CN104161859B - 一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物及其制备方法，该中药组合物将炒枳实总黄酮、炒枳实总生物碱和炒白术挥发油部位有机混合，并用药效实验证明了该治疗脾胃疾病的中药组合物及其提取工艺的合理性。本发明为成品质控标准的制定提供了依据；同时大大降低得膏率，也为进一步开展基于有效部位的第五类国家新药的研发奠定了基础。

Description

一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物及其制备方法。
背景技术
枳术颗粒的处方最初源自医圣张仲景的《金匿要略.水气病脉证并治》篇中的“枳术汤”，原方由“枳实七枚，白术二两”两味药材组成，配伍精当。后经金代张元素衍变为“枳术丸”，衍变方重用炒白术并用荷叶包裹制丸，健脾消食，标本兼治，受到历代推崇，并在该方的基础上衍变为诸多方剂。1977年版《中国药典》最初收载本方，命名为“枳术丸”。枳术颗粒是在枳术丸原方基础上改剂型的原国家四类新药，并被列入国家非处方药目录和国家中药保护品种目录。
但是，目前枳术颗粒生产中存在很多问题：首先，本方为经验方，缺乏现代药理药效学研究；其次，质量标准不一致，2010年版中国药典规定枳实药材含量测定指标是生物碱类成分辛弗林，而目前成品则检测枳实中以柚皮苷为代表的黄酮类成分，指标的确定尚缺乏药效学依据。第三，生产中采用流化床制粒，对操作的要求高，规模化生产困难，是影响该产品产量扩大的“瓶颈”。因此，组方药效及工艺的合理性还有待进一步研究分析。
目前，对枳术颗粒组方有效部位的研究鲜有报道，而且研究多集中在单味药材上，不同部位的作用强弱及药效间相互作用尚不明确。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物。
本发明的另一目的是提供用于治疗该脾胃疾病的中药组合物的制备方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物，该组合物以炒白术40重量份和炒枳实20重量份为原料，分别提取得到炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位和炒白术挥发油部位，将炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位和炒白术挥发油部位混合制成治疗脾胃疾病的中药组合物。
所述的炒枳实总生物碱部位是通过以下方法制备得到的：将炒枳实用药材6～10倍量，浓度为70～80％的乙醇提取1～3次，每次1～1.5h，过滤，合并滤液得到提取液；向炒枳实提取液中加入浓氨水调节pH8～9，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1～1：1。
所述的炒枳实总黄酮部位是通过以下方法制备得到的：将分离出炒枳实总生物碱部位的炒枳实提取液用盐酸调节pH6～7，上样到大孔树脂柱，最大上样量为2～3倍柱体积，吸附2～3h后水洗，再用浓度为70％～90的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位。
所述的炒白术挥发油部位是通过以下方法制备得到的：将炒白术粉碎过50～100目筛，用炒白术药材4～6倍量水，水蒸气蒸馏提取3～5小时，收集挥发油部位。
上述用于治疗脾胃疾病的中药组合物可与药学上可接受的辅料制成口服制剂。
上述用于治疗脾胃疾病的中药组合物的制备方法以药炒白术40重量份、炒枳实20重量份为原料，包括以下步骤：
1)按照重量份配比称取原料药炒白术40份、炒枳实20份，备用；
2)醇提炒枳实：将炒枳实用药材6～10倍量，浓度为70～80％的乙醇提取1～3次，每次1～1.5h，过滤，合并滤液得到提取液；
3)提取炒枳实生物碱部位：取炒枳实提取液，加入浓氨水调节pH8～9，优选加入浓氨水调节pH9，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1～1：1；优选提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1，优选萃取次数为3～4次。加入浓氨水调节pH8～9前可将炒枳实提取液浓缩至1g生药/ml。
4)提取炒枳实总黄酮部位：将分离出炒枳实总生物碱部位的炒枳实提取液用盐酸调节pH6～7，上样到大孔树脂柱，最大上样量为2～3倍柱体积，吸附2～3h后水洗，再用浓度为70％～90的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位；优选使用的大孔树脂柱的型号为D101型或DA201型，最优选D101型。用盐酸调节pH6～7之后，可将炒枳实提取液稀释至0.1g生药/ml再上样。
5)提取炒白术挥发油：将炒白术粉碎过50～100目筛，用炒白术药材4～6倍量水，水蒸气蒸馏提取3～5小时，收集挥发油部位；优选提取炒白术挥发油步骤为：将炒白术粉碎过50目，用药材4倍量水，水蒸气蒸馏提取3小时，收集得到挥发油部位。
将上述得到的炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位混合即得。
