CN108276460A

CN108276460A - 一种从血人参中提取的化合物及其提取工艺和应用

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Publication number: CN108276460A
Application number: CN201810276318.0A
Authority: CN
Inventors: 张永萍; 傅建; 段丽; 梁光义; 张仕林; 姚厂发; 刘莉; 葛秋平
Original assignee: GUIZHOU HANFANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Hanfang Pharma Co ltd
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108276460B

Abstract

本发明公开了一种从血人参中提取的化合物及其提取工艺和应用。本发明化合物是首次从血人参中分离得到的，该化合物具有抗炎作用，可以用于制备抗炎类药物。有利于对血人参药材及其制剂的开发和质量控制。

Description

一种从血人参中提取的化合物及其提取工艺和应用

技术领域

本发明涉及血人参中有效成分的提取方法及其应用，具体涉及从血人参中提取的化合物及其提取工艺和应用。

背景技术

血人参为豆科木蓝属植物茸毛木蓝(Indigofera stachyodes Lindl)的根，为贵州的苗族药物，又叫铁刷子、雪人参、山红花、红苦刺。味甘、微苦，性温。具有滋阴补虚，调经摄血，活血舒筋的功效。主治崩漏，体虚久痢，肠风下血，溃疡不敛，风湿痹通，跌打损伤，肝硬化，疳积等。是《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)收载品种。血人参是贵州苗族用药，具有活血、利湿、化痰、解表等功效。是芪胶升白胶囊的主要原料。

目前，对苗药血人参的资源分布、育种、化学成分、薄层鉴别及黄酮提取工艺等方面有少数的研究。针对血人参化学成分的研究，目前从血人参中提取得到的有效成分还比较少，主要是血人参皂苷、血人参次苷等几种，然而血人参有效成分十分复杂，仅仅这几种成分是不够的，仍需要对血人参提取工艺进行深入研究，以提取更多有效成分。因此，现有血人参提取工艺提取到的有效成分种类少，限制了对血人参药材及其制剂的开发和质量控制。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种从血人参中提取的化合物及其提取工艺和应用，本发明化合物是首次从血人参中分离得到的，该化合物具有抗炎作用，可以用于制备抗炎类药物。有利于对血人参药材及其制剂的开发和质量控制。

本发明采用如下技术方案实现：一种从血人参中提取的化合物，所述化合物为血人参苷，其结构式为：

一种前述的化合物的提取方法，包括以下步骤：

(1)血人参根干燥后，用乙醇回流提取，得A品；

(2)A品用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏，得B品；

(3)B品分离，得到血人参苷。

前述的化合物的提取方法中，步骤(1)中，所述的血人参根干燥后，用乙醇回流提取，得A品是；血人参根干燥后，粉碎，用6-8倍85-95％乙醇回流提取两次，每次2-4h，药渣用5-6倍量55-65％乙醇回流提取1.5-2.5h，合并三次提取液，减压回收溶剂至无乙醇味，所得浓缩液加1-2倍量水稀释分散，得A品。

前述的化合物的提取方法中，步骤(3)中：所述的B品分离，得到血人参苷是；取乙酸乙酯浸膏，加入1.2-1.5倍量40～80目的硅胶拌样，将拌好的样品采用200～300目硅胶柱层析分离，用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过波层色谱展开后，观察组分在紫外光下的荧光，碘蒸气吸收和对5％磷钼酸乙醇溶液的显色情况，合并相似组分，前几个浓度样品较少，集中在三氯甲烷-甲醇＝100∶50、100∶100；乙酸乙酯萃取部分共分成5段，得到Fr 1、Fr 2、Fr 3、Fr 4、Fr 5；将Fr 5经硅胶，300～400目，三氯甲烷-甲醇＝2:1、1:1、1:2洗脱，得到3个组分Fr 5-1、Fr 5-2、Fr 5-3，其中Fr 5-2经过半制备HPLC分离纯化得到化合物FJ-12，即血人参苷。

前述的化合物的提取方法中，所述的用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱是；按照三氯甲烷-甲醇＝100∶0；100∶5；100∶10；100∶25；100∶50；100∶100；0∶100进行洗脱，每一个梯度分别收集6～8份。

前述的化合物的提取方法中，用于制备抗炎类药物。

申请人对本发明进行了大量的实验研究，部分如下：

实验例1：化合物提取及鉴定

1.1样品来源及鉴定

血人参药材由贵阳德昌祥药业有限公司于2011年7月提供，经贵阳中医学院何顺志教授鉴定为豆科木蓝属血人参(Indigofera stachyoides Lind1.)的干燥根。

