CN112763609B - 一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法 - Google Patents

一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112763609B
CN112763609B CN202011568317.7A CN202011568317A CN112763609B CN 112763609 B CN112763609 B CN 112763609B CN 202011568317 A CN202011568317 A CN 202011568317A CN 112763609 B CN112763609 B CN 112763609B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chamomile
solution
extraction
acid
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011568317.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112763609A (zh
Inventor
李茜
张柏生
卢军
聂继红
赵翡翠
康小龙
姜林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Original Assignee
Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University filed Critical Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Priority to CN202011568317.7A priority Critical patent/CN112763609B/zh
Publication of CN112763609A publication Critical patent/CN112763609A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112763609B publication Critical patent/CN112763609B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components

Abstract

本发明公开了一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法，涉及洋甘菊加工技术领域。本发明包括以下步骤：步骤S01：对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，确定洋甘菊的适宜产地；步骤S02：以二咖啡酰奎宁酸含量、浸膏得率、透明质酸酶活性为指标，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件；步骤S03：以3,5‑二‑O‑咖啡酰基奎宁酸和4,5‑二‑O‑咖啡酰基奎宁酸两种特征成分为指标，并对这两种特征成分进行纯化，确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件。本发明通过系统的分析方法，将洋甘菊中抗哮喘活性成分系统化提取生产，并通过对抗哮喘活性成分提取纯化工艺的最优解，提高对洋甘菊抗哮喘活性成的提取效率，提升生产效率。

Description

一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法
技术领域
本发明属于洋甘菊加工技术领域，特别是涉及一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法。
背景技术
洋甘菊因产地不同、功效不同而分为两种：罗马甘菊和德国甘菊。德国洋甘菊Matricaria chamomilla L，又称作母菊，为一年生母菊属草本植物；罗马洋甘菊Anthemisnobile L，为一至多年生春黄菊属草本植物。
洋甘菊又名母菊，维吾尔语名称巴布那儿，为《国家药品标准维吾尔药分册》所收载，为一年生草本植物，拉丁名Matricarla chamomilla L(刘勇民，1999)。洋甘菊在我国有悠久的栽培历史，目前在新疆等地有种植。洋甘菊可用于制作洋甘菊精油，洋甘菊花茶等。此外，洋甘菊还有悠久的药用历史，具有散气消炎，温胃开胃，促进消化，消肿散结等疗效，在中医中还可以用于治疗感冒咳嗽等症。洋甘菊集美容、食用、药用等多种功能于一体具有很高的综合利用价值。