炒枳实药材质地坚硬，溶剂不易浸润，直接提取很难提取完全，转移率偏低。本发明根据预实验结果可先将炒枳实粉成粗粉再进行提取，炒枳实总黄酮的转移率能达到80％以上，结果稳定。
上述方法中，优选步骤“2)”中醇提炒枳实具体步骤为：将炒枳实用药材6倍量，浓度为70％的乙醇提取3次，每次1.5h。
步骤“4)”中稀释炒枳实提取液作为上样液，其中总黄酮浓度为12～24mg/ml，优选12mg/ml，使用的乙醇浓度优选为70％。
优选步骤“4)”中最大上样量为2倍柱体积，吸附2h后以2倍柱体积水洗，再用3倍柱体积70％乙醇洗脱。
本发明还可以以炒白术40重量份、炒枳实20重量份和荷叶6重量份为原料，分别提取得到炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位和荷叶碱部位，将炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位和荷叶碱部位混合制成治疗脾胃疾病的中药组合物。炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位按照本发明上述方法制备得到，而荷叶碱部位由荷叶按照常规提取方法制备得到即可。通常荷叶碱部位的提取率在0.1％左右。
本发明所述的中药组合物具有健脾消食，行气化湿的功效，可用于制备治疗脾胃虚弱，食少不化，脘腹胀满的药物。
与现有技术比较本发明的有益效果：本发明提供了治疗脾胃疾病的中药组合物及其制备方法，同时考察了组合物各组成及其组合物整体对脾虚小鼠胃泌素、胃动素和血管活性肠肽的影响，证明组合物整体对脾虚小鼠胃肠激素的调节效果最好。本发明为成品质控标准的制定提供了依据；可减轻原药材质量波动对成品的影响；更重要的是药材经提取分离可以大大降低得膏率，方便制剂。也可以进一步开展基于有效部位的第五类国家新药的研发。
本发明针对炒枳实和炒白术不同的原料采用不同的提取工艺，使得各个原料能够得到充分应用，具体体现在以下几个方面：
(一)炒枳实有效部位提取分离工艺选择
本实验先用正交设计法，以得膏率、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林含量为指标，优选出炒枳实的最佳醇提工艺，再用浓氨水调节pH后，用乙酸乙酯萃取出生物碱类成分，再调节pH，采用柱层析，分离纯化总黄酮类成分。
1、炒枳实有效部位的提取
1.1.炒枳实醇提正交设计
通过预实验结果发现浸膏在酸水中溶解性不好，捏溶慢，不易过滤，且沉淀与1％三氯化铝反应为阴性。选择对得膏率和各指标含量影响较大的几个因素：乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数，按照正交因素水平表L9(34)设计实验，浸膏置于真空干燥箱中80℃以下干燥得干膏。高效液相色谱测定提取液中各成分的含量。以得膏率、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量为指标，筛选出炒枳实提取的最佳工艺参数。正交实验因素水平表见表1，正交实验安排结果见表2，正交实验结果见表3.
表1 正交实验因素水平表
表2 正交实验安排表
表3 正交实验结果表
(表中提供了9个试验方案。如第6号试验是A2B3C1D2，即80％乙醇，10倍量回提取2次，每次1小时，依此类推。)
1.2.炒枳实醇提实验结果与方差分析
以干膏重为指标，极差分析结果D>A>C>B，即影响因素排列顺序为提取次数>乙醇浓度>溶剂用量>提取时间。各因素与水平之间的最佳组合为A3B2C1D1，以B项为误差项，进一步进行方差分析，结果见表4
表4 以干膏重为指标的方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 方差 F比 显著性
A 65.964 2 32.982 2.151 P＞0.05
C 35.886 2 17.943 1.170 P＞0.05
D 373.358 2 186.679 12.174 P＞0.05
误差(B) 30.67 2
(F0.05(2,2)＝19.00)
各因素对实验结果影响均无统计学意义。提取工艺最佳组合为提取三次，乙醇浓度为70％，提取1.5小时，乙醇用量为10倍量。
以橙皮苷含量为指标，极差分析结果A>B>D>C，即影响因素排列顺序为乙醇浓度>提取时间>提取次数>溶剂用量。各因素与水平之间的最佳组合为A3B3C1D1，以C项为误差项，进一步进行方差分析，结果见表5
表5.以橙皮苷为指标的方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 方差 F比 显著性
A 0.063 2 0.032 114.040 P＜0.05
B 0.038 2 0.019 67.960 P＜0.05
D 0.002 2 0.001 3.040 P＞0.05
误差(C) 0.001 2
(F0.05(2,2)＝19.00)
乙醇浓度和提取时间对实验结果影响有统计学意义。提取工艺最佳组合为提取三次，乙醇浓度为70％，提取1小时，乙醇用量为10倍量。
以柚皮苷含量为指标，极差分析结果B>C>A>D，即影响因素排列顺序为提取时间>溶剂用量>乙醇浓度>提取次数。各因素与水平之间的最佳组合为A2B3C2D1，以D项为误差项，进一步进行方差分析，结果见表6.