1.2实验仪器

核磁共振波谱(¹H NMR、¹³C NMR及二维谱)用INOVA 400MHz(美国瓦里安公司)核磁共振波谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标；EI-MS用HP-5973型质谱仪(美国惠普公司)测定；ESI-MS用HP1100-MSD型液相色谱质谱联用仪(美国惠普公司)测定；红外光谱(IR)用VECTOR-22傅里叶变换红外光谱仪(德国布鲁克公司)；Heidolph旋转蒸发仪；半制备液相色谱仪为Waters 2489(UV/Visible Detector，Waters 600 Controller，美国Waters公司)；旋光仪为JASCO DIP-370(日本Spectroscopic公司)；熔点测定仪为XT-4型显微熔点测定仪(温度计未校正，北京泰克仪器有限公司)；PB203-E型电子分析天平(Mettler-Toledo)；BUCHI Vacuum controller V-850；BUCHI Vacuum pumb V-700；W201B恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司)。

1.3实验材料

半制备所用色谱柱为Phenomenex C-18反相柱(250×10mm)；Sephadex LH-20为瑞典Amersham公司生产；小孔树脂MCI CHP-20为日本三菱公司生产；薄层层析硅胶，柱层析硅胶(40-80目，200-300和300-400目)，硅胶H(10-40μm)和薄层色谱预制板(0.20-0.25mm，GF254)均为青岛海洋化工有限公司生产；显色剂：5％的硫酸乙醇溶液，5％磷钼酸的乙醇溶液，三氯化铝乙醇液，三氯化铁和碘显色剂。

所用试剂氯仿、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等均为工业试剂经重蒸处理，乙醇为工业乙醇，半制备用乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.4实验方法

1.4.1总化学成分的提取和分离

血人参干燥根9.0kg，粉碎，90％乙醇回流提取两次，每次3h，药渣用60％乙醇回流提取2h，合并三次提取液，减压回收溶剂至无乙醇味，所得浓缩液以水稀释分散，用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯浸膏491g。

取乙酸乙酯萃取部分浸膏(490g)，加入硅胶(40～80目)740g拌样，留取少量浸膏留样。将拌好的样品采用硅胶(200～300目)柱层析分离，用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱(三氯甲烷-甲醇＝100∶0、100∶5、100∶10、100∶25、100∶50、100∶100、0∶100)，每一个梯度分别收集6～8份，洗脱组分通过波层色谱(TLC)展开后，观察组分在紫外光下的荧光，碘蒸气吸收和对5％磷钼酸乙醇溶液的显色情况，合并相似组分，前几个浓度样品较少，集中在三氯甲烷-甲醇＝100∶50、100∶100。将乙酸乙酯萃取部分共分成5段(Fr 1、Fr 2、Fr 3、Fr4、Fr 5)。

将Fr 5经硅胶(300～400目，三氯甲烷-甲醇)梯度洗脱，得到3个组分Fr 5-1、Fr5-2、Fr 5-3；其中Fr 5-2经过半制备HPLC分离纯化得到化合物FJ-12，即血人参苷。

1.4.2化合物结构鉴定

化合物FJ-12淡黄色固体，紫外灯下有荧光斑点，5％磷钼酸斑点显色明显。IR νKBr max(cm^-1):2923,2360,1719,1590,1512,1366,1256,1033；红外光谱1719cm^-1归属为酯羰基(C＝O)的伸缩振动，红外光谱1590,1512cm^-1归属为苯环骨架(C＝C)的伸缩振动；[α]D20-23.3(c 0.03,CH₃OH)；通过ESI-MS(557.3[M+Na]⁺,1091.4[2M+Na]⁺)确定分子量为534；¹³C-NMR显示有27个碳，DEPT显示有12个叔碳(CH,d)、4个仲碳(CH₂,t)、3个伯碳(CH₃,q)、8个季碳(s)，碘化铋钾显色呈阴性，说明没有N原子存在，综合以上信息，推测该化合物的分子式为C₂₇H₃₄O₁₁，不饱和度为11。首先从¹H-NMR谱中看，δ3.0～3.5ppm处的一系列信号峰，δ4.02处有一个双峰。结合¹³C-NMR和DEPT谱在δ105.8有一个叔碳，δ77.9,75.0,71.2,67.9ppm，这是典型5碳糖单元C信号，提示该结构中可能含有糖结构单元，且δ105.8ppm为一个典型的糖端基碳，推测该化合物有个糖的片段。从¹H-NMR谱低场处分析，δ6.78(d,J＝2.0Hz,1H),6.73(d,J＝8.0Hz,1H),6.60(dd,J＝8.0,2.0Hz,2H)，表明该化合物有一个典型的苯环1,3,4位取代的ABX系统，6.16(d,J＝0.8Hz,1H),6.61(s,1H)，是典型的苯环1,3,4,6位取代，说明该化合物含有两个苯环。通过光谱数据对照，发现该化合物的骨架结构特征与已知化合物schizandriside相似。经过与文献比对，¹³C-NMR谱图显示最低场处δ173.4多了一个碳，这是一个典型的羰基碳；最高场处δ20.9处多了一个碳。由此可以判断FJ-12化合物与文献中的化合物(schizandriside)多了一个乙酰基，结合HMBC上9-H与10-C相关，因此可以确定乙酰基的位置。由于乙酰基吸电效应作用导致C-8、C-9化学位移与schizandriside稍有出入，但经过HMBC谱证实其骨架一致。经SCIFINDER数据库检索后证实为新化合物，命名为血人参苷。具体见表1，图2和图3。

