CN105758956A - 一种桑椹及其制品中绿原酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桑椹及其制品中绿原酸的检测方法，其步骤为：将待测桑椹样品进行预处理后，采用高效液相色谱法进行检测；其中，所述预处理的方法为，将待测桑椹样品配成水溶液，再对所述水溶液进行加热回流提取或超声处理；所述高效液相色谱的检测条件为，采用C18色谱柱，流动相为乙腈和0.2～0.4％磷酸水溶液的混合液，二者的体积比为10～20:80～90。本发明所述的方法可准确的测定桑椹中绿原酸的含量，为以桑椹为原料生产桑椹颗粒药物提供含量检测方法学指导。

Description

一种桑椹及其制品中绿原酸的检测方法

技术领域

本发明涉及活性物质检测领域，具体涉及一种桑椹及其制品中绿原酸的检测方法。

背景技术

桑椹，桑树的成熟果实，桑椹又叫桑果、桑泡儿，桑椹的成熟鲜果味甜汁多，是人们常食的水果之一。在药效方面，桑椹性味甘寒，具有补肝益肾、生津润燥、乌发明目等功效。桑果古来就是百姓常采用的一种利尿，保健，消暑的鲜果，在本草纲目中有记载其特殊功效。在现代中药学中，桑椹通常加工成桑椹颗粒。

绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。桑椹中含有少量的绿原酸，但桑椹的产地较多，不同产地中绿原酸的含量相差较大，这就导致最终的桑椹颗粒中的绿原酸含量差异也较大，这势必会导致桑椹颗粒的药效不稳定，因此有必要研究一种桑椹及其制品中绿原酸的检测方法，为桑椹颗粒的生产及其质量检测提供指导。

发明内容

(一)要解决的技术问题

针对现有技术中没有专门针对桑椹及其制品中的绿原酸的检测方法的缺陷，本发明提供一种利用高效液相色谱法检测桑椹及其制品中绿原酸的方法。

(二)技术方案

本发明所述的方法，其步骤为，将待测桑椹样品进行预处理后，采用高效液相色谱法进行检测；

其中，所述预处理的方法为，将待测桑椹样品溶于水，再对其进行加热回流或超声处理；

所述高效液相色谱的检测条件为，采用C18色谱柱，流动相为乙腈和0.2～0.4％磷酸水溶液的混合液，二者的体积比为10～20:80～90。

本发明所述的方法，所述水溶液中待测桑椹样品的浓度，按桑椹干粉计，与水的质量体积比为1～5：100；所述桑椹干粉中水分的含量为15～18％；若待测样品为新鲜的桑椹，可将其干燥到上述含水量后进行测试。

本发明所述的方法，若待测样品为桑椹干粉，对其进行加热回流，加热回流的时间为1～3h；回流1～2次。

本发明所述的方法，所述水溶液中待测桑椹样品的质量浓度，按桑椹颗粒计，与水的质量体积比为0.5～1.5:100；对其进行超声处理，所述超声处理的时间为10～15min，功率280～350W，频率40～50kHz；

本发明中所述的桑椹样品与水的质量体积比的单位g/mL或kg/L等与g/mL相对应的单位；

所述桑椹颗粒的制备方法为将桑椹鲜果加水煎煮二次，每次2～3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，即得。

本发明所述的方法，待测桑椹样品的粒度为20～80目。

本发明所述的方法，理论塔板数以绿原酸峰计算不低于4000。

优选的，所述C18色谱柱的规格为250×4.6mm，5μm。本发明所述的C18色谱柱优选KromasilC18色谱柱。

本发明所述的方法，检测器检测波长为327nm，流动相的流速为0.7～0.9ml/min，柱温为室温，进样量为5～10μl。

本发明所述的方法，检测之前制备绿原酸浓度与峰面积的标准曲线，所述标准曲线的线性范围为1.300～312.000μg/mL。

优选的，本发明所述的方法包括如下步骤：

1)确定检测条件：色谱柱：C18色谱柱250×4.6mm，5μm，流动相：体积比为10～20：80～90的乙腈和0.3％磷酸水溶液的混合液，检测波长：327nm，流速：0.7～0.9ml/min，柱温：室温，进样量：10μl，理论塔板数以绿原酸峰计算不低于4000；

2)标准曲线的绘制：绘制线性范围为1.300～312.000μg/mL的绿原酸标准曲线；

3)样品的检测：取含水量为15～18％，粒度为20～40的桑椹干粉，配成质量浓度为1.5～2.5％的水溶液，加热回流提取1.0～2h，取滤液作为供试品溶液；或取粒度为60～80的桑椹颗粒，将其配成质量浓度为0.8％～1.5％的水溶液，在功率280～350W，频率40～50kHz的条件下超声处理10～15min，取滤液作为供试品溶液；