表6 以柚皮苷为指标的方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 方差 F比 显著性
A 0.723 2 0.3615 4.757 P＞0.05
B 11.557 2 5.7785 76.033 P＜0.05
C 4.168 2 2.084 27.421 P＜0.05
误差(D) 0.15 2
(F0.05(2,2)＝19.00)
提取时间和溶剂倍量对实验结果影响均有统计学意义。提取工艺最佳组合为提取三次，乙醇浓度为80％，提取1小时，乙醇用量为8倍量。
以新橙皮苷含量为指标，极差分析结果B>C>D>A，即影响因素排列顺序为提取时间>溶剂用量>提取次数>乙醇浓度。各因素与水平之间的最佳组合为A3B3C2D3，以A项为误差项，进一步进行方差分析，结果见表7
表7.以新橙皮苷为指标的方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 方差 F比 显著性
B 6.614 2 3.307 3.275 P＞0.05
C 6.443 2 3.222 3.191 P＞0.05
D 4.407 2 2.204 2.182 P＞0.05
误差(A) 2.019 2
(F0.05(2,2)＝19.00)
各因素对实验结果影响均无统计学意义。提取工艺最佳组合为提取一次，乙醇浓度为70％，提取1小时，乙醇用量为8倍量。
以辛弗林含量为指标，极差分析结果C>B>D>A，即影响因素排列顺序为溶剂用量>提取时间>提取次数>乙醇浓度。各因素与水平之间的最佳组合为A2B2C2D3，以A项为误差项，进一步进行方差分析，结果见表8
表8 以辛弗林为指标的方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 方差 F比 显著性
B 0.008 2 0.004 8.000 P＞0.05
C 0.026 2 0.013 26.000 P＜0.05
D 0.002 2 0.001 2.000 P＞0.05
误差(A) 0.001 2
(F0.05(2,2)＝19.00)
溶剂倍量对实验结果影响有统计学意义。提取工艺最佳组合为提取一次，乙醇浓度为80％，提取1.5小时，乙醇用量为8倍量。
为更合理评价正交结果，寻找最佳提取工艺，对四个评价指标进行综合评分，计算方法如下：在四个指标中，分别选取最高者作为100分，其余按公式计算：得分y’＝100-最高值+yi，考虑到炒枳实中辛弗林的含量较少故将辛弗林的加权系数定为0.4，橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的加权系数均为0.1，得膏率的加权系数定为0.3。通过直观分析，以综合评分为指标，得出各因素对提取结果影响顺序为D﹥A﹥C﹥B，最佳工艺为A3B2C1D1，方差分析结果见表9
表9 综合评分为指标的方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 方差 F比 显著性
A 5.871 2 2.935 3.934 P＞0.05
C 1.524 2 0.762 1.021 P＞0.05
D 28.192 2 14.096 18.896 P＞0.05
误差(B) 1.492 2
(F0.05(2,2)＝19.00)
结果表明，乙醇浓度、提取时间、溶剂倍量和提取次数四因素对实验结果均没有显著性差异，最佳工艺条件为A3B2C1D1。溶剂倍量10倍量与6倍量差别不大，从生产成本考虑选用6倍量。即最佳工艺条件为：6倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h。
根据选定的最佳工艺参数实验，对正交实验结果进行验证。以得膏率、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、和辛弗林、为考察指标，3批试验平均得膏率为52.45％，橙皮苷为0.49％，柚皮苷为22.13％，新橙皮苷为10.97％，辛弗林为0.74％，由验证实验结果可知，三次实验得膏率适中，各成分含量都处于较高水平。筛选的提取工艺稳定可行，故确定最佳提取工艺是：6倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h。
2、炒枳实总生物碱的分离
2.1实验方法
取炒枳实粗颗粒1000g，按上述最佳提取工艺提取，合并提取液，浓缩至1000ml。加入浓氨水调节pH，再用一定量的乙酸乙酯萃取。合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得。
2.2单因素考察
(1)溶液pH的考察
取上述提取液三份各100ml，加入浓氨水调节pH分别为7、8、9，分别用乙酸乙酯萃取三次，每次100ml。合并萃取液，混匀，取出5ml备用，其余回收乙酸乙酯后，真空干燥，得干膏，称重。紫外分光光度法测定干膏中总生物碱的含量。结果见表10
表10 不同pH萃取干膏中总生物碱含量表
由结果可知，在pH＝9时干膏中总生物碱的含量最高，故确定萃取液pH为9。
(2)乙酸乙酯用量的考察
取3.2中提取液300ml，加入氨水调节pH＝9，分成三份，每份100ml分别用乙酸乙酯30ml、50ml、100ml萃取，各萃取三次。合并萃取液，回收乙酸乙酯，真空干燥，得干膏。结果见表11
表11 不同萃取液用量所得干膏量
由结果可知，乙酸乙酯用量越多，干膏得量越大，但是提取液：乙酸乙酯用量从2：1增加到1：1时，干膏得量仅增加6.99％。故确定提取液：乙酸乙酯液＝2：1。
(3)萃取次数的考察
取3.2中提取液300ml，加入氨水调节pH＝9，分成三份，每份100ml，用乙酸乙酯50ml萃取，分别萃取2次、3次、4次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，真空干燥，得干膏。结果见表12