表1化合物FJ-12与schizandriside的波谱数据对比(δin ppm，J in Hz)

化合物FJ-12波谱数据：淡黄色粉末，[α]D 20+23.3(c 0.03,CH₃OH)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:6.78(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.73(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.61(1H,s,H-2),6.60(2H,dd,J＝8.0,2.0Hz,H-6′),6.17(1H,s,H-5),4.27(1H,dd,J＝11.0,3.9Hz,H-9a),4.16(1H,dd,J＝11.0,6.4Hz,H-9b),4.07(1H,d,J＝7.1Hz,H-7′),4.02(1H,d,J＝7.5Hz,H-1″),3.90(1H,dd,J＝9.9,2.7Hz,H-9′a),3.80(1H,d,J＝5.3Hz,H-5″a),3.78(6H,s,H-3,H-3′OMe),3.45(1H,ddd,J＝10.2,8.6,5.2Hz,H-4″),3.31～3.26(1H,m,H-3″),3.20(1H,dd,J＝9.6,2.0Hz,H-2″),3.17(1H,dd,J＝9.9,2.7Hz,H-9′b),3.08(2H,dd,J＝11.4,10.4Hz,H-5″b),2.77(2H,t,J＝7.1Hz,H-7),2.33～2.22(1H,m,H-8),2.04(3H,s,H-11),1.83(1H,tt,J＝10.5,2.8Hz,H-8′)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ:173.4(C-10),148.9(C-3′),147.2(C-3),145.8(C-4),145.2(C-4′),138.3(C-1′),134.1(C-6),128.3(C-1),123.0(C-6′),117.4(C-5),116.1(C-5′),114.3(C-2′),112.2(C-2),105.8(C-1″),77.9(C-3″),75.0(C-2″),71.2(C-4″),68.9(C-9′),67.9(C-9),66.9(C-5″),56.4(C-OCH₃),56.3(C-OCH₃),47.7(C-7′),46.1(C-8′),36.5(C-8),33.9(C-7),20.9(C-11)。图谱见图4-图12。

实验例2：抗炎考察

1材料

1.1仪器

酶标仪(美国分子公司)，In Cell Analyzer 2000(美国通用电器医疗)。

1.2试剂与试药

Lipopolysaccharides(LPS)、3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)、NS-398(购于Sigma)；Dimethyl sulfoxide(DMSO)(购于Alfa Aesar)；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(购于Gibco)；四季青牛血清(购于浙江天杭生物科技有限公司)；一氧化氮检测试剂盒、DAF-FM DA(NO荧光探针)、Hemoglobin(购于碧云天生物技术研究所)。

1.3细胞株

巨噬细胞RAW264.7(TIB-71^TM)。

2实验方法

2.1实验原理

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)作为常用的炎性损伤因子，可激活炎性相关通路，从而引起巨噬细胞的损伤，本实验通过观察本发明化合物的四个部位对LPS导致的巨噬細胞炎性损伤的保护作用，进行抗炎活性评价。