4)将上述两种供试品溶液按照步骤1)所述的方法进行检测。

(三)有益效果

本发明所述的方法具有如下有益效果：

1)本发明采用水提法提取桑椹中的绿原酸，该工艺稳定可靠、绿色环保，提取得率较高。

3)本发明所述的在预处理过程中，合理限定了待测桑椹样品与水的相对用量，可对桑椹中的绿原酸进行最大限定的提取。

2)采用本发明所述的检测条件进行检测，方法可靠、灵敏、准确、重复性好、专属性强，可有效控制桑椹颗粒的质量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中用到如下的仪器和药品：

日本岛津LC-20AD高效液相色谱仪附双泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20ACHT自动进样器，LClabsolution软件，CTO-20A柱温箱，日本岛津公司；

KromasilC18色谱柱(250×4.6mm，5μm，瑞士Kromasil公司)；

1/10万电子分析天平(R200D型德国Sartorius公司)；

台式天平(goldJewelleryscale，德国Sartorius公司)；

电热套，1000ml(上海科析实验仪器厂)。

超纯水，由美国Millipore纯水系统制备。

乙腈，色谱级，美国Honeywell公司；

磷酸，AR级，天津市富宇精细化工有限公司；

绿原酸(批号110753-201415)对照品，购自中国食品药品检定研究院；

桑椹干粉：江苏产地(批号20140528)由陕西君碧莎制药有限公司提供；

桑椹颗粒：四川产地(批号20140627)由陕西君碧莎制药有限公司提供。

实施例1

本实施例涉及一种桑椹干粉中绿原酸的检测方法，包括如下步骤：

1)确定检测条件：色谱柱：KromasilC18色谱柱(250×4.6mm，5μm瑞士Kromasil公司)，流动相：乙腈-0.3％磷酸水溶液(15:85)，检测波长：327nm，流速：0.8ml/min，柱温：室温，进样量：10μl，理论塔板数不低于4000；

2)标准曲线的绘制

A、精密称取13.0mg绿原酸对照品于10ml量瓶中加水至刻度，得浓度为1.30mg/ml对照品溶液，作为储备液备用。

B、分别精密量取储备液0.005，0.030，0.045，0.500，0.700，1.200ml各置于5ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，分别得到浓度为1.300、7.800、11.700、130.000、182.000，312.0000μg/ml的对照品溶液；按步骤1)所述的色谱条件对标准溶液进行检测，测定峰面积，以对照品峰面积值(y)为纵坐标，绿原酸浓度(x)为横坐标进行线性回归，回归方程为y＝42256x-9219.6，r＝0.9994，线性范围为1.300～312.000μg/ml，结果见表1。

表1绿原酸对照品浓度与峰面积的关系(n＝2)

3)待测样品中绿原酸的测定

A、取含水量为15％的桑椹干粉(过40目筛)2.0g，精密称定，精密加入水100ml，称定重量，加热回流提取1.0h，再精密称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。

B、按照步骤1)所述的色谱条件测定样品中的绿原酸，测两个平行样品，每个样品进样两次，测定结果如表2：

表2：桑椹干粉中绿原酸的检测结果

3)检测方法准确性的检验

A、精密度试验

量取线性样品溶液(浓度为1.30mg/ml)0.5ml于5ml量瓶中加水至刻度，得浓度为0.13mg/ml，按步骤1)中的色谱条件进样重复进样6次，绿原酸峰面积值的RSD分别为0.96％，见表3。

表3精密度试验结果(n＝6)

B、重复性试验

精密称取样品(江苏产，批号20140628)2.1008g6份，按供试品溶液制备方法操作，按步骤1)中的色谱条件测定；结果见表4，表明重复性良好。

表4重复性试验结果(n＝6)

C、稳定性试验

取精密度试验样品溶液(浓度为0.13mg/ml)，每间隔一定时间进样，测定峰面积值见表5，结果表明绿原酸在12h内稳定，RSD分别为0.83％。

表5稳定性试验结果

(9)回收率试验

采用加样回收法测定，在已知含量的样品(江苏产，批号20140628，含量为3.813mg/g)中，精密加入绿原酸对照品，按供试品溶液制备方法操作，按色谱条件测定，以下式计算加样回收率，结果见表5。

表6药材中绿原酸回收率测定结果

由表2～6的测试结果可知，本发明所述的检测方法在测量结果上具有良好的精密度、较高的重复性以及理想的回收率，可以预测该方法可对桑椹中的绿原酸进行较为准确地检测。

实施例2

本实施例涉及一种桑椹颗粒中绿原酸的检测方法，包括如下步骤：

由实施例1相比，共区别在于，所述步骤3)中的操作为：

取桑椹颗粒粉末(过80目筛)1.0g，精密称定，精密加入水100ml，称定重量，超声10min，超声功率300W，频率45kHz，放凉，再精密称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