表12 不同萃取次数所得干膏量
由结果可知，萃取四次与萃取三次结果差别不大，仅增加2.5％。故确定最佳萃取次数是三次。
2.3最佳萃取工艺及结果
综合上述实验，确定炒枳实总生物碱的最佳分离条件为：浓氨水调节pH＝9，提取液：乙酸乙酯＝2：1，萃取三次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，真空干燥，即得。经高效液相色谱法测定结果见表13
表13 炒枳实总生物碱结果表
炒枳实总生物碱干膏(g) 干膏得率(％) 辛弗林含量(％)
12 1.2 62
3、炒枳实总黄酮的分离
3.1实验方法
将分离出炒枳实总生物碱的炒枳实提取液用盐酸调节至pH＝7，上样至层析柱，吸附一定时间后先用水洗去杂质，再用一定浓度的乙醇液洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥即得。
3.2单因素考察
(1)分离树脂的筛选
预处理：取各个型号适量的树脂，用95％乙醇浸泡两天，再改为无水乙醇浸泡，用95％乙醇冲洗至流出液加三倍水无浑浊。临用前用大量的蒸馏水冲洗至无醇味。
静态吸附法考察：在100mL的烧杯中，分别加入一定量不同型号的树脂和25ml炒枳实提取液，150r/min室温振荡吸附24h，充分吸附后，取吸附残余炒枳实提取液，测定其平衡吸附浓度，计算各种树脂的比吸附量；再滤出上述己吸附平衡的树脂，先用20mL纯净水冲洗后用滤纸吸干，加入25mL95％乙醇，150r/min室温解吸附2h，取解吸附液测定其平衡解吸浓度，计算静态解吸附率；比较各种树脂的比吸附量Q和解吸附率De，筛选出吸附性能最好的树脂。
比吸附量Q(mg/g)＝(C0一Ce)V0/m (6)
解析率De＝Cd*Vd/(C0一Ce)V0*100％ (7)
C0＝12mg/ml为炒枳实上样液的浓度，Ce为平衡吸附浓度，Cd平衡解吸浓度，V0＝25ml为上样液的体积，Vd为解析液的体积，m为树脂的质量。
实验结果见表14
表14.不同类型树脂的吸附量、解析率比较
由实验结果可知：大孔树脂D101的比吸附量最大，解析率较高，在五种树脂中最适于炒枳实总黄酮分离。确定分离树脂为大孔树脂D101。
(2)上样液pH的考察
静态吸附法：取炒枳实提取液适量，用盐酸调节上样液pH分别3、4、5、6、7，各取25ml分别加入适量预处理后的大孔树脂D101在恒温震荡器中30℃吸附2h。分别测定上样液和吸附残留液的浓度。计算不同pH上样液的比吸附量Q。
结果见表15
表15.不同pH上样液比吸附量比较表
由实验结果可知：上样液pH＝7时，大孔树脂D101的比吸附量最大，确定上样液的最佳pH为7。
(3)吸附时间的考察
静态吸附法：取炒枳实提取液适量，用盐酸调节pH＝7，取25ml加入适量预处理后的大孔树脂D101在恒温震荡器中30℃吸附0.5h、1h、2h、4h、6h、8h后分别吸取少量平衡吸附液，分别测定上样液和平衡吸附液的浓度。计算不同吸附时间的比吸附量Q。结果见表16
表16.不同吸附时间的比吸附量比较表
由结果可知：随着吸附时间的延长，比吸附量先增加后降低，吸附2h的比吸附量最大，确定最佳吸附时间为2h。
(4)上样液浓度的考察
静态吸附法：取相同体积的炒枳实提取液四份，用盐酸调节pH＝7，用水稀释使其总黄酮浓度分别为4mg/ml、6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml。分别加入适量预处理后的大孔树脂D101在恒温震荡器中30℃吸附2h后分别吸取少量平衡吸附液，分别测定总黄酮含量。计算不同浓度上样液的比吸附量Q。结果见表17
表17.不同浓度上样液的比吸附量比较表
由结果可知：随着上样液浓度的增大，比吸附量先增大后降低，上样液浓度为12mg/ml时比吸附量最大，确定最佳上样液浓度为12mg/ml。
(5)最佳洗脱浓度的考察
静态吸附法：取浓度为12mg/ml的炒枳实提取液20ml，用盐酸调节pH＝7，加入适量预处理后的大孔树脂D101在恒温振荡器中30℃吸附2h，滤去吸附残留液，加入一定量不同浓度乙醇作为洗脱剂，震荡解析2h，测定解析液的浓度。计算不同浓度洗脱剂的解析率De。结果见表18
表18.不同浓度洗脱剂的解析率比较
由结果可知：随着洗脱剂乙醇浓度的增大，解析率增大，乙醇浓度达到70％以后，解析率变化不大，确定最佳洗脱剂为70％乙醇。
(6)最大上样量、水洗倍量、洗脱倍量的考察
动态吸附法：
取20g预处理过的大孔树脂D101树脂装柱，取浓度为12mg/ml的炒枳实提取液用盐酸调节pH＝7，上样，上样流速为3ml/min。每1/4柱体积(约6ml)收集一次流出液，依次编号，测定各流出液中总黄酮的浓度，绘制吸附曲线见图1，由图可见，当上样液序号为8即上样量为2倍柱体积时，流出液浓度达到吸附解吸平衡，确定最大上样量为2倍柱体积。
上述吸附饱和的树脂柱静置吸附2小时后，用纯水以相同流速洗去未吸附部分，每1/4柱体积收集一次流出液，测定各流出液中总黄酮的浓度，绘制水洗吸附曲线，见图2，由图可见，当水洗序号为8即水洗量为2倍柱体积时，流出液浓度已达平衡，确定水洗倍量为2倍柱体积。
将经过水洗后的树脂柱用70％乙醇以相同流速洗脱，每1/4柱体积收集一次流出液，测定各流出液中总黄酮的浓度，绘制洗脱曲线，见图3。由图可见，当洗脱液序号为12即洗脱剂用量为3倍柱体积时，已基本达到解吸平衡，确定洗脱剂的用量为3倍柱体积。
结果：最大上样量为2倍柱体积、水洗倍量为2倍柱体积、洗脱倍量为3倍柱体积。
3.3最佳分离工艺及结果
综合上述实验，确定炒枳实总黄酮的最佳分离工艺为：提取液调节pH＝7，总黄酮浓度为12mg/ml,上样到D101大孔树脂柱上，最大上样量为2倍柱体积，吸附2h后以2倍柱体积水洗，再用3倍柱体积70％乙醇洗脱，得炒枳实总黄酮部位，经高效液相色谱法测定结果见表19