在民族医学处方中洋甘菊也被频繁使用，有治疗上呼吸道疾病包括哮喘在内的多种疾病的用药历史。但其抗哮喘的具体有效成分尚不明确，为了使洋甘菊药材的开发更加深入，对洋甘菊抗哮喘的活性部位进行提取和纯化工艺的筛选并分析其抗哮喘的主要化学成分，提供一种针对洋甘菊中主要化学成分的提取纯化工艺，并进行优化的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法，解决背景技术中提到的问题。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法，包括以下步骤：
步骤S01：对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，确定洋甘菊的适宜产地；
甘菊药材指纹图谱、系统聚类分析的结果，能够全面的反映洋甘菊的化学成分信息，以及产地、采收期对洋甘菊化学成分的影响，这不仅对于洋甘菊的质量控制与评价具有一定的参考价值，而且为开发洋甘菊相关产品奠定了科学依据，并制定合理的洋甘菊药材质量控制模式；
步骤S02：以二咖啡酰奎宁酸含量、浸膏得率、透明质酸酶活性为指标，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件；确定最优提取条件为：70％乙醇作为提取溶剂，料液比为1:30，回流提取2次，每次提取时间2h；
步骤S03：以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸两种特征成分为指标，并对这两种特征成分进行纯化，确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件；确定最佳纯化条件为：AB-8型大孔吸附树脂，树脂柱径高比为1:6，药液质量浓度为0.20g/mL(相当于原生药)，以2BV/h的吸附速率上样7BV(树脂床体积)后用以5BV/h的流速，1BV水洗去杂质，收集50％乙醇3BV和70％乙醇1BV洗脱液、合并、浓缩、干燥即得洋甘菊抗哮喘活性部位(YGJ)。
优选地，所述步骤S01中的聚类分析包括以下步骤：
步骤S11：采用高效液相色谱技术建立药材HPLC色谱图；
步骤S12：将药材HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，选择一图谱作为参照指纹图谱，时间窗宽度为0.10min，选择中位数法，生成对照指纹图谱；并将其它批次色谱图与参照图谱经多点校正法对色谱峰进行全谱匹配，建立洋甘菊药材的共有指纹图谱，并确定对照指纹图谱R，计算相似度，对不同批次的洋甘菊药材进行相似度评价；
步骤S13：使用SPSS 23.0统计软件，对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，以色谱峰面积作为变量，采用组间平均数联结法，计算夹角余弦距离，确定洋甘菊的适宜产地。
优选地，所述步骤S02中，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件的方法包括以下步骤：
步骤S21：对洋甘菊抗哮喘活性部位透明质酸酶进行体外筛选实验，确定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸为主要活性物质；
步骤S22：使用高效液相色谱法测定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的含量；
步骤S23：对洋甘菊活性部位单因素试验；单因素包括提取溶剂、提取方法、提取次数、提取时间和料液比；
步骤S24：对洋甘菊活性部位进行正交试验：在步骤S23的基础上，采用L9(34)正交试验，对提取溶剂、提取方法、提取次数、提取时间和料液比进行试验，对指标成分峰面积/g、浸膏得率和抗哮喘体外筛选进行综合评价。
优选地，所述步骤S03中确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件的方法，包括以下步骤：
步骤S31：根据洋甘菊活性部位列举若干对该活性部位具有富集功能的大孔吸附树脂；
步骤S32：以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸两种特征成分的含量为指标，测定各个大孔吸附树脂的静态吸附和解析功能的能力，筛选出适合洋甘菊活性部位富集的大孔吸附树脂；
步骤S33：对洋甘菊提取物的影响因素考察，最终确定洋甘菊活性部位纯化工艺的纯化条件。
优选地，所述步骤S33中的影响因素包括上样量、上样浓度、吸附速率、洗脱溶剂和用量。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过系统的分析方法，将洋甘菊中抗哮喘活性成分系统化提取生产，并通过对抗哮喘活性成分提取纯化工艺的最优解，提高对洋甘菊抗哮喘活性成的提取效率，提升生产效率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的流程图；
