CN103922935A - 一种从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法及用途 - Google Patents
一种从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法,是将山莓叶用乙醇60℃水浴加热旋转提取3~5次,合并提取液,真空浓缩得提取物浸膏;将提取物浸膏加水溶解,用乙酸乙酯萃取,萃取液进行硅胶柱色谱分离,先用中压柱层析分离,洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯,乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱,进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抗腹泻活性强的组分;将该组份进行低压硅胶柱层析分离纯化,用氯仿与甲醇进行梯度洗脱,合并相同组分,再将进行家兔离体肠运动实验筛选出其抑制作用最强的组分用反相ODS填料开放柱进行柱色谱分离,用甲醇-水洗脱,得到该化合物。该化合物首次从山莓叶中获得,其具有抑制肠蠕动、抗腹泻作用,可用于制备新的天然抗腹泻药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体地说,是涉及一种山莓叶具有抑制肠蠕动、抗腹泻作用的化合物对羟基肉桂酸乙酯的分离方法以及该化合物的用途。
背景技术
山莓(Rubus corchorifolius L.f)是蔷薇科悬钩子属植物,在我国除东北、甘肃、新疆、西藏外,全国均有分布,野生资源蕴藏量相当大。山莓是湘西、鄂西北等地区少数民族长期使用的传统中草药,在湘西地区群众常将嫩叶捣碎饲喂动物治疗腹泻,效果良好,是民间公认的安全、有效的抗腹泻秘方。朱深海及本实验室前期研究表明:山莓叶提取物对家兔离体十二指肠、空肠、回肠、结肠的运动均有抑制作用,这一研究有提示我们继续研究山莓叶中抑制肠蠕动的活性成分。但目前对于山莓叶中具有抑制肠蠕动的化合物没有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从山莓叶中分离化合物对羟基肉桂酸乙酯的方法,该化合物具有抑制肠蠕动活性。
本发明提供的从山莓叶中分离的化合物,化学名为:对羟基肉桂酸乙酯,结构式如式(I)所示:
(I)
其分离方法包括以下步骤:
(1)将山莓叶用浓度为80~100%乙醇60℃水浴加热旋转提取3~5次,山莓叶与乙醇质量体积比为1g:15~20mL,每次2h,合并提取液,真空浓缩回收溶剂,得提取物浸膏;
(2)将提取物浸膏加水溶解,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取液,减压回收溶剂,得各提取部位粉末;以抗家兔离体肠运动实验为活性跟踪模型,得出其活性段主要集中在乙酸乙酯层;
(3)将乙酸乙酯层萃取物进行硅胶柱色谱分离,先用中压柱层析分离,洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯,乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱,洗脱的流速为 15 mL/min,柱层析的检测波长分别为 220 nm、265 nm,同时每管收集的流份量为20 mL;进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抗腹泻活性强的组分;
(4)将抗腹泻活性强的组份进行低压硅胶柱层析分离纯化,用氯仿与甲醇进行梯度洗脱,每20 mL 收集一瓶,通过薄层层析法分析,将含有相同组分的流份合并,并进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抑制作用最强的组分,将该组分用反相ODS填料开放柱进行柱色谱分离,用甲醇-水洗脱,得到该化合物。
步骤(1)中,加热旋转提取3次,山莓叶与乙醇质量体积比分别为1g:7mL,1g:4mL,1g:4mL。
步骤(3)中,用石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱时,石油醚和乙酸乙酯的体积配比依次为100:0、50:50、20:80,乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱时,乙酸乙酯和甲醇的体积配比依次为100:0、80:1、40:1、20:l、10:l、5:1、l:l、0:1。
步骤(4)中,用氯仿与甲醇进行梯度洗脱洗脱时,氯仿和甲醇的体积配比依次为25:1,20:1 ,15:1 ,10:1 ,5:1。
经核磁共振检测分析和高分辨质谱分析,确定本发明提取的化合物为对羟基肉桂酸乙酯,首次从山莓叶中获得,且经兔离体十二指肠运动实验验证,它能显著抑制兔离体十二指肠的收缩张力,同时减小肠道蠕动频率,表现出很强的抑制肠蠕动的作用,在5~160 mg/mL浓度范围内,抑制效果优于阿托品。因此,可以用于制备新的天然抗腹泻药物。
附图说明
图1 对羟基肉桂酸乙酯及阿托品对家兔离体十二指肠张力增量变化率的影响。
具体实施方式
现结合实施例,对本发明作详细描述。
实施例1 制备本发明所得化合物并检验其活性
1、制备山莓叶提取物
将5 Kg中草药山莓叶,用85%乙醇60℃水浴加热旋转提取3次,山莓叶质量(g)与乙醇体积(mL)比分别为1:7,1:4,1:4,每次2 h,合并提取液,真空浓缩回收溶剂,得提取物浸膏;
