CN103923138B

CN103923138B - 一种烟花苷的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103923138B
Application number: CN201410191984.6A
Authority: CN
Inventors: 吴孔松; 吴朝阳; 吴安明
Original assignee: TIANSHIKANG CHINESE MEDICINES CO Ltd JIANGXI
Current assignee: Jiangxi Kangenbei tianshikang Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-05-08
Also published as: CN103923138A

Abstract

本发明公开了一种烟花苷的制备方法及其应用。本发明提供的制备方法包括如下步骤：（1）取含烟花苷的药材或提取物用含水有机溶剂提取，得提取液；（2）提取液经浓缩、过滤，得滤液；（3）滤液经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30%~100%乙醇溶液洗脱，得洗脱液；（4）洗脱液浓缩至适量，用正丁醇萃取；或先用极性小的有机溶剂萃取，再用正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；（5）正丁醇萃取液浓缩至适量，用碱水萃取，收集水层部分，调PH值至3-6，适当浓缩，经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30%~100%乙醇溶液洗脱，洗脱液得到的提取物再经自制C18柱和/或制备HPLC分离，即得。本发明制备得到的烟花苷可作为对照品用于肠炎宁制剂的含量测定。

Description

一种烟花苷的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药领域，特别涉及一种烟花苷的制备方法及其应用。

背景技术

收载于2010年版《中华人民共和国药典》的肠炎宁糖浆和肠炎宁片具有清热利湿、行气的功效，用于急、慢性胃肠炎，腹泻，细菌性痢疾，小儿消化不良等，临床应用广泛、疗效确切。近几年，国家食品药品监督管理局又新批准了肠炎宁丸、肠炎宁颗粒、肠炎宁胶囊、肠炎宁咀嚼片等剂型。目前已有报道中，肠炎宁制剂质量检测指标成分为东莨菪内酯、没食子酸和鸡屎藤苷甲酯，而肠炎宁制剂中含量较高的黄酮类成分没有明确的检测指标成分。申请人采用HPLC法，并以槲皮素、山奈酚和芦丁等3种常见的黄酮类成分对照品作为对照，对肠炎宁制剂进行了分析，发现由于药材是采用水提，所以肠炎宁制剂中槲皮素和山奈酚的含量较低；肠炎宁制剂色谱图中与芦丁对照品色谱峰保留时间相同的地方有色谱峰，但分离度较差，而且峰纯度检测显示该色谱峰中包含了其它成分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟花苷的制备方法，本发明制备得到的烟花苷可作为肠炎宁制剂含量测定用的对照品。

本发明提供的烟花苷的制备方法，包括如下步骤：

(1)取含烟花苷的药材或提取物用含水有机溶剂提取，得提取液；

(2)提取液经浓缩、过滤，得滤液；

(3)滤液经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30％～100％甲醇或乙醇溶液洗脱，得洗脱液；

(4)洗脱液经浓缩，用正丁醇萃取；或先用极性小的有机溶剂萃取，再用正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；

(5)正丁醇萃取液经浓缩，用碱水萃取，收集水层部分，调PH值至3-6，浓缩，经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30％～100％甲醇或乙醇溶液洗脱，洗脱液得到的提取物再经自制C18柱和/或制备HPLC分离，即得。

本发明优选的烟花苷的制备方法，包括如下步骤：

(1)取含烟花苷的药材或提取物用30％～100％甲醇或乙醇溶液提取，得提取液；

(2)提取液经浓缩、过滤，得滤液；

(3)滤液经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30％～50％甲醇或乙醇溶液洗脱，得洗脱液；

(4)洗脱液经浓缩，先用乙酸乙酯萃取弃去，再用正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；

(5)正丁醇萃取液经浓缩，用碱水萃取，收集水层部分，调PH值至4-5，浓缩，浓缩液经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30％～50％甲醇或乙醇溶液洗脱，洗脱液得到的提取物再经自制C18柱和/或制备HPLC，以体积比例为20:80～40:60的甲醇-水混合溶液洗脱，即得。

