CN105136939B - 一种采用hplc法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，桑椹药材采用水作为溶剂加热回流提取，利用HPLC法，采用KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；使用0.6％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.5ml·min^‑1；以209nm为检测波长；柱温为30℃，结果表明柠檬酸对照品在0.10320～1.72000mg·ml^‑1质量浓度范围内线性关系良好(r＝0.9999)；精密度的RSD值为1.01％(n＝6)；测得平均加样回收率为98.29％，RSD值为0.93％(n＝6)，该方法简便、准确、易行，可用于桑椹药材的质量控制。

Description

一种采用HPLC法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法

技术领域

本发明涉及中药质量检测领域，尤其涉及一种HPLC法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法。

背景技术

桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是桑科桑属mulberry(Morus alba L.)植物的果实。本属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。我国约有11种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大。1993年国家卫生部把桑椹列为“既是食品又是药品”的农产品之一。

桑椹中含有丰富的糖类、有机酸、脂类、维生素、色素、非色素酚和矿物质等成分。目前，在桑椹营养成分的研究的基础上，国内外对桑椹中功效成分的研究较多，主要集中在桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。柠檬酸是其中含量较高的有机酸，柠檬酸又名枸橼酸，易溶于水，其具广泛的药理作用：1)柠檬能防止心血管动脉硬化并减少血液粘稠度；2)中国中医认为，柠檬性温、味苦、无毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滞、健胃、止痛等功能利尿，调剂血管通透性；3)柠檬酸热量低，且具有很强的收缩性，因此有利于减少脂肪，是减肥良药；4)具有防止和消除皮肤色素沉着的作用；5)祛痰作用等。因此，建立起一种准确测量桑椹药材中柠檬酸含量的方法对于桑葚药材的质量控制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液

称取柠檬酸对照品，加水制成浓度为1.70-1.73mg·ml^-1的溶液，即得；

(2)制备供试品溶液

称取桑葚药材样品，配制成浓度为15-25mg·ml^-1的水溶液，即得；

(3)色谱条件

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为0.1％-1.0％的磷酸水溶液；

(4)测试

所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀释成浓度范围为0.1-2.0mg·mL^-1的待测对照品溶液5-7个，按照上述色谱条件，分别测定待测对照品溶液以及对照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到回归方程；

第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归方程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。

作为本发明优选的方案，所述的色谱条件为采用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相为0.6％的磷酸水溶液。

发明人考察了1.0％醋酸与0.6％磷酸2种系统梯度洗脱及其不同流动相比例，比较的磷酸浓度有0.1％，0.3％，0.6％，1.0％水溶液。结果表明，各种流动相中0.6％磷酸水溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中。

作为本发明更加优选的方案，所述的色谱条件还包括：采用紫外检测器，检测波长为200-240nm，流速：0.3-1.5ml·min^-1；柱温：25-40℃；进样量5-20μl。

作为本发明最优选的方案，所述的色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.6％的磷酸水溶液，检测器：紫外，检测波长：209nm，流速：0.5mL·min^-1，柱温：30℃，进样量10μl。

发明人同时比较了不同柱温与流速的影响，柱温超过30℃分析时间缩短，但大多数色谱峰分离度小或不能分开；流速低于0.5ml·min^-1，分析时间过长，高于0.5ml·min^-1大多数色谱峰分离度差。因此选择便于控制的柱温30℃与流速0.5ml·min^-1作为色谱条件。

作为本发明最优选的方案，步骤(2)中，称取桑葚药材样品之前，先将样品粉末过4号筛。

作为本发明最优选的方案，步骤(2)中，将称量好的桑葚药品加入蒸馏水中，加热回流提取0.5-1.5h，优选为1h。

发明人比较了用水作为溶剂超声提取与用水作为溶剂加热回流提取来进行供试品溶液制备的区别，结果表明，用水作为溶剂加热回流提取得到的峰面积较大、峰个数较多、分离度较好，所以选择用加热回流的方式提取。

作为本发明优选的方案，步骤(4)中，所述的待测对照品溶液的浓度分别为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600mg·ml^-1，据此测得的回归方程为y＝1278680x+1614，相关系数r为0.9999，其线性关系良好。

作为本发明最优选的方案，本发明提高一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液

称取柠檬酸对照品，配制成浓度为17.2000mg·ml^-1的水溶液，超声并摇匀，过滤，取过滤液，即得对照品溶液；

(2)制备供试品溶液

将桑葚药品粉末过4号筛，配制成浓度为15-25mg·ml^-1，优选为20-22mg·ml^-1的水溶液，加热回流提取1h，过滤，取过滤液，即得供试品溶液；

(3)色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.6％的磷酸水溶液，检测器：紫外，检测波长：209nm，流速：0.5mL·min^-1，柱温：30℃，进样量10μl。

(4)测试

所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀释成浓度分别为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600mg·ml^-1的5个待测对照品溶液，按照上述色谱条件，分别测定5个待测对照品溶液以及浓度为1.72000mg·ml^-1的对照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到回归方程y＝1278680x+1614，相关系数r为0.9999。

第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归方程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。

本发明具有的优点和有益效果是：通过测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分的含量，表明该方法稳定可靠，单用液相色谱仪即可，避开了液相色谱与质谱连用的限制，使检测简单化；由于桑椹药材中的柠檬酸含量较高，且作用广泛，可用于桑椹药材的质量控制。

