CN102221590A - 四磨汤制剂的多指标成分同时测定及其指纹图谱构建方法 - Google Patents

四磨汤制剂的多指标成分同时测定及其指纹图谱构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种四磨汤制剂多指标成分同时测定方法：将四磨汤制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，采用梯度洗脱，检测波长为283nm。本发明还公开了四磨汤制剂指纹图谱的构建方法：采用该测定方法进行检测，再经计算机模拟，即可得四磨汤制剂指纹图谱。本发明的测定方法操作简便、专属性强、且具有优异的稳定性、精密度、重现性和加样回收率，可较全面的检测四磨汤制剂中多种主要有效成分，从而获得科学合理的四磨汤制剂指纹图谱，完整、准确的评价四磨汤制剂的有效性、安全性、稳定性和质量均一性。

Description

四磨汤制剂的多指标成分同时测定及其指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及一种四磨汤制剂的多指标成分同时测定方法，以及四磨汤制剂指纹图谱的构建方法。
背景技术
四磨汤中药方包括木香、枳壳、乌药和槟榔四味药材。该方具有顺气降逆，消积止痛功效，可用于婴幼儿乳食内滞证(证见腹胀、腹痛、啼哭不安、厌食纳差、腹泻或便秘)，中老年气滞、食积症(证见脘腹胀满、腹痛、便秘)，以及腹部手术后促进肠胃功能的恢复。此外，还有文献报道其用于治疗新生儿黄疸、胃食管返流、病毒性肠炎、便秘型肠易激综合征和中毒性肠麻痹等疾病的成功病例。
现有技术中，根据四磨汤中药方，已制得多种剂型的四磨汤制剂。通常的制备工艺一般为：将四味原药材采用水蒸气蒸馏法提取芳香水，芳香水富集挥发油后直接备用或包合后备用，再将药渣用水提醇沉得水提液，水提液可浓缩干燥得干膏粉，将上述芳香水或挥发油，以及水提液或干膏粉，选择合适的辅料，即制备成口服液、滴丸、乳化剂、胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂等多种剂型。
例如，中国专利94110842.2(公开号CN1106288)公开了一种四磨汤口服液。其采用中药槟榔10～25％、木香10～25％、枳壳20～30％、乌药20～30％，取上述药材饮片提取芳香性成分，另存；将药渣加水煎煮，合并滤液，浓缩，加乙醇静置，滤取清液，减压回收乙醇，加水煮沸，过滤去渣，滤液中加入芳香性成分水液及适量辅料、滤过、分装、灭菌即得。
四磨汤包括槟榔、木香、枳壳和乌药，所含成分复杂多样。据文献报道，木香主要成分包括萜类、生物碱、甾体和氨基酸，枳壳主要成分包括黄酮苷、烯烃和生物碱，乌药主要成分包括萜类和生物碱，槟榔主要成分包括生物碱、鞣质和氨基酸。
但四磨汤口服液现有的质量标准为部颁标准WS-10040(ZD-0040)-2002该标准“鉴别”项采用TLC法对木香和槟榔进行鉴别：取四磨汤口服液成品，用有机溶剂进行提取，经前处理后制备成供试品溶液；对照药材用适宜有机溶剂提取，经前处理后制备成对照药材溶液；供试品溶液和对照药材溶液点板于硅胶G薄层板，采用适宜展开剂展开，显色剂显色，进行药材鉴别。“含量测定”项采用高效液相色谱法测定指标性成分柚皮苷含量：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-1％醋酸(38∶62)为流动相；检测波长为283nm。四磨汤口服液成品经D101型大孔吸附树脂柱洗脱，收集洗脱液，制备成供试品溶液；取柚皮苷对照品制备成对照品溶液；采用外标法计算柚皮苷含量。该标准未对其他有效成分进行定量检测，存在一定局限性，不能全面反映中药产品的质量水平。
指纹图谱技术是新发展的中药质量控制方法。但通常的指纹图谱停留在指纹性鉴别或整体相似度的评价，注重宏观特征，对于微观特征如具体色谱峰化学信息和物质含量没有较好体现。多指标成分同时测定联合指纹图谱技术是进一步发展的质量控制方法，其结合谱效学研究手段和分离技术明确中药主要有效成分(或主要有效成分群)，确定指纹图谱重点监控的指标成分。多指标同时测定联合指纹图谱技术既注重宏观特征，又监控多个有效成分的含量，可实现微观和宏观的有机结合，符合中医药整体、宏观、复杂的特点，可从整体上评价和控制中药制剂的质量，是中药现代化关键技术之一。
对于四磨汤制剂，亟需建立检测方法，构建多指标成分同时测定联合指纹图谱技术，以更全面准确的监控四磨汤制剂的质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的四磨汤制剂的质量检测方法所检测的有效成分单一，不能全面反应四磨汤制剂质量的缺陷，而提供一种四磨汤制剂多指标成分同时测定方法，以及四磨汤制剂指纹图谱的构建方法。
本发明通过谱效学方法以及分离纯化技术，确定了指纹图谱需监控的主要指标成分，即去甲异波尔定、异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和山梨酸钾。进一步经实验摸索，最终建立了一种专属性强、操作简便，且稳定性、精密度、重现性和加样回收率均良好的检测方法，从而首次建立了科学合理的四磨汤制剂的多指标成分指纹图谱。
