取菖蒲四味复方药材饮片1重量份，50％乙醇回流提取2次，溶剂用量为10体积份，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶3，通过相当生药量的10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶8，2倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；9倍树脂体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

3.如权利要求1或2所述的菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于其中的该药物组合物菖蒲四味的原料药组成为：

高良姜400重量份  紫硇砂200重量份  木香100重量份

石菖蒲100重量份。

4.如权利要求1或2所述的一种菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法中所用的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型。

5.如权利要求1或2所述的一种菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法中所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮。

6.如权利要求3所述的一种菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法中所用的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型。

7.如权利要求3所述的一种菖蒲四味黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法中所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮。

7.一种菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于该提取物由如下方法制成：

取菖蒲四味复方药材饮片0.5-1.5重量份，40％-80％乙醇回流提取2-4次，溶剂用量为5～15体积份，每次提取1-3小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶2.5-1∶10，通过相当生药量的6-10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶4～1∶13，1-5倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；5-12倍树脂体积的30％-90％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集30％-90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物；

其中，该药物组合物菖蒲四味的原料药组成为：

高良姜200-600重量份  紫硇砂100-300重量份  木香50-150重量份  石菖蒲50-150重量份。

8.如权利要求7所述的菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于该提取物由如下方法制成：

取菖蒲四味复方药材饮片1重量份，50％乙醇回流提取2次，溶剂用量为10体积份，每次提取2小时，减压回收溶剂，得提取物，加一定体积的水溶解，使得药材量与分散后溶液体积比为1∶3，通过相当生药量的10体积倍的AB-8大孔吸附树脂，吸附流速2BV/h，树脂柱径高比为1∶8，2倍树脂体积的水洗脱，除杂流速为2～6BV/h；9倍树脂体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为4～9BV/h，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为菖蒲四味黄酮提取物。

9.如权利要求7或8所述的菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于其中的该药物组合物菖蒲四味的原料药组成为：

高良姜400重量份  紫硇砂200重量份  木香100重量份

石菖蒲100重量份。

10.如权利要求7或8所述的菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于该提取物制备方法中的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型。

11.如权利要求7或8所述的菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于该提取物制备方法所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮。

12.如权利要求9所述的菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于该提取物制备方法中的大孔树脂是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性任意一种类型。

13.如权利要求9所述的菖蒲四味黄酮提取物，其特征在于该提取物制备方法所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮。

14.如权利要求7、8、12或13所述的菖蒲四味黄酮提取物的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的一种或几种：

A.总黄酮的含量测定

对照品溶液的制备：精密称取高良姜素对照品5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取菖蒲四味黄酮提取物样品3份，每份约30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮以高良姜素计为50％～90％；

B.高良姜素、山奈素的含量测定

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相A：乙腈，流动相B：0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A，流速1.0mL·min^-1 ；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL；

对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL^-1的混合对照品储备液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；

供试品溶液的制备：取菖蒲四味的原料药材5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入10BV的50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加蒸馏水稀释至15mL，然后通过30mL径高比1∶8的大孔树脂柱，用树脂体积的1.5倍水洗脱，弃去洗脱液；之后用树脂体积的8倍的50％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，60℃干燥，得菖蒲四味黄酮部位样品，精密称定菖蒲四味黄酮部位样品约30mg于50ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用直径为0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中含高良姜素、山奈素分别为0.8-1.30％、0.25-0.50％。

15.如权利要求9所述的菖蒲四味黄酮提取物的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的一种或几种：

A.总黄酮的含量测定

对照品溶液的制备：精密称取高良姜素对照品5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取菖蒲四味黄酮提取物样品3份，每份约30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮以高良姜素计为50％～90％；

B.高良姜素、山奈素的含量测定

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相A：乙腈，流动相B：0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A，流速1.0mL·min^-1 ；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL；

对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL^-1的混合对照品储备液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；

供试品溶液的制备：取菖蒲四味的原料药材5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入10BV的50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加蒸馏水稀释至15mL，然后通过30mL径高比1∶8的大孔树脂柱，用树脂体积的1.5倍水洗脱，弃去洗脱液；之后用树脂体积的8倍的50％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，60℃干燥，得菖蒲四味黄酮部位样品，精密称定菖蒲四味黄酮部位样品约30mg于50ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用直径为0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中含高良姜素、山奈素分别为0.8-1.30％、0.25-0.50％。

16.如权利要求10所述的菖蒲四味黄酮提取物的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的一种或几种：

A.总黄酮的含量测定

对照品溶液的制备：精密称取高良姜素对照品5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取菖蒲四味黄酮提取物样品3份，每份约30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮以高良姜素计为50％～90％；

B.高良姜素、山奈素的含量测定

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相A：乙腈，流动相B：0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A，流速1.0mL·min^-1 ；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL；

对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL^-1的混合对照品储备液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；

供试品溶液的制备：取菖蒲四味的原料药材5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入10BV的50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加蒸馏水稀释至15mL，然后通过30mL径高比1∶8的大孔树脂柱，用树脂体积的1.5倍水洗脱，弃去洗脱液；之后用树脂体积的8倍的50％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，60℃干燥，得菖蒲四味黄酮部位样品，精密称定菖蒲四味黄酮部位样品约30mg于50ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用直径为0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中含高良姜素、山奈素分别为0.8-1.30％、0.25-0.50％。

17.如权利要求11所述的菖蒲四味黄酮提取物的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的一种或几种：

A.总黄酮的含量测定

对照品溶液的制备：精密称取高良姜素对照品5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称取菖蒲四味黄酮提取物样品3份，每份约30mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇适量，超声处理5分钟，用70％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液10.0mL于25mL量瓶，加70％乙醇至刻度，摇匀，作为样品溶液；分别精密吸取上述样品溶液1.0mL置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，再分别精密吸取高良姜素对照品溶液2.0、4.0mL，置加有镁粉300mg的具塞刻度试管中，将试管置15℃左右的冷水浴中，缓慢滴加浓HCl 3mL，并不时振摇试管；最后加70％乙醇补足至10mL，摇匀，置沸水浴中加热60min，取出，迅速冷却至室温，于525nm处测定吸光度；外标两点法计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中总黄酮以高良姜素计为50％～90％；

B.高良姜素、山奈素的含量测定

色谱条件：色谱柱：Diamosil C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相A：乙腈，流动相B：0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～20min，34％A→37％A；20～60min，37％A，流速1.0mL·min^-1 ；检测波长286nm；柱温30℃；进样量20μL；

对照品溶液的制备：精密称取经减压干燥至恒重的对照品高良姜素、山奈素适量，分别配制成浓度为0.02，0.00828mg·mL^-1的混合对照品储备液，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液；

供试品溶液的制备：取菖蒲四味的原料药材5g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入10BV的50％的乙醇，回流提取2次，每次1.5小时，每次趁热用棉花粗滤，合并两次的提取液，回收溶剂至无醇味，加蒸馏水稀释至15mL，然后通过30mL径高比1∶8的大孔树脂柱，用树脂体积的1.5倍水洗脱，弃去洗脱液；之后用树脂体积的8倍的50％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，60℃干燥，得菖蒲四味黄酮部位样品，精密称定菖蒲四味黄酮部位样品约30mg于50ml容量瓶中，70％乙醇定容，摇匀后用直径为0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，精密吸取上述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量，即得菖蒲四味黄酮提取物中含高良姜素、山奈素分别为0.8-1.30％、0.25-0.50％。