CN103091408B - 柑橘生物类黄酮中橙皮甙含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
柑橘生物类黄酮中橙皮甙含量的测定方法，包括以下步骤：（1）稀释溶液的制备；（2）对照品溶液的制备；（3）供试品溶液的制备；（4）确定色谱条件；（5）检验程序。本发明操作简便、专属性和重复性好、回收率高，能够准确测定橙皮甙的含量，从而有效控制柑橘生物类黄酮混合物的质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物测试领域，尤其涉及柑橘生物类黄酮中橙皮甙的测定方法.
背景技术
柑橘类黄酮是从柑橘果实中提取出来的一系列具有显著生物活性的黄酮类化合物，柑橘类黄酮具有独特的芳香性、良好的水溶性和显著的药理作用。临床研究证实，柑橘类黄酮功能有：1、调节血脂，降低血液粘稠度，改善血清脂质，延长红血球寿命并增强造血功能，预防心脑血管疾病。2、抑制HL-60白血病细胞生长和溶解癌细胞的作用。3、能够有效清除体内的自由基及毒素，预防、减少疾病的发生。4、消炎、抗过敏、广谱抗菌、抗病毒作用。黄酮类物质既是药理因子又是重要的营养因子，是一类新发现的营养素，人体主要依靠从蔬菜、水果和谷物等食物中摄取一定量的黄酮，而黄酮类物质在体内代谢快需要不断的补充，柑橘类黄酮特有的生理活性已经得到了世界公认，目前市场上已有大量的以柑橘类黄酮作为膳食补充剂制成的各种保健品和食品，同时在化妆品以及医药产品中也得到了广泛应用。
柑橘生物类黄酮混合物尚未有正式的国家标准，在主要活性成分橙皮甙定量检测方面没有系统、完善的检测方法。《中国药典》中陈皮的橙皮甙测定方法为：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：醋酸：水(35：4：61)为流动相，供试品提取：在索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)80ml，加热回流2～3小时，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80ml，再加热回流至提取液无色，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。该方案如用于柑橘生物类黄酮混合物中橙皮甙的测定，一是柑橘生物类黄酮混合物供试品溶液杂质太多，等度洗脱不能将杂质完全清除，二是索氏提取样品前处理复杂，前处理时间过长，该方法并不完全适用于柑橘生物类黄酮混合物橙皮甙的测定。因此，有必要针对柑橘生物类黄酮混合物的特点制定其中橙皮甙的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种柑橘生物类黄酮中橙皮甙含量的测定方法，它操作简便、专属性和重复性好、回收率高，能够准确测定橙皮甙的含量，从而有效控制柑橘生物类黄酮混合物的质量。
本发明是通过以下方式实现的：柑橘生物类黄酮中橙皮甙含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、稀释溶液的制备：取20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5～1.5：1.5～0.5比例混合均匀；
（2）、对照品溶液的制备：精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.10mg/ml的对照品溶液；
（3）、供试品溶液的制备：精密称取10-15mg样品于100ml容量瓶中，加入80ml稀释溶液，60～70℃超声10-20min，取出，冷却至室温后，用稀释溶液定容至刻度。取部分溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后备用；
（4）、确定色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相和梯度：流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后，脱气；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的甲醇-乙腈1:1溶液；梯度洗脱时间：当洗脱时间为零时，流动相A为90%，流动相B为10%；当洗脱时间为30min时，流动相A为35%，流动相B为65%；当洗脱时间为34min时，流动相A为10%，流动相B为90%；当洗脱时间为36min时，流动相A为90%，流动相B为10%；当洗脱时间为48min，流动相A为90%，流动相B为10%；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：292nm；保留时间：柚皮苷为17.6min；橙皮甙为18.0min；
（5）、检验程序：
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；
系统适应性条件：完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到：理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5；
通过测得数据计算橙皮甙含量橙皮甙%=A样×C对×100/A对×W样×100%式中：C对：橙皮甙标准工作溶液浓度mg/ml；A样：样品峰面积；A对：橙皮甙标准工作溶液峰面积平均值；W样：样品的质量mg。
本发明操作简便、专属性和重复性好、回收率高，能够准确测定橙皮甙的含量，从而有效控制柑橘生物类黄酮混合物的质量。
附图说明
图1是本发明的梯度洗脱时间。
具体实施方式