本发明的四磨汤制剂多指标成分同时测定方法包括如下步骤：将四磨汤制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，洗脱梯度如表1所示，检测波长为283nm。
表1
Figure BSA00000460392600031
本发明中，所述的四磨汤中药方为现有中药方，其包括木香、枳壳、乌药和槟榔四味药材，各药材重量份数比一般为100∶50～150∶50～150∶50～150。所述的四磨汤制剂可为现有的根据四磨汤中药方制备的各种剂型的四磨汤制剂，例如口服液(如中国专利CN1106288公开的四磨汤口服液)、滴丸、乳化剂、胶囊(包括软胶囊)、片剂或颗粒剂等。上述四磨汤制剂可由下述方法制得：将原药材经水蒸气蒸馏法提取的挥发性成分，与药渣经水提醇沉提取的水提物，按现有方法制成各剂型。
本发明中，所述的四磨汤制剂的供试品溶液可按常规的色谱供试溶液的预处理方法制备而得。具体的，对于四磨汤口服液，可直接用微孔滤膜过滤，滤液可不经稀释，或者稀释至原体积100倍以下(稀释溶剂可为水或体积比1∶1的流动相A和B的混合溶液)，即为供试品溶液。所述的微孔滤膜的孔径可按常规条件选择，一般为0.22～0.8μm，优选0.45μm。各种类的微孔滤膜均适用本发明，如聚醚砜微孔滤膜。对于其他剂型(如其他液体制剂或固体制剂)的四磨汤制剂，可将溶有四磨汤制剂的溶液经超声处理，冷却，之后用微孔滤膜(同前述)过滤，滤液即为供试品溶液。其中，所述的溶有四磨汤制剂的溶液中的溶剂可为甲醇、乙醇、体积百分比40％以上的甲醇水溶液、体积百分比40～95％的乙醇水溶液、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙酮或环己烷，优选前四种。所述的溶剂的用量以使四磨汤制剂的浓度适宜色谱检测为准。具体的，可根据上述四磨汤口服液供试品溶液中的浓度，按其他四磨汤制剂的药材用量折算配制成相同浓度。所述的超声处理的条件较佳的为160～250W，频率40kHz，超声20～60min。
本发明中，所述的高效液相色谱法检测的进样量根据色谱检测领域常规知识选择，一般为2～50μL，以5～20μL为佳。
本发明中，所述的色谱柱可为现有的各种型号和规格的十八烷基硅烷键合硅胶柱，如4.6mm×250mm、4.6mm×150mm等径长规格均可适用，最优选4.6mm×250mm。本发明特别优选Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)或Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm)，最优选前者。
本发明中，所述的洗脱梯度如表1所示。为获得最优分离效果，采用不同的十八烷基硅烷键合硅胶柱时，可在如表1所示的范围内进行最优选择。当采用本发明特别优选的Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)或Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm)时，最优选如表2所示的洗脱梯度。
表2
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0～3   10％流动相A和90％流动相B
  3～22   线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B
  22～35   线性梯度改变至：95％流动相A和5％流动相B
  35～45   95％流动相A和5％流动相B
本发明中，柱温对分离效果影响不大，可采用常规的色谱柱可以允许使用的温度范围，一般为15～50℃，较佳的为20～40℃。
本发明中，流速对分离效果影响不大，可按本领域常规方法选择，一般为0.5～1.5mL/min，较佳的为0.8～1.2mL/min。
本发明的高效液相色谱法理论塔板数按柚皮苷计算不低于3000。
本发明进一步涉及一种四磨汤制剂指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：采用前述方法检测四磨汤制剂，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(国家药典委2004A 1.0版)模拟生成四磨汤制剂指纹图谱。
其中，所检测的四磨汤制剂的样品份数为建立指纹图谱的最低所需要的样品份数以上，一般以10～30为宜，本发明以26批样品为例进行说明。
其中，所述的采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件模拟生成四磨汤制剂指纹图谱按常规进行操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明在明确了四磨汤主要有效成分的基础上，提供了一种四磨汤制剂多指标成分同时测定方法，以及四磨汤制剂指纹图谱构建方法。本发明的测定方法专属性强、操作简便、且具有优异的稳定性、精密度、重现性和加样回收率，可较全面的检测四磨汤制剂中多种主要有效成分，从而构建科学合理的四磨汤指纹图谱，完整、准确的评价四磨汤制剂的有效性、安全性、稳定性和质量均一性。