本发明更优选的烟花苷的制备方法，包括如下步骤：

(1)取含烟花苷的药材或提取物，用30％～75％乙醇溶液提取，得提取液；

(2)提取液经浓缩、过滤，得滤液；

(3)滤液经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30％乙醇溶液洗脱，得洗脱液；

(5)正丁醇萃取液经浓缩，用5％碳酸钠溶液萃取，收集水层部分，调PH值至4-5，浓缩，经聚酰胺柱吸附，水洗弃去，30％乙醇溶液洗脱，洗脱液得到的提取物再经自制C18柱和/或制备HPLC，以体积比例为20:80～40:60甲醇-水混合溶液洗脱，即得。

本发明提供的烟花苷可作为肠炎宁制剂含量测定用的对照品。

本发明所述的肠炎宁制剂为肠炎宁口服液、肠炎宁糖浆、肠炎宁胶囊、肠炎宁颗粒、肠炎宁片、肠炎宁咀嚼片或肠炎宁丸中的任意一种。

本发明创新之处在于：通过HPLC法对肠炎宁制剂进行色谱分析，并利用光谱分析和峰纯度检测技术筛选出分离度和峰纯度都较好的黄酮类成分色谱峰，然后对其进行分离、鉴定，最终分离鉴定得到其中一个黄酮类成分烟花苷。通过对烟花苷含量测定方法学考察表明，采用HPLC法测定肠炎宁制剂中的烟花苷简便、快速、准确、重复性好，有助于更好的控制肠炎宁制剂的质量。本发明制备得到的烟花苷经标定纯度大于98％，可作为肠炎宁制剂含量测定用的对照品。

下面将通过一些实验例对本发明作进一步说明。

实验例1肠炎宁制剂黄酮类成分对照品的研究

1、肠炎宁制剂中待分离目标成分的筛选

(1)色谱条件：DikmaC₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.3％冰醋酸水溶液—乙腈(梯度洗脱，0min比例为85:15，60min比例为65:35)；检测波长为350nm。

(2)供试品溶液的制备：取肠炎宁颗粒粉末约4.0g，加入60％甲醇100ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至约30ml，过滤，经聚酰胺柱吸附，依次用水和60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩至适量，滤过，取续滤液，即得。

(3)检测及结果：取供试品溶液20μl，按(1)项下色谱条件进样分析，经过对峰高较高且分离度较好的色谱峰进行光谱分析和峰纯度检测，确定出峰时间为18分钟左右的黄酮类成分为待分离成分。

2、提取分离

取生产上用于生产肠炎宁颗粒的稠膏1kg，加30％乙醇10L，超声，静置，过滤，滤液浓缩至5L，过滤，经聚酰胺柱吸附，依次用水、30％乙醇和60％乙醇洗脱，经HPLC分析，待分离成分主要存在于30％乙醇洗脱部分，30％乙醇洗脱部分回收乙醇并减压浓缩至1L，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，经HPLC分析，待分离成分主要存在于正丁醇萃取液中，正丁醇萃取液浓缩至500ml，用5％碳酸钠溶液3000ml分3次萃取，经HPLC分析，待分离成分主要存在于水层部分，水层部分用酸调PH值至4～5，浓缩至2500ml，经聚酰胺柱吸附，依次用水和30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，浓缩至乙醇含量少于10％，经自制YMGC₁₈H₃柱吸附，依次用10％甲醇、30％甲醇和50％甲醇洗脱，经HPLC分析，待分离成分主要存在于30％甲醇洗脱部分，30％甲醇洗脱部分减压浓缩后，用少量35％甲醇溶解，再经制备HPLC，甲醇-水(35：65)洗脱，得目标成分。