图2为本发明中12批药材在共有模式下的HPLC指纹图谱；
图3为本发明的聚类分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法，包括以下步骤：
步骤S01：对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，确定洋甘菊的适宜产地；
甘菊药材指纹图谱、系统聚类分析的结果，能够全面的反映洋甘菊的化学成分信息，以及产地、采收期对洋甘菊化学成分的影响，这不仅对于洋甘菊的质量控制与评价具有一定的参考价值，而且为开发洋甘菊相关产品奠定了科学依据，并制定合理的洋甘菊药材质量控制模式；
其中，步骤S01中的聚类分析包括以下步骤：
步骤S11：采用高效液相色谱技术建立药材HPLC色谱图；
需要进一步说明的是：
步骤S11中的HPLC色谱条件为：
色谱柱：Thermo Golden proshell C18(2.1×100mm，1.7μm)；柱温：30℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，测定波长：330nm；流动相：以0.2％甲酸-水溶液(A)和乙腈(B)，采用如下HPLC洗脱条件：
表1流动相比例
Figure GDA0003751782920000061
供试品溶液的制备：
(1)检测波长的选择
前期预实验得知洋甘菊主要含有咖啡酰奎宁酸类和黄酮类，这两类化合物在330nm下均有较强的紫外吸收，因此选用330nm作为HPLC的分析检测波长。
(2)提取溶剂的筛选
因咖啡酰奎宁酸类和黄酮类为中等极性的小分子化合物，据文献黄酮类和咖啡酰奎宁酸类化合物一般都采用70％乙醇溶液作为提取溶剂，因此，选用70％乙醇溶液作为洋甘菊药材供试品溶液的提取溶剂。
(3)供试品溶液的制备
取不同产地、批次的药材粉碎过50目筛，取1g，加入具塞锥形瓶中，分别加入25mL70％甲醇，进行称重，超声(40KH,550W)30min，放冷，再进行称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，按上述色谱条件进行测定并记录各主要色谱峰的峰面积。
步骤S12：将药材HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，选择表2中编号为S5的药材图谱作为参照指纹图谱，时间窗宽度为0.10min，选择中位数法，生成对照指纹图谱；并将其它批次色谱图与参照图谱经多点校正法对色谱峰进行全谱匹配，建立洋甘菊药材的共有指纹图谱，并确定对照指纹图谱R，计算相似度，对不同批次的洋甘菊药材进行相似度评价；
步骤S13：使用SPSS 23.0统计软件，对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，以色谱峰面积作为变量，采用组间平均数联结法，计算夹角余弦距离，确定洋甘菊的适宜产地。
其中，药材来源如下表2所示：
表2药材来源、批号及编号
Figure GDA0003751782920000071
Figure GDA0003751782920000081
如图2所示，将12批洋甘菊药材的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件后，得到HPLC指纹图相似度结果，如下表3、4所示：
表3指纹图相似度结果表
Figure GDA0003751782920000082
表4共有指纹峰的保留时间和峰面积
Figure GDA0003751782920000083
Figure GDA0003751782920000091
Figure GDA0003751782920000101
由相似度结果可知，洋甘菊药材的相似度并不高，原因可能与药材产地不同、药材采收季节不同等多种因素有关。药材的产地、采收季节，对洋甘菊的化学成分有较大影响。
以色谱峰面积作为变量，运用SPSS23.0软件对12批洋甘菊样品进行系统聚类分析。采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，结果如下表5所示：
表5 12批药材之间的余弦值距离
Figure GDA0003751782920000102
Figure GDA0003751782920000111
结合图3所示，对12批药材样品进行聚类分析，结果表明当分类距离为25时，12批药材样品可以分为2类，即S8、S9、S7、S10、S11、S12塔城地区产洋甘菊为一类，S2、S6、S1、S3、S5、S4伊犁地区洋甘菊为一类，说明洋甘菊药材之间差异与相似同时存在，可能由于产地不同(气候、土壤等因素)、采收季节不同导致药材间化学成分存在差异。
步骤S02：以二咖啡酰奎宁酸含量、浸膏得率、透明质酸酶活性为指标，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件；确定最优提取条件为：70％乙醇作为提取溶剂，料液比为1:30，回流提取2次，每次提取时间2h；