附图说明
图1为实施例2采用两种不同色谱柱测定四磨汤口服液供试品溶液所得色谱图。图1A为采用Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)，图1B为采用Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm)。
图2为实施例3中四磨汤口服液供试品溶液和标准品的色谱图。图2A为四磨汤口服液供试品溶液，图2B为标准品。其中，2为去甲异波尔定，3为新北美圣草苷，4为异柚皮苷，5为柚皮苷，6为橙皮苷，8为新橙皮苷，10为山梨酸钾。
图3为实施例5-1中采用不同梯度的乙腈-0.1％的甲酸水溶液(本发明流动相条件)进行HPLC分析的色谱图，其中，A、B、C和D分别为表3-1、3-2、3-3和3-4所示的洗脱梯度进行洗脱的色谱图。
图4为实施例5-2中采用不同梯度的乙腈-醋酸铵缓冲液(对比流动相条件)进行HPLC分析的色谱图，其中，A、B、C和D分别为表4-1、4-2、4-3和4-4所示的洗脱梯度进行洗脱的色谱图；1为山梨酸钾的色谱峰。
图5为实施例8中第3节标准品(去甲异波尔定、异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和山梨酸钾)的定量限检测色谱图。图5A中，4为异柚皮苷，5为柚皮苷，6为橙皮苷，8为新橙皮苷，10为山梨酸钾，图5B中，2为去甲异波尔定。
图6为实施例9中26批四磨汤口服液成品的色谱图(图6A)，以及四磨汤口服液指纹图谱(图6B)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
参考实施例检测指标成分的确定
运用血清药物化学、药物代谢动力学等手段和方法，明确了四磨汤制剂中的入血成分(黄酮类、内酯类、生物碱类)，并对含量较高入血成分的单体成分进行分离纯化，再以碳沫推进率为指标确定指纹图谱需监控的指标成分。
单体成分活性试验：将各单体成分用生理盐水(必要时调pH值助溶)配制药液，按0.30ml/10g体重灌胃，给药体积为10ml，给药剂量如表3所示，分别测定各组碳沫推进率(刘令安，蔡莹，蔺晓源等，四磨汤对不同机能状态小鼠胃肠运动的影响[J].中医药导报，2009，15(12)：64-66)，如表3所示：
表3
Figure BSA00000460392600071
*与空白组相比P＜0.5，**与空白组相比P＜0.1。
由上述数据表明，槟榔碱是四磨汤中具有促进小肠蠕动作用的主要单体成分，一定剂量的槟榔碱可以使正常小鼠小肠碳末推进率明显升高；此外柚皮苷、异柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和去甲异波尔定也在其中发挥了一定的作用。
此外，山梨酸钾为四磨汤口服液的防腐剂，与其他防腐剂相比，其抑菌防腐效果较好，毒性较低。山梨酸钾虽不是四磨汤制剂的有效成分，但对其含量进行控制，既可满足制剂在有效期内质量稳定性的需要，又可全面控制四磨汤制剂的质量。因此，山梨酸钾作为特征性指标成分用于四磨汤制剂的质量控制，具有十分重要的意义。
实施例1检测波长的确定
1、材料和方法：
四磨汤制剂的供试品溶液：四磨汤口服液(湖南汉森制药股份有限公司，批号090436)5支，混合均匀，用微孔滤膜(0.45μm，聚醚砜，SCAA-101水相针式滤器)滤过，即为供试品溶液。
高效液相色谱法检测：精密吸取供试品的溶液5μL，注入高效液相色谱仪进行测定。色谱条件：色谱柱为Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)，柱温为30℃，流速为1mL·min-1，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，洗脱梯度如表2所示，检测波长为190～400nm，记录45min内的色谱峰及其保留时间和峰面积。
表2
  时间(分钟)   流动相(百分比为体积百分比)
  0～3   10％流动相A和90％流动相B
  3～22   线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B
  22～35   线性梯度改变至：95％流动相A和5％流动相B
  35～45   95％流动相A和5％流动相B
2、实验结果
通过采用二极管阵列检测器对供试品溶液在190～400nm的紫外区进行在线检测，发现所得的色谱峰中主要是枳壳中的黄酮类成分以及乌药中的生物碱类成分。乌药中去甲异波而定在280nm波长下有最大吸收，枳壳中黄酮类成分的紫外吸收行为极为相像，都在283nm条件下的吸收最强，所提供的信息量最丰富，各峰的比例适合，故综合选择283nm作为检测波长。
实施例2色谱柱的优化
1、材料和方法
四磨汤制剂的供试品溶液同实施例1。
高效液相色谱法检测：色谱柱为Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)或Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm)，检测波长为283nm，其他条件同实施例1。
2、实验结果