3、结构鉴定

目标成分：黄色针状结晶，盐酸镁粉反应及Molish反应均呈阳性。UV(MeOH)nm：329，268。¹H—NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ：7.97(2H，d，J＝8.7Hz，H-2′，6′)，6.87(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′，5′)，6.40(1H，brs，H-8)，6.19(1H，brs，H-6)，5.30(1H，d，J＝7.4Hz，H一1″)，5.24(1H，brs，H-1″′)。¹³C—NMR(100MHzDMSO-d₆)δ：177.9(C-4)，164.2(C-7)，161.3(C-5)，159.9(C-4′)，156.9(C-2，9)，133.3(C-3)，131.0(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，l15.2(C-3′，5′)，104.0(C-10)，101.4(C-1″)，100.8(C-1″′)，98.8(C-6)，93.8(C-8)，76.4(C-5″)，75.8(C-3″)，74.2(C-2″)，71.4(C-4″′)，70.6(C-3″′)，70.4(C-2″′)，70.0(C-4″)，68.3(C-5″′)，66.9(C-6″)，17.8(C-6″′)。根据以上数据确定目标成分为烟花苷。

经过标定，制得的烟花苷的纯度大于98％，可作为含量测定用的对照品。

实验例2肠炎宁颗粒中烟花苷含量测定研究

1、仪器与试药

安捷伦1200液相色谱仪(美国安捷伦公司)。烟花苷对照品(自制，纯度大于98％)；肠炎宁颗粒(江西天施康中药股份有限公司，批号：20140301、20140302、20140303)；乙腈为色谱纯；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2、色谱条件

DikmaC₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.3％冰醋酸水溶液—乙腈(80:20)；流速：1.0ml/min；检测波长：350nm；柱温：25℃；理论板数按烟花苷计不低于3000。

3、对照品溶液的制备取烟花苷对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、供试品溶液的制备取肠炎宁颗粒，研细，取约4.0g，精密称定，加入60％甲醇100ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至适量，放冷，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5、系统适应性试验

烟花苷在波长260nm和350nm附近均有较强的紫外吸收，本方法选择350nm作为检测波长。按2项下色谱条件测定，比较烟花苷对照品溶液、供试品溶液的色谱图，结果烟花苷色谱峰无拖尾，分离度良好。

6、线性关系考察

精密称取烟花苷对照品10.23mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述母液5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液，按2项下色谱条件，分别注入高效液相色谱仪1μl，3μl，5μl，10μl，20μl，测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，结果见表1。

表1烟花苷线性关系考察结果

烟花苷(μg)	峰面积
		0.0409	63.7
0.1228	192.2
		0.2046	322.0
0.4092	650.7
		0.8184	1323.2

结果表明：烟花苷在0.0409～0.8184μg范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系，回归方程为Y＝1621X-7.303，R²＝0.999(n＝5)。

7、精密度试验

精密量取含烟花苷(40.92μg/ml)的对照品溶液5μl，按2项下色谱条件，进样测定5次，结果见表2。

表2烟花苷精密度试验结果

8、供试品溶液制备的条件考察

8.1提取溶剂的考察

取肠炎宁颗粒粉末4份各约4.0g，精密称定,分别加入水、30％甲醇、60％甲醇及甲醇100ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至适量，放冷，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按2项下色谱条件测定，结果见表3。

表3不同溶剂提取测定结果

溶剂	水	30％甲醇	60％甲醇	甲醇
					烟花苷含量(μg/g)	11.7	15.8	18.3	17.9

结果表明：60％甲醇提取率较高，故确定60％甲醇为最佳提取溶剂。

8.2提取体积的考察

取肠炎宁颗粒粉末3份各约4.0g，精密称定,分别加入60％甲醇50ml、100ml、150ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至适量，放冷，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按2项下色谱条件测定，结果见表4。