2.2储液配制

将本发明化合物(按实施例1进行提取)用DMSO配制为25mg/mL的储液，用于抗炎活性筛选。

抗炎筛选阳性药：NS-398，储液浓度10mg/mL，实验浓度10uM。

NO清除剂：Hemoglobin，储液浓度20mg/mL，实验浓度15uM。

2.3抗炎活性初次评价

2.3.1对LPS诱导损伤的细胞的保护作用

按照5×10³/孔的密度于96孔板中接种细胞RAW264.7，加入一定浓度的LPS损伤细胞，并同时依次加入不同浓度的本发明化合物，本发明化合物加至孔中的终浓度设置为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。5％CO2、37℃条件下孵育24h后，加入MTT，继续孵育4h，弃去MTT，加入DMSO，振荡30min，于570nm波长条件下用酶标仪检测吸光度值，并计算细胞存活率。

2.3.2对NO释放的检测

2.3.2.1对细胞中NO含量的影响

按照5×10³/孔的密度于96孔板中接种细胞RAW264.7，依次加入不同浓度的本发明化合物，本发明化合物加至孔中的终浓度设置为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。5％CO2、37℃条件下孵育24h后，弃去上清，加入NO探针DAF-FM DA，于37℃孵育20min，之后用PBS洗三遍，采用In Cell Analyzer 2000进行检测。

2.3.2.2对细胞上清液中NO含量的影响

按照5×10³/孔的密度于96孔板中接种细胞RAW264.7，依次加入不同浓度的本发明化合物，本发明化合物加至孔中的终浓度设置为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL。5％CO2、37℃条件下孵育24h后，取上清，采用Griess试剂盒法进行上清中NO的检测。

2.4抗炎活性进一步评价

按照5×10³/孔的密度于96孔板中接种细胞RAW264.7，加入一定浓度的LPS损伤细胞，并同时依次加入不同浓度的本发明化合物，本发明化合物从25ug/mL继续向下稀释七个梯度加至孔中，5％CO2、37℃条件下孵育24h后，加入MTT，继续孵育4h，弃去MTT，加入DMSO，振荡30min，于570nm波长条件下用酶标仪检测吸光度值，并计算细胞存活率。

3实验结果

采用SPSS16.0软件进行数据分析，数据表示形式为平均值±标准差，与空白对照组(control)相比，##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组(LPS-treated)相比，**P＜0.01，*P＜0.05。

3.1抗炎活性初步评价结果

3.1.1对LPS诱导损伤的细胞的保护作用

以细胞存活率来评价本发明化合物对LPS诱导损伤的细胞的保护作用，结果显示本发明化合物的细胞存活率和模型组(LPS-treated)相比，具有显著性差异(P＜0.01)。如图13所示。

初步抗炎实验结果显示本发明化合物与模型组(LPS-treated)相比，抗炎活性具有显著性差异，其他三个部位在无毒剂量下的较高浓度25ug/mL及50ug/mL均未显示出显著的抗炎活性，故认为血人参石油醚层为有效抗炎提取物。

3.1.3对NO释放的检测

LPS诱导细胞株RAW264.7致炎之后，会导致细胞产生大量的NO，从而引起进一步病变。为考察本发明化合物对LPS诱导细胞株RAW264.7致炎的影响，实验时针对细胞以及细胞上清液中的NO进行检测。

结果显示，本发明化合物(25ug/mL、50ug/mL及100ug/mL)可有效抑制细胞上清液中NO的释放，并呈现出一定的剂量依赖关系。如图14所示。进一步的对细胞中NO含量的影响实验，结果显示，本发明化合物可不同程度的改善细胞中NO的释放情况。

上述实验结果显示，本发明化合物具有较强的抗炎活性，将其从25ug/mL继续向下稀释七个梯度进行实验，观察其在低浓度下是否仍然具有抗炎活性。

3.2抗炎活性进一步评价

进一步降低本发明化合物的浓度，结果显示其在12.5ug/mL浓度时依然具有较好的抗炎活性。如图15所示。

4小结

巨噬细胞的迁移、聚集和浸润是炎症最重要的共性病例特征，是机体非特异免疫的重要组成部分。巨噬细胞异常的趋化迁移，在损伤部位大量聚集，即产生持续而强烈的炎症反应，临床表现为红、肿、热、痛。因此，在细胞水平的试验中，常将巨噬细胞作为评价指标。而脂多糖作为常用的炎性损伤因子，可激活炎性相关通路，从而引起巨噬细胞的损伤，因此本实验用LPS致巨噬細胞炎性损伤，对本发明化合物进行抗炎活性评价。实验结果显示，本发明化合物具有抗炎活性，可用于制备抗炎类药物。