其中，步骤S02中，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件的方法包括以下步骤：
步骤S21：对洋甘菊抗哮喘活性部位透明质酸酶进行体外筛选实验，确定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸为主要活性物质；
其中，透明质酸酶体外筛选实验的具体方法如下：
a.药物筛选浓度
提取物配制浓度为50mg/mL的样品母液，进一步稀释成24.8mg/mL的浓度，所用溶剂为蒸馏水。以此浓度加入体系中，样品终浓度为2mg/mL。
b.试剂配制
Buffer缓冲液：溶液A(0.2mol/L醋酸，1.155mL冰醋酸溶于100mL蒸馏水中，取4.8mL)
溶液B(0.2mol/L醋酸钠，2.72g三水合醋酸钠溶于100mL蒸馏水中，取45.2mL)
混合溶液A与B并以水定容至100mL，配置成pH＝5.6的醋酸缓冲液。
用配置好的Buffer缓冲液作为溶剂配置透明质酸酶(现用现配)和透明质酸钠溶液，二者的最终工作浓度分别为1250U/mL和0.5mg/mL。
乙酰丙酮溶液：50mL 1.0mol/L的Na2CO3溶液和3.5mL乙酰丙酮溶液混合均匀(现用现配)。
P-DAB显色剂：0.8g对二甲基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和15mL无水乙醇混合均匀。
CaCl2溶液浓度配置为0.25mmol/L，NaOH溶液浓度配置为0.4mol/L。
阳性药选择地塞米松(Dexamethasone，DXM)，终浓度为10μM；
c.结果计算方法
透明质酸酶抑制率＝(1-(OD样品组-OD样品对照)/(OD酶活组-OD酶活对照))×100％。
步骤S22：使用高效液相色谱法测定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的含量；
a.色谱条件
Thermo Golden proshell C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱；以0.2％甲酸-水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，采用梯度洗脱模式分离，在330nm下采集指标成分的峰面积；柱温设置为35℃，流速设置为0.3mL/min，流动相比例如下表6所示：
表6流动相比例
Figure GDA0003751782920000131
b.对照品溶液的制备
精密称取3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸标准品适量，置于50mL容量瓶中，用60％甲醇超声溶解，定容，摇匀，制成混合标准品溶液，每1mL溶液中含3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸分别为43.3μg/mL和33.5μg/mL。
c.供试品溶液的制备
称取样品粉末(过40目筛)约1.0g，精密称定，置于具塞圆底烧瓶中，精密加入60％乙醇100mL，称定重量，浸泡30min后加热回流40min，取出，放冷，用60％乙醇补足重量，摇匀，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液，即得备用。
d.测定法
分别精密吸取对照品溶液与特定实验条件下获得的提取液各5μL，注入超高效液相色谱仪，测定峰面积，即得。
步骤S23：对洋甘菊活性部位单因素试验；单因素包括提取溶剂、提取方法、提取次数、提取时间和料液比；
e.方法学验证
线性关系考察：精密量取3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸混合标准溶液1、2、3、4、5、6、7mL于10mL量瓶中，加60％甲醇至刻度，摇匀，即得。按步骤S22下的条件进行测定，进样量10μL，以对照品峰面积Y对其标准品的浓度X(μg/mL)进行线性回归。
精密度试验：精密吸取3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸混合标准溶液，连续测定(6次)，进样量10μL，并计算其RSD值。
稳定性试验：精密称取本品适量，按照上述方法制备供试品溶液，每隔2h进行测定，计算其RSD值。
重复性试验：精密称取同一批次样品6份，按照上述方法制备供试品溶液，进行测定，计算药材中3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的含量及其RSD值。