附图说明

图1是柠檬酸对照品的色谱图。

图2是江苏产地供试品的色谱图。

图1中柠檬酸的出峰时间为22.369min；

图2中柠檬酸的出峰时间为22.477min。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明涉及到的仪器为：岛津高效液相色谱仪(Prominence UFLC)，日本岛津公司；1/10万电子分析天平，型号ME235S，德国塞多利斯公司；电热套(1000ml)，上海科析实验仪器厂；KQ-300DE数控超声波发生器，昆山超声仪器有限公司。

本发明涉及到的药品为：磷酸，AR级，天津市富宇精细化工有限公司；水，自制；枸橼酸(批号111679-200401)对照品，购自中国食品药品检定研究院；桑椹药材：安徽产地(批号20150412、20150415)，新疆药材(批号20150418、20150419、20150421)，较广产地批号(20150422)，河南产地(批号20150508)，江苏产地(批号20150428)，四川产地(批号20150502)，陕西产地(批号20150427)由陕西君碧莎制药有限公司提供。

实施例1

(1)色谱条件：色谱柱为Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.6％磷酸水溶液；检测波长：209nm；流速：0.5ml·min^-1；柱温：30℃；进样量10μl。

(2)对照品溶液的配制：精密称取枸橼酸对照品17.2mg，置10ml容量瓶，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，超声并摇匀，滤过，取续虑液，作为母液，备用。

(3)供试品溶液的制备：取样品粉末(过4号筛)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水100ml,称定重量，加热回流提取1h，放冷，再精密称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定：

a：绘制标准曲线

量取对照品溶液0.30，0.50，1.00，2.00，4.00ml，分别置于5ml量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，滤过，分别得到浓度为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600mg·ml^-1的对照品溶液，按上述条件测定峰面积，以对照品峰面积值(y)为纵坐标，柠檬酸浓度(x)为横坐标进行线性回归。结果：柠檬酸的质量浓度范围(mg·ml^-1)、线性方程及相关系数(r)分别为：线性范围为0.10320～1.72000mg·ml^-1，回归方程为y＝1278680x+1614，r＝0.9999，见表1。

表1 对照品浓度与峰面积的关系(n＝2)

b：不同产地桑葚药材中柠檬酸含量的测定

分别精密量取供试品溶液10μL，按照前述色谱条件进样，测定峰面积，检测结果见表2。

表2 样品柠檬酸含量的测定结果

方法学考察

(1)精密度实验精密量取对照品溶液(浓度为1.72mg·ml^-1)1.07ml于5ml量瓶中加蒸馏水定容至刻度，得浓度为0.36808mg·ml^-1，按上述色谱条件重复进样6次，测得柠檬酸峰面积值的RSD为1.01％，见表3。结果表明该方法精密度良好。

表3 精密度试验结果

(2)稳定性实验取精密度试验样品溶液(浓度为0.36808mg·ml^-1)，每间隔一定时间进样一次，测定柠檬酸对照品峰面积的RSD值2.28％，见表4。结果表明柠檬酸对照品峰面积值在8h内稳定。

表4 稳定性试验结果

(3)加样回收实验采用加样回收法，取已测知含量的样品(江苏产，批号20150428，含量为5.140％)，精密称取柠檬酸对照品50.00mg加入其中。按供试品溶液制备法操作，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率，回收率的计算公式如下所示。

回收率结果见表5。柠檬酸平均加样回收率为98.29％，结果表明本方法具有良好的回收率。

表5 回收率测定结果

(4)重复性实验精密称取样品(江苏产，批号20150428，含量5.140％)2.0000g，按照供试品溶液制备方法制备6份样品，按上述色谱条件进样测定，结果柠檬酸含量的RSD值为0.63％，见表6。

表6 重复性试验结果

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液

称取柠檬酸对照品，加水制成浓度为1.70-1.73mg·ml^-1的溶液，即得；

(2)制备供试品溶液

称取桑葚药材样品，配制成浓度为15-25mg·ml^-1的水溶液，加热回流提取0.5-1.5h；即得；

(3)色谱条件

所述的色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18，其规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相：0.6％的磷酸水溶液，检测器：紫外，检测波长：209nm，流速：0.5mL·min^-1，柱温：30℃，进样量10μl；

(4)测试

所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀释成浓度范围为0.1-2.0mg·mL^-1的待测对照品溶液5-7个，按照上述色谱条件，分别测定待测对照品溶液以及对照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到回归方程；

第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归方程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，称取桑葚药材样品之前，先将样品粉末过4号筛。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，加热回流提取1h。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的待测对照品溶液的浓度分别为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600mg·ml^-1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述回归方程为y＝1278680x+1614，相关系数r为0.9999。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液

称取柠檬酸对照品，配制成浓度为17.2000mg·ml^-1的水溶液，超声并摇匀，过滤，取过滤液，即得对照品溶液；

(2)制备供试品溶液

将桑葚药品粉末过4号筛，配制成浓度为15-25mg·ml^-1，加热回流提取1h，过滤，取过滤液，即得供试品溶液；

(3)色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.6％的磷酸水溶液，检测器：紫外，检测波长：209nm，流速：0.5mL·min^-1，柱温：30℃，进样量10μl；

(4)测试

所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀释成浓度分别为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600mg·ml^-1的5个待测对照品溶液，按照上述色谱条件，分别测定5个待测对照品溶液以及浓度为1.72000mg·ml^-1的对照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到回归方程y＝1278680x+1614，相关系数r为0.9999；

第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归方程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述浓度为20-22mg·ml^-1。