采用Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)所得色谱图如图1A所示，采用Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm)所得色谱图如图1B所示。两者对比，采用Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)柱进行色谱分离，洗脱出的色谱峰更加平稳(见图1)，所以优选Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)柱。
实施例3特征峰及参照峰的指认
1、材料和方法
四磨汤制剂的供试品溶液同实施例1。
标准品的配制：精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷、去甲异波尔定、山梨酸钾适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升各含柚皮苷1mg、橙皮苷25μg、新橙皮苷0.45mg、异柚皮苷80μg、去甲异波而定45μg、山梨酸钾0.2mg的溶液，即得标准品。
高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取标准品与供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪进行测定。色谱柱为Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)，检测波长为283nm，其他条件同实施例1。
2、实验结果
四磨汤口服液的供试品溶液和标准品的色谱图分别如图2A和图2B所示。其中，2为去甲异波尔定(保留时间：13.1min)，3为新北美圣草苷(保留时间：19.9min)，4为异柚皮苷(保留时间：21.7min)，5为柚皮苷(保留时间：22.6min)，6为橙皮苷(保留时间：23.2min)，8为新橙皮苷(保留时间：24.0min)，10为山梨酸钾(保留时间：25.1min)。
实施例4检测时间
1、材料和方法
四磨汤制剂的供试品溶液同实施例1。
高效液相色谱法检测方法：检测时间为70min，其他条件同实施例3。
2、实验结果
记录70min色谱峰，40min后没有出峰，提示40min内四磨汤各成分出峰完全。因此，选择40～50min的检测时间较合适。
实施例5洗脱条件
1、不同梯度的本发明乙腈-0.1％的甲酸水溶液流动相条件
色谱柱为Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，洗脱梯度如表3-1、3-2、3-3和3-4所示，柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，检测波长为283nm，色谱图如图3A、B、C和D所示。
表3-1
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0至5   5％流动相A和95％流动相B
  5至25   线性梯度改变至：15％流动相A和85％流动相B
  25至37   线性梯度改变至：85％流动相A和15％流动相B
  37至50   85％流动相A和15％流动相B
表3-2
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0至5   10％流动相A和90％流动相B
  5至23   线性梯度改变至：25％流动相A和75％流动相B
  23至35   线性梯度改变至：92％流动相A和8％流动相B
  35至45   92％流动相A和8％流动相B
表3-3
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0至5   15％流动相A和85％流动相B
  5至20   线性梯度改变至：40％流动相A和60％流动相B
  20至32   线性梯度改变至：100％流动相A和0％流动相B
  32至40   100％流动相A和0％流动相B
表3-4
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0至5   15％流动相A和85％流动相B
  5至25   线性梯度改变至：40％流动相A和60％流动相B
  25至37   线性梯度改变至：100％流动相A和0％流动相B
  37至50   100％流动相A和0％流动相B
由上述实验可见，在本发明的洗脱条件下，流动相的比例在一定范围内变化时，对分离度的影响较小，各组分的相对出峰顺序较为一致，该条件具有一定的耐用性，所以确定乙腈和0.1％的甲酸系统更具方便性和实用性。
2、对比流动相条件
色谱柱为Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)，柱温为30℃，流速为1mL·min-1，检测波长283nm。
对比流动相及洗脱梯度：以乙腈(流动相A)-醋酸铵缓冲液(流动相C)为流动相，醋酸铵缓冲液配制：醋酸铵1.5g+2ml冰醋酸+1000ml水。以表4-1、4-2、4-3和4-4所示的洗脱梯度进行洗脱，色谱图分别如图4A、图4B、图4C和图4D所示。