加样回收率：取同批次已知含量(3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸标示量分别为0.173％、0.12％)的药材70mg，精密称定，共6份，置10mL容量瓶中，按照样品中3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸含有量与3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸对照品加入量的比例1:1，精密加入3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸对照品，按供试品溶液制备法制备，按上述方法测定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸含量，计算回收率及其RSD值。
步骤S24：对洋甘菊活性部位进行正交试验：在步骤S23的基础上，采用L9(34)正交试验，对提取溶剂、提取方法、提取次数、提取时间和料液比进行试验，对指标成分峰面积/g、浸膏得率和抗哮喘体外筛选进行综合评价。
其中，洋甘菊活性部位筛选评价综合评价标准为：总黄酮含量占50％，抗哮喘体外筛选指标(透明质酸酶)占50％，即：
洋甘菊活性部位筛选评价综合评分＝[总黄酮含量/最高总黄酮含量]×50％+[抗哮喘体外筛选(透明质酸酶)/最大抗哮喘体外筛选(透明质酸酶)]×50％。
提取工艺评价指标采用综合评分，其中以指标成分(3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸)峰面积/g占为30％，浸膏得率占30％，抗哮喘体外筛选指标(透明质酸酶)占40％，即：
提取工艺评价指标综合评分＝[(指标成分峰面积/g)/最高(指标成分峰面积/g)]×30％+[浸膏得率/最高浸膏得率]×30％+[抗哮喘体外筛选/最高抗哮喘体外筛选]×40％。
步骤S03：以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸两种特征成分为指标，并对这两种特征成分进行纯化，确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件；确定最佳纯化条件为：AB-8型大孔吸附树脂，树脂柱径高比为1:6，药液质量浓度为0.20g/mL(相当于原生药)，以2BV/h的吸附速率上样7BV(树脂床体积)后用以5BV/h的流速，1BV水洗去杂质，收集50％乙醇3BV和70％乙醇1BV洗脱液、合并、浓缩、干燥即得洋甘菊抗哮喘活性部位(YGJ)。
其中，步骤S03中确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件的方法，包括以下步骤：
步骤S31：根据洋甘菊活性部位列举若干对该活性部位具有富集功能的大孔吸附树脂；
步骤S32：以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸两种特征成分的含量为指标，测定各个大孔吸附树脂的静态吸附和解析功能的能力，筛选出适合洋甘菊活性部位富集的大孔吸附树脂；
步骤S33：对洋甘菊提取物的影响因素考察，最终确定洋甘菊活性部位纯化工艺的纯化条件。
其中，步骤S33中的影响因素包括上样量、上样浓度、吸附速率、洗脱溶剂和用量。
洋甘菊活性部位的制备：
取洋甘菊全草4kg，70％乙醇回流提取2次，每次2h，料液比1:30，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加水稀释至0.20g/mL(相当于原生药)的药液质量浓度。
供试溶液含量测定：
量取1mL稀释液滤过0.22μm微孔滤膜，测量3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的含量。
树脂处理：
用95％乙醇浸泡10种大孔树脂2-4h，排出乙醇后，用蒸馏水反复冲洗至树脂在试管中不显浑浊为止，再用超净水充分淋洗树脂至无醇味，进行抽滤；
大孔吸附树脂吸附率和解析率的计算方法：
吸附率(％)＝(A0-A流)×100/A0；
解吸率(％)＝A解×100/(A0-A流)；
“A0”为原液中指标成分的峰面积；“A流”为流出液中指标成分的峰面积；“A解”为解吸液中指标成分的峰面积。
树脂的筛选：
称取10种已处理好的大孔吸附树脂各2g，加30mL洋甘菊提取液，置于摇床，振摇(25℃,87r/min)2h，放置10h，抽滤，测定指标成分的峰面积。滤去提取液后的大孔树脂水洗抽干，加30mL 70％乙醇，振摇(25℃,87r/min)2h，放置2h，进行静态解吸，测定解吸液指标成分的峰面积，计算吸附率和解吸率，结果见表7：
表7 10种大孔树脂静态吸附-解吸情况
Figure GDA0003751782920000171
从表7可以看出，对于指标成分的富集功能，综合考虑各树脂的吸附率和解析率，选择AB-8为最合适的树脂型号。
上样浓度的考察：