柑橘生物类黄酮中橙皮甙含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、稀释溶液的制备：取20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5～1.5：1.5～0.5比例混合均匀；（2）、对照品溶液的制备：精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.10mg/ml的对照品溶液；（3）、供试品溶液的制备：精密称取10-15mg样品于100ml容量瓶中，加入80ml稀释溶液，60～70℃超声10-20min，取出，冷却至室温后，用稀释溶液定容至刻度。取部分溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后备用；（4）、确定色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相和梯度：流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后，脱气；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的甲醇-乙腈1:1溶液；梯度洗脱时间：当洗脱时间为零时，流动相A为90%，流动相B为10%；当洗脱时间为30min时，流动相A为35%，流动相B为65%；当洗脱时间为34min时，流动相A为10%，流动相B为90%；当洗脱时间为36min时，流动相A为90%，流动相B为10%；当洗脱时间为48min时，流动相A为90%，流动相B为10%；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：292nm；保留时间：柚皮苷约为17.6min；橙皮甙约为18.0min；（5）、检验程序：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；系统适应性条件：完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到：理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5；通过测得数据计算橙皮甙含量橙皮甙%=A样×C对×100/A对×W样×100%式中：C对：橙皮甙标准工作溶液浓度mg/ml；A样：样品峰面积；A对：橙皮甙标准工作溶液峰面积平均值；W样：样品的质量mg。具体实施时，使用氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液的混合溶液作为提取溶液，60～70℃超声提取10～20分钟，碱溶液有效地提高了橙皮甙的提取效率，50%甲醇溶液改善橙皮甙峰形的对称性，流动相加入0.1%三氟乙酸既调节了流动相PH值，三氟乙酸本身也是离子对试剂。梯度洗脱通过改善流动相比例，最短时间内完成了所有成分的洗脱，橙皮甙和柚皮甙的分离度、柱效测试，有效地监测了色谱条件，本发明专属性好、重复性好、回收率高，对柑橘生物类黄酮橙皮甙的检测更为有效。
下面用实验例进一步说明本发明：
实施例1、柑橘生物类黄酮混合物批号：20110918
以橙皮甙为含量测定指标，按如下方法进行含量测定：
（1）稀释溶液的制备：加20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按（1：1）比例均匀混合；
（2）对照品溶液的制备：精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.10mg/ml的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取12.5mg样品于100ml容量瓶中，加入80ml稀释溶液，65℃超声15min，取出，冷却至室温后，用稀释溶液定容至刻度。取部分溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后备用；
（4）确定色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相和梯度：流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后，脱气；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的甲醇-乙腈1:1溶液；梯度洗脱时间见图1；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：292nm；保留时间：柚皮苷为17.6min；橙皮甙为18.0min；
（5）检测程序：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定；测定结果：橙皮甙和柚皮苷的分离度大于1.5，理论塔板数大于2000；
本品含橙皮甙80.6%。
实施例2、柑橘生物类黄酮混合物批号：20120107
以橙皮甙为含量测定指标，按如下方法进行含量测定：
（1）稀释溶液的制备：加20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按（1.5：0.5）比例均匀混合；
（2）对照品溶液的制备：精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.10mg/ml的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取10.5mg样品于100ml容量瓶中，加入80ml稀释溶液，60℃超声10min，取出，冷却至室温后，用稀释溶液定容至刻度。取部分溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后备用；
（4）确定色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相和梯度：流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后，脱气；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的甲醇-乙腈1:1溶液；梯度洗脱时间见图1；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：292nm；保留时间：柚皮苷为17.6min；橙皮甙为18.0min；
（5）检测程序：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定；测定结果：橙皮甙和柚皮苷的分离度大于1.5，理论塔板数大于2000；
本品含橙皮甙81.3%。
实施例3、柑橘生物类黄酮混合物批号：20120303
以橙皮甙为含量测定指标，按如下方法进行含量测定：
（1）稀释溶液的制备：加20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按（0.5：1.5）比例均匀混合；
（2）对照品溶液的制备：精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.10mg/ml的对照品溶液;
（3）供试品溶液的制备：精密称取14.5mg样品于100ml容量瓶中，加入80ml稀释溶液，70℃超声20min，取出，冷却至室温后，用稀释溶液定容至刻度。取部分溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后备用.