2、筛选抑制肠蠕动活性部位
将浸膏加水溶解,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,将溶解好的液体每次加入1/5体积的萃取剂,萃取约15-20次,至萃取剂颜色接近无色为止。分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取液,减压回收溶剂,得各提取部位粉末;以抗家兔离体肠运动实验为活性跟踪模型,得到萃取后,其活性段主要集中在乙酸乙酯层;
3、抗家兔离体肠运动活性单体制备及活性研究
将抑制肠蠕动的活性最强的乙酸乙酯层萃取物进行硅胶柱色谱分离,先用中压柱层析分离,洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯( 石油醚:乙酸乙酯体积比=100:0 ,50:50,20:80) ,乙酸乙酯与甲醇( 乙酸乙酯: 甲醇体积比=100:0 ,80:1 ,40:1 ,20:l ,10:l ,5:1,l:l ,0:1) 进行梯度洗脱,洗脱的流速为 15 mL/min,柱层析的检测波长分别为 220 nm、265 nm,同时每管收集的流份量为20 mL。得到Fr.1,Fr.2,Fr.3,Fr.4,Fr.5,Fr.6,Fr.7,Fr.8,Fr.9,Fr.10,Fr.11,Fr.12,Fr.13,Fr.14,Fr.15,Fr.16,Fr.17共17个组分。进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抑制作用最强的组分为Fr.10(505-560号)。
将抗腹泻活性强的组份Fr.10 进行低压硅胶柱层析分离纯化,用氯仿与甲醇进行梯度洗脱(氯仿:甲醇体积比=25:1,20:1 ,15:1 ,10:1 ,5:1),每20 mL 收集一瓶,通过薄层层析法分析,采用碘显色,将含有相同组分的流份合并,得到Fr.a,Fr.b,Fr.c,Fr.d,Fr.e,Fr.f,Fr.g,Fr.h,Fr.i,Fr.j,Fr.k,Fr.l,Fr.m,Fr.n,Fr.o,Fr.p,Fr.q,Fr.r,Fr.s,Fr.t共20个组分。进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抑制作用最强的组分为Fr.m(244-269号)。将该组分用反相ODS填料开放柱进行柱色谱分离,用甲醇-水洗脱,得到该化合物8.30 mg。
4、活性物质的结构鉴定
经核磁共振检测分析和高分辨质谱分析,确定本发明化合物的化学结构为对羟基肉桂酸乙酯。其理化性质为:浅黄色无定型粉末,ESI-MS m/z 191[M-H]+ ,163 [M-CH2CH3]+ ,119[M-COOCH2CH3]+。1H-NMR谱数据(600MHz,CDCl3)为:δ:1.31(3H ,t,J=7.1 Hz,-CH3);4.24(2H,q,J=7.1Hz,-CH2-O-);6.28(1H,d,J=16Hz,H-2);6.82(2H,d,J=8.6Hz,H-3',5');7.41(2H,d,J=8.6Hz,H-2',6');7.63(1H,d,J=0.4Hz,H-3)。13C-NMR (600 MHz,CDCl3) δ: 167.51 (C=O),158.0(C-4),144.83(C-7),129.9(C-2,6),126.9(C-1),115. 90(C-3,5),114.92(C-8),60.58(-O-CH2-),14.58(-CH3) 。
5、采用对家兔离体十二指肠运动的影响来证明其活性
(1)实验材料:
药物:对羟基肉桂酸乙酯;
动物:健康新西兰兔1只,毛色白,体重2~2.5 Kg,雌雄不限,购于广东中医药大学实验动物中心;
试剂:氯化钠,氯化钾,氯化钙,碳酸氢钠,磷酸二氢钠,氯化镁,葡萄糖。
(2).实验方法
将家兔禁食24 h,用静脉注射空气法使家兔死亡,迅速剖开腹部,距胃幽门5 cm为起点剪取十二指肠约8 cm,放入38 ℃的台式液中,剪成长约2~3 cm的肠段。将离体肠段放在通气的38 ℃的台式液中,充分洗去内容物,然后再移入37~38 ℃的新鲜台式液中通气备用。
张力换能器与生物信号采集处理系统的输入端口第一通道连接,选择“药理实验项目中的药物对离体肠肌运动的影响”实验模块,用5 g砝码定标。取一肠段,用丝线在肠段两端结扎,一端做一短线环固定在麦氏浴槽中L管下方,另一端扎线与肌肉张力换能器杠杆相连。在(38±0.5)℃条件下,不断往台式液中通气,用生物信号采集处理系统记录肠段收缩曲线。观察在正常情况下离体肠段的自动节律性收缩,瞄记3 min,然后加入100 μL已配好的样品,同时打下加样标记,以收缩张力(g)、收缩频率(次/min)为指标,记录3 min。用38 ℃台式液冲洗多次,待肠段恢复正常后再进行下一次加样。同一肠段可连续使用多次。将制备好的立体肠管用药物阿托品进行模型的验证实验。若阿托品加入后,肠对它立即做出反应,波形图立即振幅减弱,说明肠在实验环境中具有与体内类似的环境,证明造模成功。然后再进行对羟基肉桂酸乙酯的实验。
用SAS统计分析软件处理,采用配对实验设计,实验数据以(平均数±标准差)表示,组间数据采用t检验。对离体肠管运动影响实验在加样前选10个波形,加样后每18 s选取一个波形,共10个波形,分别计算张力增量和频率,张力增量=最大张力—最小张力,即为峰值,张力增量变化率(%)=(加样前张力—加样后张力)/加样前张力*100。结果见表1.