将选择的树脂，进行处理，装入树脂床体积为50mL(BV)的树脂柱，3份，分别加入生药浓度为0.20g/mL，0.16g/mL和0.12g/mL的上样液10BV,吸附流速为2BV/h,收集每1BV(50mL)流出液，离心，过滤，进行UPLC测定，计算吸附率，确定上样浓度。
吸附率：(原液峰面积-流出液峰面积)/原液峰面积*100％；
表8洋甘菊提取液药液浓度的考察结果(生药浓度0.20g/mL)
Figure GDA0003751782920000181
表9洋甘菊提取液药液浓度的考察结果(生药浓度0.16g/mL)
Figure GDA0003751782920000182
Figure GDA0003751782920000191
表10洋甘菊提取液药液浓度的考察结果(生药浓度0.12g/mL)
Figure GDA0003751782920000192
从表8、表9和表10可以看出，随着上样浓度的降低，吸附量在持续增加。但是，对于生药浓度为0.16g/mL和0.12g/mL，达到10倍上样体积还未达到饱和。因此，考虑到实际生产，选择上样浓度为0.20g/mL比较合适。
上样量的考察：
根据上样浓度考察”实验结果(见表8)，选择吸附量为90％以上的上样体积作为最终上样量。即，对于生药浓度为0.20g/mL的提取液，最佳上样量为7BV。
吸附速率的考察：
量取洋甘菊提取液(生药浓度为0.20g/mL)400mL，经50mL(径高比为1:6)AB-8型大孔吸附树脂柱吸附,流速分别设计为1BV/h，2BV/h，3BV/h，收集流出液，测定指标成分的峰面积，计算出吸附率，如表11所示：
表11洋甘菊提取液吸附速率的考察结果
Figure GDA0003751782920000201
从实验结果看出,当吸附速率成倍增加时，3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的吸附量反而下降。当吸附速率为3BV/h时，吸附量显著减少。根据反复试验发现，吸附流速太慢导致时间消耗严重。因此，考虑到产业化生产，选择吸附率为2BV/h。
水冲洗用量的考察：
将吸附饱和的树脂柱用5BV/h的流速的纯净水洗脱树脂之间未吸附的溶液，收集流出液，测定目标成分的峰面积。结果表明(见表12)，用水量为1BV最合适。
表12水洗量的考察结果
Figure GDA0003751782920000211
洗脱溶剂的考察
分别量取洋甘菊提取液(生药浓度为0.2g/mL)350mL，4份，以2BV/h吸附速度，经50mL(径高比1:6)AB-8型大孔吸附树脂柱4根，进行吸附，再以5BV/h流速用1BV水洗后,分别用50％、70％、95％乙醇溶液洗脱目标化合物,收集洗脱液4BV，测定指标成分的峰面积，计算解吸率,结果见表11。
解吸率(％)＝A解×100/(A0-A流；)
表13洗脱溶剂的考察结果
Figure GDA0003751782920000212
从表13可知，几种溶剂对目标化合物的洗脱效果无明显差别，但洗脱无颜色越来越深。获得纯化物的量为95％乙醇＞70％乙醇＞50％乙醇，导致目标化合物的百分含量降低。因此，需要进一步综合考察洗脱剂和用量。
洗脱溶剂和用量的考察
洋甘菊提取液(生药浓度为0.2g/mL)350mL，以2BV/h吸附速度，经50mL(径高比1:6)AB-8型大孔吸附树脂柱进行吸附,，再以5BV/h流速用1BV水洗后，依次用50％乙醇3BV、70％乙醇3BV、95％乙醇3BV量洗脱目标化合物，测定峰面积，计算解析率。
表14洗脱溶剂的考察结果
Figure GDA0003751782920000221
从表14可知,当用50％乙醇3BV体积洗脱之后，70％乙醇1BV体积就基本上可以把目标化合物洗脱出来。
结论：
本实施例以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸等两种特征成分为洋甘菊活性部位含量测定指标，对10种不同型号和功能的大孔吸附树脂进行静态吸附和解析功能评价，选出适合洋甘菊活性部位富集功能的数值型号AB-8；进一步地，对洋甘菊提取物的影响因素(上样量、上样浓度、吸附速率、洗脱溶剂和用量等)进行考察。最终确定的洋甘菊活性部位制备工艺：AB-8型大孔吸附树脂，0.20g/mL(相当于原生药)的药液质量浓度，1:6是其树脂柱径高比，2BV/h吸附速率时吸附效果最好，在此条件下，上柱量达到7BV(树脂床体积)；吸附好的树脂先用5BV/h的流速的1BV水洗净，再用50％乙醇3BV和70％乙醇1BV洗脱活性部位，合并，浓缩，干燥
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (2)

1.一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S01：对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，确定洋甘菊的适宜产地；