表4-1
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0至4   15％流动相A和85％流动相C
  4至40   线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相C
表4-2
Figure BSA00000460392600121
表4-3
表4-4
  时间(分钟)   流动相(v/v％)
  0至5   15％流动相A和85％流动相C
  5至40   线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相C
如图4中A、B、C和D所示，采用上述乙腈-醋酸铵缓冲液为流动相，色谱峰保留时间变化较大。以山梨酸钾为例，当梯度洗脱条件变化时，其色谱峰保留时间变化较大，会和枳壳中的柚皮苷、橙皮苷或新橙皮苷等成分的色谱峰部分重叠或完全重叠。因此，采用该流动相建立的方法缺乏一定的耐用性。而且，使用缓冲盐洗脱后，对仪器和色谱柱的养护要求较高。
实施例6流速和柱温对分离效果的影响
色谱柱为Venusil XBP-C18柱(4.6mm×250mm)柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，按实施例1的洗脱梯度进行HPLC分析。流速和柱温，以及保留时间、对称因子、分离度和理论塔板数如表5所示。
表5
Figure BSA00000460392600131
由表5可见，流速和柱温对本发明方法的分离效果影响不大，上述条件均能获得较佳的分离效果。
实施例7各种四磨汤制剂的前处理方法
(1)四磨汤片剂的前处理
取20片四磨汤片剂，研钵研碎，称取2g置于100mL容量瓶，加90mL甲醇超声30min溶解，冷却后补加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm聚醚砜微孔滤膜过滤，滤液稀释50倍即得供试品溶液。
(2)四磨汤胶囊的前处理
取20粒四磨汤胶囊，研钵研碎，称取2g置于100mL容量瓶，加90mL乙醇超声30min溶解，冷却后补加乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm聚四氟乙烯微孔滤膜过滤，滤液稀释60倍即得供试品溶液。
(3)四磨汤滴丸的前处理
取20粒四磨汤滴丸，研钵研碎，称取2g置于100mL容量瓶，加90mL体积比60％甲醇水溶液超声30min溶解，冷却后补加体积比60％甲醇水溶液至刻度，摇匀，用0.80μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤，滤液稀释80倍即得供试品溶液。
(4)四磨汤软胶囊的前处理
取50粒四磨汤软胶囊，取出内容物，称取2g内容物置于100mL容量瓶，加90mL甲醇超声30min溶解，冷却后补加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm聚四氟乙烯微孔滤膜过滤，滤液稀释70倍即得供试品溶液。
(5)四磨汤颗粒的前处理
取20包四磨汤颗粒，研钵研碎，称取2g置于100mL容量瓶，加90mL70％乙醇水溶液超声30min溶解，冷却后补加70％乙醇水溶液至刻度，摇匀，用0.45μm聚偏氟乙烯微孔滤膜过滤，滤液稀释80倍即得供试品溶液。
实施例8本发明四磨汤制剂的检测方法的方法学考察
下述实验的高效液相色谱法条件同实施例3。
1、系统适应性试验
材料和方法同实施例3。该测定方法理论塔板数按柚皮苷计算不低于3000。
2、标准曲线及线性范围
取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷、去甲异波尔定、山梨酸钾适量，精密称定，分别置不同的量瓶中，加甲醇制成每1ml分别含柚皮苷1.0164mg、橙皮苷0.2412mg、新橙皮苷0.9644mg、异柚皮苷0.4024mg、去甲异波尔定0.4324mg、山梨酸钾2.5236mg的溶液，摇匀，即为储备液。将各溶液分别按表6-1、6-2、6-3、6-4、6-5、6-6中浓度稀释，HPLC检测，进样量5μl，数据见表6-1～6-2，绘制标准曲线，见表7。
表6-1去甲异波尔定标准曲线数据
  C μg/mL   432.4   259.44   172.96   86.48   8.648   3.4592   0.6918
  A   4813.4   2751.4   1861.7   901.6   90.5   35.9   7.2
表6-2异柚皮苷标准曲线数据
  C μg/mL   402.4   321.92   241.44   160.96   80.48   16.096   3.2192   1.6096   0.4024
  A   3028   2406   1879.3   1184.2   590.6   118.4   23.7   11.8   3.4
表6-3柚皮苷标准曲线数据
  C μg/mL   1016.4   762.30   508.20   203.30   101.64   20.33   4.066   2.033   0.5082