其精密度和稳定性实验同实施例1，重复性和回收率实验见表7表8：

表:7重复性试验结果(n＝6)

表8颗粒中绿原酸回收率测定结果

由表7和表8可看出，重复性和加样回收率均良好。

对比例1

同实施例1相比，其区别在于，所述步骤3)中，桑椹的预处理方法为，将桑椹溶于甲醇中进行提取。所得产品的重复性试验结果和加样回收率结果如下表9、表10：

表9重复性试验结果(n＝6)

表10药材中绿原酸回收率测定结果

由以上结果可以看出，采用甲醇对桑椹中的绿原酸进行提取后所得提取率远远低于水提，且水的绿色环保性更好。

对比例2

实施例1相比，其区别在于，所述步骤3)中，分别称取桑椹干粉20g和10g溶于100ml的水中。

经过提取后发现，桑椹干粉的质量为20g时，绿原酸的提取浓度为0.235mg/g，又椹干粉的质量为10g时，绿原酸的提取浓度为0.268mg/g。由此可知，采用本发明所述的物质浓度可实现对绿原酸最大程度地提取。

对比例3

同实施例1相比，其区别在于，所述步骤1)中，选择流动相为0.1mol/L磷酸二氢钠-甲醇(75∶25)磷酸调pH值3.0或甲醇-3％醋酸水溶液(25∶75)。

①流动相中加入缓冲盐，其流动相组成为〔0.1mol/L磷酸二氢钠-甲醇(75∶25)磷酸调pH值3.0〕，缓冲盐对液相系统及色谱柱损伤性大，且实验中发现保留时间重现性差。

②流动相组成为〔甲醇-3％醋酸水溶液(25∶75)〕，其醋酸比例较高，且峰形拖尾。因此本实验中的流动相乙腈-0.3％磷酸水溶液(15∶85)，组成简单，重现性好，适于分析桑椹中绿原酸。

因此，在对桑椹中的绿原酸进行提取的过程中，采用水提法，控制其中桑葚干粉与水的质量体积比为1～5：100，同时采用本发明所述的流动相，可实现对绿原酸的充分提取和准确测定。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种桑椹及其制品中绿原酸的检测方法，其特征在于，将待测桑椹样品进行预处理后，采用高效液相色谱法进行检测；

其中，所述预处理的方法为，将待测桑椹样品溶于水，再对其进行加热回流或超声处理；

所述高效液相色谱的检测条件为，采用C18色谱柱，流动相为乙腈和0.2～0.4％磷酸水溶液的混合液，二者的体积比为10～20:80～90。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶液中待测桑椹样品的浓度，按桑椹干粉计，与水的质量体积比为1～5：100；所述桑椹干粉中水分的含量为15～18％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述加热回流的时间为1～3h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶液中待测桑椹样品的质量浓度，按桑椹颗粒的计，与水的质量体积比为0.5～1.5：100；所述超声处理的时间为10～15min，功率280～350W，频率40～50kHz。

5.根据权利要求1或2或4所述的方法，其特征在于，所述待测桑椹样品的粒度为20～80目。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，理论塔板数以绿原酸峰计算不低于4000。

7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱的规格为250×4.6mm，5μm。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，检测器检测波长为327nm，流动相的流速为0.7～0.9ml/min，柱温为室温，进样量为5～10μl。

9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，绿原酸浓度与峰面积的标准曲线的线性范围为1.300～312.000μg/mL。

10.根据权利要求1～9任一项所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)确定检测条件：C18色谱柱250×4.6mm，5μm，流动相：体积比为10～20：80～90的乙腈和0.3％磷酸水溶液的混合液，检测波长：327nm，流速：0.7～0.9ml/min，柱温：室温，进样量：10μl，理论塔板数以绿原酸峰计算不低于4000；

2)标准曲线的绘制：绘制线性范围为1.300～312.000μg/mL的绿原酸标准曲线；

3)样品的检测：取含水量为15～18％，粒度为20～40的桑椹干粉，配成质量浓度为1.5～2.5％的水溶液，加热回流提取1.0～2h，取滤液作为供试品溶液；或取粒度为60～80的桑椹颗粒，将其配成质量浓度为0.8％～1.5％的水溶液，在功率280～350W，频率40～50kHz的条件下超声处理10～15min，取滤液作为供试品溶液；

4)将上述两种供试品溶液按照步骤1)所述的方法进行检测。