步骤S02：以二咖啡酰奎宁酸含量、浸膏得率、透明质酸酶活性为指标，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件；
步骤S03：以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸两种特征成分为指标，并对这两种特征成分进行纯化，确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件；
其中，所述步骤S01中的聚类分析包括以下步骤：
步骤S11：采用高效液相色谱技术建立药材 HPLC色谱图；
步骤S12：将药材HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》软件，选择一图谱作为参照指纹图谱，时间窗宽度为0.10 min，选择中位数法，生成对照指纹图谱；并将其它批次色谱图与参照图谱经多点校正法对色谱峰进行全谱匹配，建立洋甘菊药材的共有指纹图谱，并确定对照指纹图谱R，计算相似度，对不同批次的洋甘菊药材进行相似度评价；
步骤S13：使用SPSS 23.0 统计软件，对不同批次的洋甘菊药材进行聚类分析，以色谱峰面积作为变量，采用组间平均数联结法，计算夹角余弦距离，确定洋甘菊的适宜产地；
其中，所述步骤S11中的HPLC色谱条件为：
色谱柱：Thermo Golden proshell C18，2.1×100mm，1.7μm；柱温：30℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，测定波长：330nm；流动相：以0.2%甲酸-水溶液A和乙腈B，采用如下HPLC洗脱条件：
表1流动相比例
时间（min） 流动相 A（%） 流动相B（%） 0 95 5 9 95 5 11 89 11 36 89 11 64 75 25 70 50 50
其中，所述步骤S02中，确定洋甘菊活性部位提取工艺的最佳提取条件的方法包括以下步骤：
步骤S21：对洋甘菊抗哮喘活性部位透明质酸酶进行体外筛选实验，确定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸为主要活性物质；
步骤S22：使用高效液相色谱法测定3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸的含量；
步骤S23：对洋甘菊活性部位单因素试验；单因素包括提取溶剂、提取方法、提取次数、提取时间和料液比；
步骤S24：对洋甘菊活性部位进行正交试验：在步骤S23的基础上，采用L9(34) 正交试验，对提取溶剂、提取方法、提取次数、提取时间和料液比进行试验，对指标成分峰面积/g、浸膏得率和抗哮喘体外筛选进行综合评价；
其中，所述步骤S21中的透明质酸酶体外筛选实验的具体方法如下：
a.药物筛选浓度
提取物配制浓度为50 mg/mL的样品母液，进一步稀释成24.8 mg/mL的浓度，所用溶剂为蒸馏水；以此浓度加入体系中，样品终浓度为2 mg/mL；
b.试剂配制
Buffer缓冲液：
溶液A：0.2 mol/L醋酸，1.155 mL冰醋酸溶于100 mL蒸馏水中，取4.8 mL；
溶液B：0.2 mol/L醋酸钠，2.72 g三水合醋酸钠溶于100 mL蒸馏水中，取45.2 mL；
混合溶液A与B并以水定容至100 mL，配置成pH=5.6的Buffer缓冲液；
用配置好的Buffer缓冲液作为溶剂配置透明质酸酶和透明质酸钠溶液，二者的最终工作浓度分别为1250 U/mL和0.5 mg/mL；
乙酰丙酮溶液：50 mL 1.0 mol/L的Na2CO3溶液和3.5 mL乙酰丙酮溶液混合均匀；
P-DAB显色剂：0.8 g对二甲基苯甲醛溶于15 mL浓盐酸和15 mL无水乙醇混合均匀；
CaCl2溶液浓度配置为0.25 mmol/L，NaOH溶液浓度配置为0.4 mol/L；
阳性药选择地塞米松（Dexamethasone，DXM），终浓度为10μM；
c.结果计算方法
透明质酸酶抑制率=（1-（OD样品组-OD样品对照）/（OD酶活组-OD酶活对照））×100%；
其中，所述步骤S22中的色谱条件及具体方法如下：
a.色谱条件
Thermo Golden proshell C18，2.1×100mm，1.7μm色谱柱；以0.2% 甲酸-水溶液和乙腈分别为流动相A、B，采用梯度洗脱模式分离，在330 nm下采集指标成分的峰面积；柱温设置为35℃，流速设置为0.3mL/min，流动相比例如下表6所示：
表6 流动相比例
时间（min） 流动相 A（%） 流动相B（%） 0 95 5 9 95 5 11 89 11 36 89 11 64 75 25 70 50 50
b.对照品溶液的制备
精密称取3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸标准品适量，置于50 mL 容量瓶中，用60%甲醇超声溶解，定容，摇匀，制成混合标准品溶液，每1 mL溶液中含3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸分别为43.3 μg/mL和33.5 μg/mL；