  A   7675.1   5830.7   3798.5   1653.8   812.5   162.9   33.3   16.6   4.4
表6-4橙皮苷标准曲线数据
  C μg/mL   241.2   96.48   48.24   24.12   24.12   4.824   2.412   1.206   0.603
  A   2091.8   844.2   438   233.8   214.7   43.2   21.6   10.7   5.9
表6-5新橙皮苷标准曲线数据
  C μg/mL   964.4   482.2   192.88   96.44   38.576   19.288   3.8576   1.9288   0.4822
  A   8993.5   4247.8   1799.8   856.9   341.6   170.7   34.7   17.7   4.8
表6-6山梨酸钾标准曲线数据
  C μg/mL   1261.8   504.72   252.36   100.944   50.472   10.0944   5.0472   2.5326   0.6309
  A   20854.9   8781.7   4448.3   1802.8   954   183.4   92   45.5   11.68
表7各指标成分标准曲线和线性范围
  指标成分   标准曲线   相关系数/r   线性范围/μg/mL
  去甲异波尔定   y＝11.042x-26.52   0.9996   0.692-432.4
  异柚皮苷   y＝7.545x-2.34   0.9998   0.402-402.4
  柚皮苷   y＝7.559x+19.27   0.9998   0.508-1016.4
  橙皮苷   y＝8.661x+7.25   0.9999   0.603-241.2
  新橙皮苷   y＝9.249x-18.17   0.9997   0.482-964.4
  山梨酸钾   y＝16.573x+102.89   0.9997   0.631-1261.8
3、定量限(LOQ)和检测限(LOD)
标准品(去甲异波而定、异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和山梨酸钾)进样浓度分别如表8所示时，信噪比S/N＝10或3，分别为上述各指标成分的定量限和检测限。各指标成分的定量限色谱图如图5A和5B所示。
表8各指标成分定量限(LOQ)和检测限(LOD)
  指标成分   去甲异波尔定   异柚皮苷   柚皮苷   橙皮苷   新橙皮苷   山梨酸钾
  LOQ/μg/mL   0.692   0.402   0.508   0.603   0.482   0.631
  LOD/μg/mL   0.346   0.201   0.254   0.302   0.241   0.315
4、精密度考察
分别取三种不同浓度的标准品溶液，去甲异波尔定的浓度分别为43.24μg/mL、86.48μg/mL、172.96μg/mL，异柚皮苷的浓度分别为40.24μg/mL、80.48μg/mL、402.4μg/mL，柚皮苷的浓度分别为101.64μg/mL、203.30μg/mL、1016.4μg/mL，橙皮苷的浓度分别为24.12μg/mL、48.24μg/mL、241.2μg/mL，新橙皮苷的浓度分别为96.44μg/mL、192.88μg/mL、964.4μg/mL，山梨酸钾浓度分别为50.472μg/mL、252.36μg/mL、504.72μg/mL，进样量5μL，每组浓度重复进样6次，HPLC检测，测定平均峰面积，计算RSD。连续三天测试，计算RSD，结果如表9和10所示。
表9日内精密度测定结果(n＝6)
Figure BSA00000460392600171
由表9可见，同一天测试，各指标成分不同浓度组的RSD均小于3％，表明该测定方法日内精密度良好。
表10日间精密度测定结果(n＝6)
Figure BSA00000460392600181
由表10可见，连续三天测试，各指标成分各浓度组的RSD均小于3％，表明该测定方法日间精密度良好。
5、样品稳定性
取四磨汤口服液(湖南汉森制药股份有限公司，批号090436)，按实施例1的方法制备供试品溶液，进行HPLC检测，结果见表11。
表11稳定性测定结果
  时间(h)   0   4   6   8   15   18   24   RSD％
  去甲异波尔定   538.1   505.2   537.8   539.8   512.9   547.8   537.9   2.97
  异柚皮苷   776.8   745.7   776.7   779.5   752.9   784.7   764.7   1.91
  柚皮苷   8003.7   7983.9   8023.2   8034.9   8057.1   8110.6   8029.1   0.51
  橙皮苷   263   250.3   262.5   263.8   251.3   265.5   255.9   2.43