（4）确定色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相和梯度：流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后，脱气；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的甲醇-乙腈1:1溶液；梯度洗脱时间见图1；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：292nm；保留时间：柚皮苷为17.6min；橙皮甙为18.0min；
（5）检测程序：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定；测定结果：橙皮甙和柚皮苷的分离度大于1.5，理论塔板数大于2000；
本品含橙皮甙80.2%。
方法学考察
（1）、线性与范围
取标准储备溶液，分别稀释五个浓度，读取峰面积；以峰面积和浓度作线性回归方程；
相关系数R≥0.999；
（2）、专属性试验
准确称取原料100mg于100ml棕色容量瓶中，配成溶液过滤后进样，注入液相色谱仪进行测定，受用DAD记录全光谱，进行峰纯度检查，纯度因子≥980；
（3）、溶液稳定性试验：取样品溶液进行稳定性试验，分别测定放置0、4、8、12、16、20、24、28小时后的含量，峰面积RSD≤2.0%；
（4）、系统适用性试验
取对照品溶液连续进样六针，分别计算橙皮甙和柚皮甙色谱峰的峰面积和理论塔板数以及二色谱峰的分离度，峰面积的RSD应≤2.0%；理论塔板数均≥2000；分离度均1.5；
（5）、重复性试验
称取样品6份，按上述色谱条件分别进样，计算样品的含量，含量RSD≤2.0%；
（6）、加样回收率
试验称取橙皮甙对照品适量溶解配成高中低三种不同的浓度，分别加入样品中，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定，回收率应在95.0%～105.0%之间。
Claims (1)
1.柑橘生物类黄酮中橙皮甙含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、稀释溶液的制备：取20mmol/l的氢氧化钠溶液和50%甲醇溶液按0.5～1.5：1.5～0.5比例混合均匀；
（2）、对照品溶液的制备：精密称取橙皮甙和柚皮甙对照品适量，加稀释溶液制成橙皮甙和柚皮甙浓度均为0.10mg/ml的对照品溶液；
（3）、供试品溶液的制备：精密称取10-15mg样品于100ml容量瓶中，加入80ml稀释溶液，60～70℃超声10-20min，取出，冷却至室温后，用稀释溶液定容至刻度；
取部分溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后备用；
（4）、确定色谱条件：色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相和梯度：流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后，脱气；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的甲醇-乙腈1:1溶液；梯度洗脱时间：当洗脱时间为零时，流动相A为90%，流动相B为10%；当洗脱时间为30min时，流动相A为35%，流动相B为65%；当洗脱时间为34min时，流动相A为10%，流动相B为90%；当洗脱时间为36min时，流动相A为90%，流动相B为10%；当洗脱时间为48min时，流动相A为90%，流动相B为10%；柱温：35℃；流速：1ml/min；检测波长：292nm；保留时间：柚皮苷为17.6min；橙皮甙为18.0min；
（5）、检验程序：
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，在规定条件下，每针运行时间应三倍于橙皮甙的保留时间；
系统适应性条件：完全分离两种系统适应性物质，柱效应达到：理论塔板数大于2000，橙皮甙和柚皮甙的分离度大于1.5；
通过测得数据计算橙皮甙含量橙皮甙%=A样×C对×100/A对×W样×100%式中：C对：橙皮甙标准工作溶液浓度mg/ml；A样：样品峰面积；A对：橙皮甙标准工作溶液峰面积平均值；W样：样品的质量mg。
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Denomination of invention: Method for determination of hesperidin content in citrus bioflavonoids Effective date of registration: 20230906 Granted publication date: 20140416 Pledgee: Zhejiang Commercial Bank Co.,Ltd. Taizhou Branch Pledgor: JIANGSU ALAND NOURISHMENT Co.,Ltd. Registration number: Y2023980055355 |