表4不同提取方法测定结果

溶剂体积	50ml	100ml	150ml
				烟花苷含量(μg/g)	15.1	18.3	18.3

结果表明：采用超声处理30分钟，加入60％甲醇100ml提取已比较完全，故采用100ml的60％甲醇提取。

8.3提取时间的考察

取肠炎宁颗粒粉末3份各约4.0g，精密称定,分别加入60％甲醇100ml，分别超声(功率250W，频率33KHz)处理15分钟、30分钟、45分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至适量，放冷，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按2项下色谱条件测定，结果见表5。

表5不同提取时间考察结果

时间(分钟)	15	30	45
				烟花苷含量(μg/g)	16.4	18.3	18.2

结果表明：采用60％甲醇为提取溶剂，超声处理30分钟即可提取完全，故提取时间定为30分钟。

8.4聚酰胺树脂吸附处理的考察

取肠炎宁颗粒粉末约4.0g，加入60％甲醇100ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至约30ml，放冷，过滤，经聚酰胺柱吸附，依次用水和60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩至适量，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按2项下色谱条件测定，结果杂质峰较少，基线更加平整，故该方法可作为供试品溶液的优选制备方法。

9、稳定性试验

取供试品溶液，按2项下色谱条件测定烟花苷在1、2、4、8、12、24小时内峰面积，结果见表6。

表6供试品溶液中烟花苷稳定性试验结果

结果表明：供试品溶液在0～24小时内基本稳定。

10、重复性试验取肠炎宁颗粒粉末，一式5份，照4项下方法制备供试品溶液，并按2项下色谱条件测定，结果见表7，烟花苷平均含量为18.26μg/g，RSD＝1.55％。

表7供试品溶液中烟花苷重复性试验结果

结果表明：样品按本方法试验，重现性良好。

11、耐用性试验

取肠炎宁颗粒粉末，照4项下方法制备供试品溶液，分别用A：DikmaC₁₈(250×4.6mm，5μm)、B:AgilentZORBAXSB-C₁₈(250×4.6mm，5μm)、C:Kromasil100-5C1₈(250×4.6mm，5μm)三种品牌的色谱柱按2项下色谱条件对其进行测定，结果无明显差别(见表8)。

表8不同色谱柱测定结果烟花苷含量

12、回收率试验

取肠炎宁颗粒(烟花苷含量为18.06μg/g)粉末6份各约4.0g，精密称定，分别精密加入含烟花苷(浓度0.8184μg/ml)对照品的60％甲醇溶液100ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至适量，放冷，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。照2项下色谱条件测定，结果见表9。

表9烟花苷回收率试验结果

结果表明：本方法烟花苷回收率为97.88％，RSD为0.89％，回收率试验良好，方法可行。

13、样品测定取肠炎宁颗粒3批，照4项下方法制备供试品溶液，并按2项下色谱条件测定，3批样品的含量分别为17.73μg/g、18.26μg/g、18.69μg/g。

综上所述，本方法测定肠炎宁颗粒中的烟花苷简便、快速、准确、重复性好，有助于更好的控制肠炎宁颗粒的质量，烟花苷可作为肠炎宁颗粒含量测定用的对照品。

具体实施方式

下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取生产上用于生产肠炎宁胶囊的稠膏1kg，加75％乙醇10L，超声，静置，过滤，滤液浓缩至2.5L，过滤，滤液经聚酰胺柱吸附，依次用水和30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，回收乙醇并减压浓缩至1L，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，浓缩500ml，用5％碳酸钠溶液3000ml分3次萃取，收集水层部分，调PH值至4～5，浓缩至2500ml，经聚酰胺柱吸附，依次用水和30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩至乙醇含量小于10％，经自制YMGC₁₈H₃柱吸附，依次用10％甲醇和30％甲醇洗脱，30％甲醇洗脱部分浓缩后，用少量的35％甲醇溶解，再经制备HPLC，甲醇-水(35：65)洗脱，得烟花苷。