表1 对羟基肉桂酸乙酯及阿托品对家兔离体十二指肠运动的影响()
注:**表示与给药前比较差异极显著(P<0.01)
*表示与给药前比较差异显著(P<0.05)
△表示与给药前比较无显著差异(P>0.05)
由表1可以看出,对羟基肉桂酸乙酯可以抑制家兔离体十二指肠的运动张力和频率。在加入不同浓度对羟基肉桂酸乙酯后,家兔十二指肠运动的张力变化与加药前均有极显著差异(P<0.01),加样后的张力比加样前的张力明显变小,同时加样后兔离体肠管的运动频率也明显减小。
由图1可以看出,阿托品和对羟基肉桂酸乙酯都有很好的抑制兔离体十二指肠管运动的作用,在加入40 mg/mL对羟基肉桂酸乙酯时,对兔离体肠管的运动张力抑制作用达到最大,为67.40%。并且在5~160 mg/mL浓度范围内,对羟基肉桂酸乙酯对兔离体肠管的运动张力抑制作用明显强于阿托品。
由表1和图1可以看出,对羟基肉桂酸乙酯具有抑制兔离体十二指肠管运动张力和频率的双重效果,具有很好的抗腹泻作用,可以用于制备新的抑制肠蠕动、抗腹泻药物。本发明为制备抗腹泻药物提供了新的来源。
Claims (5)
1.一种从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将山莓叶用浓度为80~100%乙醇60℃水浴加热旋转提取3~5次,山莓叶与乙醇质量体积比为1g:15~20mL,每次2h,合并提取液,真空浓缩回收溶剂,得提取物浸膏;
(2)将提取物浸膏加水溶解,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取液,减压回收溶剂,得各提取部位粉末;以抗家兔离体肠运动实验为活性跟踪模型,得出其活性段主要集中在乙酸乙酯层;
(3)将乙酸乙酯层萃取物进行硅胶柱色谱分离,先用中压柱层析分离,洗脱剂选用石油醚与乙酸乙酯,乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱,洗脱的流速为 15 mL/min,柱层析的检测波长分别为 220 nm、265 nm,同时每管收集的流份量为20 mL;进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抗腹泻活性强的组分;
(4)将抗腹泻活性强的组份进行低压硅胶柱层析分离纯化,用氯仿与甲醇进行梯度洗脱,每20 mL 收集一瓶,通过薄层层析法分析,将含有相同组分的流份合并,并进行家兔离体肠运动实验,筛选出其抑制作用最强的组分,将该组分用反相ODS填料开放柱进行柱色谱分离,用甲醇-水洗脱,得到该化合物。
2.根据权利要求1所述的从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法,其特征在于,步骤(1)中,加热旋转提取3次,山莓叶与乙醇质量体积比分别为1g:7mL,1g:4mL,1g:4mL。
3.根据权利要求1所述的从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法,其特征在于,步骤(3)中,用石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱时,石油醚和乙酸乙酯的体积配比依次为100:0、50:50、20:80,乙酸乙酯与甲醇进行梯度洗脱时,乙酸乙酯和甲醇的体积配比依次为100:0、80:1、40:1、20:l、10:l、5:1、l:l、0:1。
4.根据权利要求1所述的从山莓叶中分离对羟基肉桂酸乙酯的方法,其特征在于,步骤(4)中,用氯仿与甲醇进行梯度洗脱洗脱时,氯仿和甲醇的体积配比依次为25:1,20:1 ,15:1 ,10:1 ,5:1。
5.从山莓叶中分离的对羟基肉桂酸乙酯在制备抗腹泻药物方面的用途。
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