表19 炒枳实总黄酮部位结果表
(二)炒白术有效部位提取工艺
本实验选用水蒸气蒸馏法提取炒白术挥发油，并通过单因素考察法考察药材粒度、加水倍量、提取时间等因素的影响，初步确定炒白术挥发油提取的最佳工艺。
1、实验方法
将炒白术粉碎，取50g加入一定量水，用水蒸气蒸馏法实验，采用挥发油提取器收集挥发油。以挥发油得量为指标，单因素考察法考察炒白术粉碎目数、加水量、提取时间对实验结果的影响。结果见表20-表22
表20 不同目数提取挥发油比较表
序号 目数 挥发油量(ml)
1 20 0.35
2 50 0.50
3 100 0.48
由结果可知：当炒白术的目数为50目时，水蒸气蒸馏法提取挥发油的量最大。确定炒白术的目数为50目。
表21 不同加水倍量提取挥发油比较表
序号 加水倍量 挥发油量(ml)
1 4 0.50
2 6 0.50
3 8 0.51
由结果可知：随着加水倍量的增大，挥发油得量增加不大，确定提取挥发油加水量为4倍量。
表22 不同提取时间提取挥发油比较表
序号 提取时间h 挥发油量(ml)
1 3 0.48
2 4 0.50
3 5 0.51
由结果可知：随着提取时间的增加，挥发油得量略有增加，提取3h与5h差别不大，确定提取时间为3h。
2、最佳分离工艺
综上所述：水蒸气蒸馏法提取分离炒白术挥发油的最佳工艺参数为，炒白术粉末过50目，水4倍量，提取3小时。
本发明各指标成分的测定方法如下：
1、高效液相色谱一测多评[1]法测定炒枳实总黄酮的含量
(1)色谱条件：
色谱柱：Agilent C18键和硅胶柱；流动相：乙腈-水(用磷酸调至pH＝3)(17：83)；流速：1ml/min；检测波长为283nm；柱温：35℃。
(2)对照品溶液的制备：
精密称定取柚皮苷对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为20.205ug/ml、40.410ug/ml、60.615ug/ml、80.82ug/ml、101.025ug/ml、202.050ug/ml、404.100ug/ml的对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：
取干膏0.5g精密称定，置于50ml容量瓶中，加入适量甲醇，超声提取30min，放冷，加甲醇至刻度。精密吸取1ml到10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再精密吸取稀释后的溶液2ml到10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，取续滤液即得。
(4)测定方法：
分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
以柚皮苷对照品的峰面积A为横坐标，以其进样量Q(ng)为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为：y＝0.0006x+9.4682，R2＝1。
一测多评法：以柚皮苷为内标物，同时测定炒枳实中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量，原理如下：
在线性范围内，进样量Q与检测器响应值A成正比，f＝Q/A,
进样量为10ul时，测得f柚/柚皮芸香苷＝0.8829，f柚/橙＝3.9075，f柚/新＝1.5416
含量
X：柚皮芸香苷、橙皮苷或新橙皮苷；n：稀释倍数；V：提取液总体积(ml)；
m：干膏质量(g)。
2、高效液相色谱法测定炒枳实总生物碱[2]的含量
(1)色谱条件：
色谱柱：Lichrospher C18键和硅胶柱；流动相：甲醇-水(0.2％磷酸钠，0.3％十二烷基硫酸钠，磷酸调节pH为3.5)(50：50)；流速：1ml/min；检测波长为275nm；柱温：35℃。
(2)对照品溶液的制备：
精密称取辛弗林对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为10.128ug/ml、20.255ug/ml、40.510ug/ml、60.765ug/ml、81.02ug/ml、162.040ug/ml、405.1ug/ml的对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：
取干膏0.5g精密称定，置于50ml容量瓶中，加入适量2％醋酸溶液，超声提取30min，放冷，加2％醋酸溶液至刻度。精密吸取1ml到10ml容量瓶中，加2％醋酸溶液至刻度，摇匀，再精密吸取稀释后的溶液1ml到10ml容量瓶中，加2％醋酸溶液至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45um)滤过，取续滤液即得。
(4)测定方法：
密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
以辛弗林对照品的峰面积A为横坐标，以其进样量Q(ng)为纵坐标绘制标准曲线。回归方程为：y＝0.0022x+37.186，R2＝1。
按标准曲线方程计算干膏中辛弗林的含量。
3、紫外分光光度法测定炒枳实总黄酮
(1)仪器参数设定：
以柚皮苷为指标，紫外分光光度法测定炒枳实中总黄酮的含量。全波长扫描柚皮苷在284nm处有最大吸收，故确定284nm为检测波长。
(2)对照品溶液的制备：
精密称定取柚皮苷对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为6.093ug/ml、10.155ug/ml、20.310ug/ml、25.388ug/ml、30.465ug/ml、60.93ug/ml的对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备