经过标定，制得的烟花苷的纯度大于98％。

实施例2

取黄毛耳草药材3kg，用60％乙醇60L分2次提取，每次回流提取1h，合并滤液，减压浓缩至6L，过滤，滤液经聚酰胺柱吸附，依次用水和30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，回收乙醇并减压浓缩至1L，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，浓缩500ml，用5％碳酸钠溶液3000ml分3次萃取，收集水层部分，调PH值至4～5，浓缩至2500ml，经聚酰胺柱吸附，依次用水和30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩至乙醇含量小于10％，经自制YMGC₁₈H₃柱吸附，依次用10％甲醇和30％甲醇洗脱，30％甲醇洗脱部分浓缩后，用少量的35％甲醇溶解，再经制备HPLC，甲醇-水(35：65)洗脱，得烟花苷。

经过标定，制得的烟花苷的纯度大于98％。

实施例3肠炎宁糖浆中烟花苷的含量测定

地锦草660g金毛耳草900g樟树根660g

香薷330g枫树叶330g

以上五味，加水煎煮二次，每次2小时，合并滤液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20(80℃)的清膏，加乙醇2倍量，搅拌，静置，滤过，滤液浓缩至适量，趁热加入蔗糖600g使溶解，滤过，滤液加尼泊金乙酯、香料适量，搅匀，加水调整总量至1000ml，即得。

照高效液相法(中国药典2010年版一部附录VID)测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.3％冰醋酸水溶液—乙腈(82:18)为流动相；检测波长为350nm。理论板数按烟花苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取烟花苷对照品适量，加60％甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备精密量取本品4ml，加16ml水稀释，经聚酰胺柱吸附，依次用水和60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩至适量，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果本品每1ml含烟花苷25.3μg。

实施例4肠炎宁胶囊中烟花苷的含量测定

地锦草660g金毛耳草900g樟树根660g

香薷330g枫树叶330g

以上五味，加水煎煮二次，每次2小时，合并滤液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20(80℃)的清膏，加乙醇2倍量，搅拌，静置，滤过，滤液浓缩成稠膏，加入适量辅料，混匀，制粒，干燥，灌装胶囊，制成1000粒，即得。

照高效液相法(中国药典2010年版一部附录VID)测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.3％冰醋酸水溶液—乙腈(80:20)为流动相；检测波长为260nm。理论板数按烟花苷峰计算应不低于2000。

供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约1.2g，精密称定，加入60％甲醇30ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至适量，放冷，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果本品每粒含烟花苷17.9μg。

实施例5肠炎宁片中烟花苷的含量测定

地锦草660g金毛耳草900g樟树根660g

香薷330g枫树叶330g

以上五味，取部分地锦草、香薷，分别粉碎成细粉，过80-120目筛，地锦草粉用文火炒至淡棕色至棕褐色，与香薷粉混匀；另取上述二味药物剩余部分和金毛耳草、樟树根、枫树叶，加水煎煮二次，滤过，合并滤液，滤液浓缩至稠膏状，放冷，与上述药粉混合，干燥，粉碎，过筛，制颗粒，干燥，加入适量辅料，压片，包衣，制成1000片，即得。

照高效液相法(中国药典2010年版一部附录VID)测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％冰醋酸水溶液—乙腈(80:20)为流动相；检测波长为350nm。理论板数按烟花苷峰计算应不低于2000。

供试品溶液的制备取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约1.6g，精密称定，加入60％甲醇50ml，超声(功率250W，频率33KHz)处理30分钟，放冷，过滤，滤液浓缩至约20ml，放冷，经聚酰胺柱吸附，依次用水和60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩至适量，转移至10ml量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

结果本品每片含烟花苷23.4μg。

Claims

1.烟花苷作为肠炎宁制剂含量测定用对照品的应用，所述的肠炎宁制剂为肠炎宁口服液、肠炎宁糖浆、肠炎宁胶囊、肠炎宁颗粒、肠炎宁片或肠炎宁丸中的一种。

2.如权利要求1所述的烟花苷作为肠炎宁制剂含量测定用对照品的应用，其特征在于：所述的肠炎宁制剂为肠炎宁咀嚼片。