与现有技术相比，本发明化合物是首次从血人参中分离得到的，该化合物具有抗炎作用，可以用于制备抗炎类药物。有利于对血人参药材及其制剂的开发和质量控制。

附图说明

图1是本发明的化合物的结构式；

图2是化合物FJ-12编号及重要a是FJ-12血人参苷的结构式，b是a三个手性原子对8’号原子的作用图；

图3是化合物FJ-12和化合物(schizandriside)的结构式；

图4是化合物FJ-12的氢谱图；

图5是化合物FJ-12的碳谱图；

图6是化合物FJ-12的DEPT谱图；

图7是化合物FJ-12的¹H-¹HCOSY图；

图8是化合物FJ-12的HMQC图；

图9是化合物FJ-12的HMBC图；

图10是化合物FJ-12的NOESY图；

图11是是化合物FJ-12的ESI-MS图；

图12是化合物FJ-12的红外图；

图13是对LPS诱导损伤的细胞的保护作用图；

图14是本发明化合物对细胞中NO的影响；

图15是血人参石油醚层对抗炎活性进一步评价结果图。

具体实施方式

实施例1。

一种从血人参中提取的化合物，所述化合物为血人参苷，其结构式为：

所述的化合物的提取方法，包括以下步骤：

(1)血人参根干燥后，粉碎，用6-8倍85-95％乙醇回流提取两次，每次2-4h，药渣用5-6倍量55-65％乙醇回流提取1.5-2.5h，合并三次提取液，减压回收溶剂至无乙醇味，所得浓缩液加1-2倍量水稀释分散，得A品；

(3)取乙酸乙酯浸膏，加入1.2-1.5倍量40～80目的硅胶拌样，将拌好的样品采用200～300目硅胶柱层析分离，用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过波层色谱展开后，观察组分在紫外光下的荧光，碘蒸气吸收和对5％磷钼酸乙醇溶液的显色情况，合并相似组分，前几个浓度样品较少，集中在三氯甲烷-甲醇＝100∶50、100∶100；乙酸乙酯萃取部分共分成5段，得到Fr 1、Fr 2、Fr 3、Fr 4、Fr 5；将Fr 5经硅胶，300～400目，三氯甲烷-甲醇＝2:1、1:1、1:2洗脱，得到3个组分Fr 5-1、Fr 5-2、Fr 5-3，其中Fr 5-2经过半制备HPLC分离纯化得到化合物FJ-12，即血人参苷。

步骤(3)中，所述的用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱是；按照三氯甲烷-甲醇＝100∶0；100∶5；100∶10；100∶25；100∶50；100∶100；0∶100进行洗脱，每一个梯度分别收集6～8份。

所述化合物的应用：其具有抗炎作用，可用于制备抗炎药物。

Claims

1.一种从血人参中提取的化合物，其特征在于：所述化合物为血人参苷，其结构式为：

2.一种如权利要求1所述的化合物的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)血人参根干燥后，用乙醇回流提取，得A品；

(3)B品分离，得到血人参苷。

3.如权利要求2所述的化合物的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的血人参根干燥后，用乙醇回流提取，得A品是；血人参根干燥后，粉碎，用6-8倍85-95％乙醇回流提取两次，每次2-4h，药渣用5-6倍量55-65％乙醇回流提取1.5-2.5h，合并三次提取液，减压回收溶剂至无乙醇味，所得浓缩液加1-2倍量水稀释分散，得A品。

4.如权利要求3所述的化合物的提取方法，其特征在于：步骤(3)中：所述的B品分离，得到血人参苷是；取乙酸乙酯浸膏，加入1.2-1.5倍量40～80目的硅胶拌样，将拌好的样品采用200～300目硅胶柱层析分离，用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，洗脱组分通过波层色谱展开后，观察组分在紫外光下的荧光，碘蒸气吸收和对5％磷钼酸乙醇溶液的显色情况，合并相似组分，前几个浓度样品较少，集中在三氯甲烷-甲醇＝100∶50、100∶100；乙酸乙酯萃取部分共分成5段，得到Fr 1、Fr 2、Fr 3、Fr 4、Fr 5；将Fr 5经硅胶，300～400目，三氯甲烷-甲醇＝2:1、1:1、1:2洗脱，得到3个组分Fr 5-1、Fr 5-2、Fr 5-3，其中Fr 5-2经过半制备HPLC分离纯化得到化合物FJ-12，即血人参苷。

5.如权利要求4所述的化合物的提取方法，其特征在于：所述的用三氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱是；按照三氯甲烷-甲醇＝100∶0；100∶5；100∶10；100∶25；100∶50；100∶100；0∶100进行洗脱，每一个梯度分别收集6～8份。

6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物的应用，其特征在于：用于制备抗炎类药物。