称取2.2.3.1中干膏0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
(4)标准曲线的制作
分别取少量上述对照品溶液于洁净的比色皿中，放入紫外分光光度计内，在波长284nm下以溶剂甲醇为空白校零，分别测定各浓度的吸光值A，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
(5)测定方法：
取供试品溶液适量，加到洁净比色皿中，测定吸光值Ax。必要时稀释一定倍数，使吸光值在线性范围内。用标准曲线方程计算各样品的浓度。
4、紫外分光光度法测定炒枳实总生物碱
(1)仪器参数设定：
以辛弗林为指标，紫外分光光度法测定炒枳实中总生物碱的含量。全波长扫描柚皮苷在225nm处有最大吸收，故确定225nm为检测波长。
(2)对照品溶液的制备：
精密称定取辛弗林对照品适量，加甲醇配制成浓度分别为2.068ug/ml、4.136ug/ml、6.204ug/ml、8.272ug/ml、10.340ug/ml、15.01ug/ml、20.680ug/ml的对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：
称取2.2.2.1中干膏粉0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)标准曲线的制作：
分别取少量上述对照品溶液于洁净的比色皿中，放入紫外分光光度计内，在波长225nm下以溶剂甲醇为空白校零，分别测定各浓度的吸光值A，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：y＝0.0453x+0.0377，R2＝0.9936。
(5)测定方法：
取供试品溶液适量，加到洁净比色皿中，测定吸光值Ax。必要时稀释一定倍数，使吸光值在线性范围内。用标准曲线方程计算各样品的浓度。
(三)治疗脾胃疾病的中药组合物对脾虚小鼠胃肠激素影响
实验采用大黄灌胃给药复制小鼠脾虚模型，考察了药物不同分离部位单独给药及组合给药对小鼠胃肠激素的影响。用酶联免疫法测定小鼠血清胃泌素、十二指肠组织胃动素和胃窦组织血管活性肠肽的含量。
1仪器与试剂
1.1实验动物
清洁级ICR雄性小鼠，体重18-22g，由江苏大学实验动物中心提供，证件号为SCXK(苏)2009-0002。
1.2实验仪器
FJ-200型高速分散匀质机，上海金达生化仪器有限公司；AXTDL5M型台式低速冷冻离心机，盐城市安信实验仪器有限公司；GNP-9080BS-Ⅲ隔水式恒温培养箱，上海新菌医疗器械制造有限公司；TECAN InfiniteF200/M200型多功能酶标仪，瑞士TECAN公司等
1.3实验药品
大黄：精华制药亳州康普制药有限公司，批号130901；多潘立酮片：西安杨森制药有限公司，批号130426620；枳术颗粒：南京中山制药有限公司，批号131103；炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位以实施例1方法制备；荷叶碱：中国药品生物制品检定所，批号111566-200402；小鼠胃动素、胃泌素、血管活性肠肽酶联免疫试剂盒，均由南京森贝伽生物科技有限公司提供，批号201312
2、动物分组与给药
小鼠适应性喂养3d，按体重随机分成9组，除对照组外，其余各组小鼠根据文献[7]方法灌胃2g/ml大黄水浸煎液10ml/kg复制小鼠脾虚模型。造模的同时给药，对照组、模型组给予等剂量的0.5％CMC-Na溶液。每日19:30灌胃给药10ml/kg,每日一次，连续给药14d。具体分组见表23
表23 各组给药一览表
根据文献[3]，动物所用药物临床等效剂量以mg/kg-mg/m2转换因子换算，结合实际，人、小鼠体重分别以70kg、20g计，按体表面积折算成小鼠等效用量见表24
表24 各成分的小鼠给药剂量
3、取样与检测
所有小鼠于末次给药后禁食12h，采用摘眼球取血，4℃静置凝结后，以3000r/min离心10min取上清液，分装后置-20℃保存，备用。取血后，颈椎脱臼法处死动物，分别剖取大鼠胃窦部及幽门下1.5cm十二指肠降部，去除附着脂肪并以冰冷生理盐水洗去残物，拭干水分，称定重量。加入一定PBS缓冲液，匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，分装后置-20℃冰箱中保存，备用。
由于胃肠的正常运动与GAS、MTL和VIP的关系密切。脾虚动物胃肠激素分泌紊乱导致胃肠功能异常。采用酶联免疫法测定小鼠血清GAS，十二指肠中MTL和胃窦组织中VIP的含量。按照酶联免疫检测试剂盒说明书操作步骤进行。统计方法
数据以均值±标准差(±SD)表示，组间比较用t检验。
4结果
4.1小鼠造模后表现
实验期间隔天称量记录一次小鼠体重、余食量并给予一定食量。观察小鼠精神状态，活动状况及皮毛色泽状况。给药第三天开始，除对照组外其余各组小鼠出现不同程度的：食量减少；消瘦，体重减轻；大便溏泄等脾虚症状，以模型组最为明显。
4.2小鼠体重变化
给药后模型组小鼠体重减轻，与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)；各给药组小鼠体重增加，与模型组比较均有显著差异；除炒枳实总生物碱组外，其余各给药组与枳术颗粒组比较均没有显著性差异。结果见表25
表25 枳术颗粒不同组分对脾虚小鼠体重的影响(±SD)
注：与模型组比较*P＜0.01，与枳术颗粒组比较▲P＜0.01。
4.3小鼠胃肠激素含量变化
与对照组比较，模型组小鼠血清GAS含量显著降低(P＜0.05)，十二指肠组织胃动素含量显著降低(P＜0.01)，胃窦组织血管活性肠肽含量显著升高(P＜0.01)。枳术颗粒不同组分对模型组小鼠胃肠激素均有不同程度的调节作用。结果见表26