  新橙皮苷   4236.3   4230.4   4250.9   4258.9   4266.4   4294.1   4258.4   0.49
  山梨酸钾   20607.6   20653.5   20679.1   20743.3   20745.4   20472   20641.67   0.46
由表11可见，样品在24h内稳定，RSD在0.46％～2.97％间。
6、重复性实验
取四磨汤口服液(湖南汉森制药股份有限公司，批号090436)，按实施例1的方法制备6份供试品溶液，进行HPLC检测，结果见表12。
表12重复性测定结果
由表12可见，各指标成分RSD为0.24％～2.36％，说明该检测方法重复性良好。
7、加样回收实验
精密称定标准品柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷、去甲异波尔定、山梨酸钾适量，加甲醇制成每1ml分别含柚皮苷1.0164mg、橙皮苷0.2412mg、新橙皮苷09644mg、异柚皮苷0.4024mg、去甲异波尔定0.432.4mg、山梨酸钾2.5236mg的溶液，摇匀，即为各自的储备液，备用。
精密量取四磨汤口服液(湖南汉森制药股份有限公司，批号090436)适量，按实施例1方法过滤预处理，置于25mL量瓶中。针对每种指标成分，分别加入上样供试品溶液中所含该指标成分量100％的标准品，加入甲醇至刻度10ml，摇匀，进行HPLC测定，按如下公式计算加样回收率，结果见表13。
加样回收率％＝(测得量-供试品溶液所含指标成分的量)/实际加入量×100％
表13-1去甲异波尔定加样回收实验结果
Figure BSA00000460392600201
表13-2柚皮苷加样回收实验结果
表13-3异柚皮苷加样回收实验结果
Figure BSA00000460392600211
表13-4橙皮苷加样回收实验结果
表13-5新橙皮苷加样回收实验结果
Figure BSA00000460392600213
表13-6山梨酸钾加样回收实验结果
Figure BSA00000460392600221
由表13-1～13-6可见，针对各指标成分，本发明的检测方法具有良好的加样回收率。
实施例9四磨汤制剂指纹图谱的构建
取四磨汤口服液成品26批，按实施例3的方法制备供试品溶液，并进行HPLC检测，色谱图如图6A所示。图6B为四磨汤口服液指纹图谱。
特征指纹峰的选择：根据26批四磨汤口服液成品的测定结果，以柚皮苷标准品为参照峰，分别从20个特征指纹峰中鉴定了9个特征指纹峰，即去甲异波尔定(3号)、新北美圣草苷(6号)、异柚皮苷(7号)、柚皮苷(8号)、橙皮苷(9号)、新橙皮苷(11号)、山梨酸钾(13号)、为川陈皮素(18号)和红橘素(19号)。
指纹图谱检测标准的建立：采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件的操作规范(2004A 1.0版)，采用均值法，将26批四磨汤口服液成品的实验数据导入，经选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动匹配，然后设定标准模板，进行色谱峰差异性评价和整体相似度评价。依据26批样品结果，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，生成四磨汤口服液指纹图谱(图6B)。各样品色谱图与该指纹图谱相比较的相似度结果见表14。该指纹图谱中各特征峰的保留时间是以柚皮苷标准品为参照峰，其余各峰与之相比而得的相对保留时间，见表15。
表14与共有模式比较的26批样品的相似度评价
  样品编号   批次   厂商   相似度
  S1   070109   湖南汉森制药股份有限公司   1.000
  S2   070419   湖南汉森制药股份有限公司   0.999
  S3   070706   湖南汉森制药股份有限公司   0.998
  S4   071017   湖南汉森制药股份有限公司   0.999
  S5   080121   湖南汉森制药股份有限公司   1.000
  S6   080421   湖南汉森制药股份有限公司   0.997
  S7   080712   湖南汉森制药股份有限公司   0.998
  S8   081036   湖南汉森制药股份有限公司   0.988
  S9   090225   湖南汉森制药股份有限公司   0.992
  S10   090628   湖南汉森制药股份有限公司   0.991
  S11   091026   湖南汉森制药股份有限公司   0.997
  S12   091243   湖南汉森制药股份有限公司   0.995
  S13   090424   湖南汉森制药股份有限公司   0.998
  S14   090425-1   湖南汉森制药股份有限公司   0.996
  S15   090426-1   湖南汉森制药股份有限公司   0.988
  S16   090435-1   湖南汉森制药股份有限公司   0.996