表26 枳术颗粒不同组分对脾虚小鼠胃肠激素的影响(±SD)
注：与模型组比较*P＜0.05，与枳术颗粒组比较▲P＜0.05，与多潘立酮组比较※P＜0.05。
4.4对脾虚小鼠血清GAS的影响
GAS主要是由胃窦及小肠上皮黏膜C细胞分泌的一种胃肠激素,具有营养保护胃肠黏膜，增强胃肠黏膜保护因子，促进胃酸释放，增强胃动力等作用，血清胃泌素水平可作为脾虚证诊断及疗效评定的客观指标。
炒枳实炒白术组、枳术方组和枳术颗粒组均能升高小鼠血清GAS的含量，与模型组比较有显著差异(P＜0.05)。炒枳实炒白术组和枳术方组与枳术颗粒组比较没有显著差异。
4.5对脾虚小鼠十二指肠组织MTL的影响
MTL主要由十二指肠和近端空肠粘膜隐窝中M细胞释放，,实验证实MTL对胃运动和胃电活动都有明显的促进作用M细胞分泌的MTL与胃动力密切相关。
除炒枳实生物碱组外，其余各给药组均能显著升高小鼠十二指肠组织MTL的含量，与模型组比较有显著差异(P＜0.05)。且炒枳实总黄酮组与枳术颗粒组比较没有显著性差异，与多潘立酮组比较有显著差异；炒枳实组(含有炒枳实总黄酮部位、总生物碱部位)与枳术颗粒组和多潘立酮组比较均没有显著差异。
4.6对脾虚小鼠胃窦组织血管活性肠肽的影响
VIP由胃肠道粘膜上的D1细胞所分泌,VIP能抑制胃酸及胃蛋白酶的分泌，并减慢胃排空、松弛消化道括约肌。许多研究证明VIP在胃肠运动调节中主要起抑制效应。功能性消化不良患者血浆VIP高于正常组；胃肠动力障碍模型大鼠血浆VIP水平也升高。
除炒枳实总生物碱组外，其余各给药组均能降低小鼠胃窦组织血管活性肠肽的含量，与模型组比较有显著差异(P＜0.05)。炒枳实总黄酮组与枳术颗粒组比较有显著差异，炒枳实组(含有炒枳实总黄酮、总生物碱)与枳术颗粒组比较没有显著差异。
因此，造模后小鼠的胃肠激素分泌紊乱，与文献[4-6]报道一致。枳术颗粒不同组分能不同程度调节脾虚小鼠胃肠激素含量。炒枳实总生物碱部位调节三种激素的效果不显著，炒枳实总黄酮部位能调节脾虚小鼠MTL、VIP的含量，与炒枳实总生物碱部位合用效果增强；单味药材炒枳实调节脾虚小鼠GAS含量的效果不显著，加入炒白术挥发油部位可以显著增强调节作用；枳术颗粒分离部位合用可以显著调节脾虚小鼠的胃肠激素水平。
实验发现加入荷叶碱组可调节各指标更接近对照组。
该中药组合物对胃肠激素作用最强，显著强于单一药材或部分药材的组合物。
另外，实验结果表明三味药材不同部位组合物使用效果比枳术颗粒明显。
附图说明
图1为上样吸附曲线图。
图2为水洗吸附曲线图。
图3为洗脱曲线图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步说明本发明：
实施例1
1)按照重量份配比称取原料药炒白术40kg、炒枳实20kg，备用；
2)醇提炒枳实：将炒枳实用药材6倍量，浓度为70％的乙醇加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液得到提取液；
3)提取炒枳实生物碱部位：取炒枳实提取液浓缩至1g生药/ml，加入浓氨水调节pH9，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1；所得炒枳实总生物碱部位经高效液相色谱法测定其辛弗林含量为62％。
4)提取炒枳实总黄酮部位：将分离出炒枳实总生物碱部位的炒枳实提取液用盐酸调节pH7，稀释至0.1g生药/ml，上D101大孔吸附树脂柱吸附2h后，用2倍柱体积的水洗去杂质，再用3倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位；所得炒枳实总黄酮部位经高效液相色谱法测得柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的总量为60％。
5)提取炒白术挥发油部位：将炒白术粉碎过50目筛，用炒白术药材4倍量水，水蒸气蒸馏提取3小时，收集挥发油部位；
将上述得到的炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位混合即得治疗脾胃疾病的中药组合物。
实施例2
1)按照重量份配比称取原料药炒白术12kg、炒枳实6kg和荷叶碱0.0018kg，备用；
2)醇提炒枳实：将炒枳实用药材10倍量，浓度为80％的乙醇加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液得到提取液；
3)提取炒枳实生物碱部位：取炒枳实提取液浓缩至1g生药/ml，加入浓氨水调节pH9，再用乙酸乙酯萃取3～4次，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为1：1；所得炒枳实总生物碱部位经高效液相色谱法测定其辛弗林含量为61.5％。
4)提取炒枳实总黄酮部位：将分离出炒枳实总生物碱部位的炒枳实提取液用盐酸调节pH7，稀释至炒枳实提取液总黄酮浓度为24mg/ml，上DA201大孔吸附树脂柱吸附2h后，用2倍柱体积的水洗去杂质，再用3倍柱体积的90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位；所得炒枳实总黄酮部位经高效液相色谱法测得柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的总量为59％。
5)提取炒白术挥发油部位：将炒白术粉碎过50目筛，用炒白术药材4倍量水，水蒸气蒸馏提取3小时，收集挥发油；
将上述得到的炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油和荷叶碱0.0018kg混合即得治疗脾胃疾病的中药组合物。
实施例3
1)按照重量份配比称取原料药炒白术12kg、炒枳实6kg和荷叶碱0.0018kg，备用；
2)醇提炒枳实：将炒枳实用药材6倍量，浓度为70％的乙醇加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液得到提取液；
3)提取炒枳实生物碱部位：取炒枳实提取液浓缩至1g生药/ml，加入浓氨水调节pH9，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1；所得炒枳实总生物碱部位经高效液相色谱法测定其辛弗林含量为62％。
4)提取炒枳实总黄酮部位：将分离出炒枳实总生物碱的炒枳实提取液用盐酸调节pH7，稀释至0.1g生药/ml，上D101大孔吸附树脂柱吸附2h后，用2倍柱体积的水洗去杂质，再用3倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位；所得炒枳实总黄酮部位经高效液相色谱法测得柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的总量为60％。
5)提取炒白术挥发油部位：将炒白术粉碎过50目筛，用炒白术药材4倍量水，水蒸气蒸馏提取3小时，收集挥发油部位；
将上述得到的炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位和荷叶碱0.0018kg混合即得治疗脾胃疾病的中药组合物。
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Claims (2)

1.一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法以炒白术40重量份、炒枳实20重量份为原料，包括以下步骤：
1）按照重量份配比称取原料药炒白术40重量份、炒枳实20重量份，备用；
2）醇提炒枳实：将炒枳实用药材6～10倍量，浓度为70～80%的乙醇提取1～3次，每次1～1.5h，过滤，合并滤液得到提取液；
3）提取炒枳实生物碱部位：取炒枳实提取液，加入浓氨水调节pH8～9，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1～1：1；
4）提取炒枳实总黄酮部位：将分离出炒枳实总生物碱的炒枳实提取液用盐酸调节pH6～7，上样到大孔树脂柱，最大上样量为2～3倍柱体积，吸附2～3h后水洗，再用浓度为70%～90%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位；所使用的大孔树脂柱的型号为D101型；最大上样量为2倍柱体积，吸附2h后以2倍柱体积水洗，再用3倍柱体积70%乙醇洗脱；
5）提取炒白术挥发油：将炒白术粉碎过50～100目筛，用炒白术药材4～6倍量水，水蒸气蒸馏提取3～5小时，收集得到挥发油部位；
将上述得到的炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位混合即得。
2.一种用于治疗脾胃疾病的中药组合物，其特征在于该组合物以炒白术40重量份、炒枳实20重量份和荷叶6重量份为原料，分别提取得到炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位和荷叶碱部位，将炒枳实总黄酮部位、炒枳实总生物碱部位、炒白术挥发油部位和荷叶碱部位混合制成治疗脾胃疾病的中药组合物；
其中，炒枳实总生物碱部位是通过以下方法制备得到的：
将炒枳实用药材6～10倍量，浓度为70～80%的乙醇提取1～3次，每次1～1.5h，过滤，合并滤液得到提取液；取炒枳实提取液，加入浓氨水调节pH8～9，再用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯后，真空干燥即得；其中，提取液与乙酸乙酯的体积比为2：1～1：1；
炒枳实总黄酮部位是通过以下方法制备得到的：
将上述分离出炒枳实总生物碱的炒枳实提取液用盐酸调节pH6～7，上样到大孔树脂柱，最大上样量为2～3倍柱体积，吸附2～3h后水洗，再用浓度为70%～90%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得炒枳实总黄酮部位；所使用的大孔树脂柱的型号为D101型；最大上样量为2倍柱体积，吸附2h后以2倍柱体积水洗，再用3倍柱体积70%乙醇洗脱；
炒白术挥发油部位是通过以下方法制备得到的：将炒白术粉碎过50～100目筛，用炒白术药材4～6倍量水，水蒸气蒸馏提取3～5小时，收集得到挥发油部位。
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GR01 Patent grant
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Denomination of invention: A traditional Chinese medicine composition and its preparation method for treating spleen and stomach diseases

Granted publication date: 20170728

Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Co.,Ltd. Nanjing Zidong Sub branch

Pledgor: NANJING ZHONGSHAN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980000139

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