  S17   090436-1   湖南汉森制药股份有限公司   0.998
  S18   060311-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.969
  S19   060601-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.997
  S20   060905-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.996
  S21   061203-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.993
  S22   070308-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.999
  S23   070624-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.994
  S24   070918-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.997
  S25   071201-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.995
  S26   080306-2   湖南中达骛马制药有限责任公司   0.999
根据以上试验结果，并结合中药指纹图谱研究技术要求，拟定符合下述标准的四磨汤制剂为符合质量标准的制剂：供试品溶液色谱图中各色谱峰应与四磨汤口服液指纹图谱各特征峰一致，相似度不低于0.90。
表15四磨汤多指标指纹图谱中各特征峰的相对保留时间表(分钟)
Figure BSA00000460392600241

Claims (10)

1.一种四磨汤制剂多指标成分同时测定方法，其特征在于其包括如下步骤：将四磨汤制剂的供试品溶液进行高效液相色谱法检测，即可；所述的高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，洗脱梯度如表1所示；
表1
Figure FSA00000460392500011
检测波长为283nm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的四磨汤制剂主要由下述重量份数的原药材制得：100份木香、50～150份枳壳、50～150份乌药和50～150份槟榔。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的四磨汤制剂为由下述方法制得的四磨汤制剂：将原药材经水蒸气蒸馏法提取的挥发性成分，与药渣经水提醇沉提取的水提物，按现有常规方法制成口服液、滴丸、乳化剂、胶囊、片剂或颗粒剂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的四磨汤制剂的供试品溶液按下述方法制得：
当所述的四磨汤制剂为四磨汤口服液时，直接将四磨汤口服液用微孔滤膜过滤，滤液不经稀释，或经稀释至原体积100倍以下，即为供试品溶液；
当所述的四磨汤制剂为除四磨汤口服液外的其他剂型时，将溶有四磨汤制剂的溶液经超声处理，冷却，之后用微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的进样量为2～50μL，较佳的为5～20μL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的柱温为15～50℃，较佳的为20～40℃；和/或，所述的高效液相色谱法检测的流速为0.5～1.5mL/min，较佳的为0.8～1.2mL/min。
7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于：所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱为Venusil XBP-C18柱或Agilent ZORBAX SB-C18柱。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的十八烷基硅烷键合硅胶柱的径长规格为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述的洗脱梯度如表2所示；
表2
  时间(分钟)   流动相(v/v％)   0～3   10％流动相A和90％流动相B   3～22   线性梯度改变至：30％流动相A和70％流动相B   22～35   线性梯度改变至：95％流动相A和5％流动相B   35～45   95％流动相A和5％流动相B
。
10.一种四磨汤制剂指纹图谱的构建方法，其特征在于其包括如下步骤：采用如权利要求1～9任一项所述的方法检测四磨汤制剂，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，模拟生成四磨汤制剂指纹图谱。
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