c.供试品溶液的制备
称取样品粉末，过40目筛，取1.0 g，精密称定，置于具塞圆底烧瓶中，精密加入60%乙醇100 mL，称定重量，浸泡 30 min 后加热回流40min，取出，放冷，用60%乙醇补足重量，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得备用；
d.测定法
分别精密吸取对照品溶液与特定实验条件下获得的提取液各5 μL，注入超高效液相色谱仪，测定峰面积，即得；
e.方法学验证
线性关系考察：精密量取3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸混合标准溶液1、2、3、4、5、6、7 mL于10 mL量瓶中，加60%甲醇至刻度，摇匀，即得；按步骤S22下的条件进行测定，进样量10 μL，以对照品峰面积Y对其标准品的浓度X µg/mL进行线性回归；
其中，所述步骤S03中确定最佳的洋甘菊活性部位的纯化工艺的纯化条件的方法，包括以下步骤：
步骤S31：根据洋甘菊活性部位列举若干对该活性部位具有富集功能的大孔吸附树脂；
步骤S32：以3,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-二-O-咖啡酰基奎宁酸两种特征成分的含量为指标，测定各个大孔吸附树脂的静态吸附和解析功能的能力，筛选出适合洋甘菊活性部位富集的大孔吸附树脂；
步骤S33：对洋甘菊提取物的影响因素考察，最终确定洋甘菊活性部位纯化工艺的纯化条件。
2.根据权利要求1所述的一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法，其特征在于，所述步骤S33中的影响因素包括上样量、上样浓度、吸附速率、洗脱溶剂和用量。
CN202011568317.7A 2020-12-25 2020-12-25 一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法 Active CN112763609B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011568317.7A CN112763609B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011568317.7A CN112763609B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112763609A CN112763609A (zh) 2021-05-07
CN112763609B true CN112763609B (zh) 2022-08-26

Family

ID=75695763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011568317.7A Active CN112763609B (zh) 2020-12-25 2020-12-25 一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112763609B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113866293A (zh) * 2021-09-17 2021-12-31 广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院） 一种快速识别分析洋甘菊中化学成分的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107108615A (zh) * 2015-03-04 2017-08-29 吉利德科学公司 Toll样受体调节性4,6‑二氨基‑吡啶并[3,2‑D]嘧啶化合物
WO2020123067A2 (en) * 2018-10-12 2020-06-18 Epc Natural Products Co., Ltd. Sweetener and flavor compositions, methods of making and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107108615A (zh) * 2015-03-04 2017-08-29 吉利德科学公司 Toll样受体调节性4,6‑二氨基‑吡啶并[3,2‑D]嘧啶化合物
WO2020123067A2 (en) * 2018-10-12 2020-06-18 Epc Natural Products Co., Ltd. Sweetener and flavor compositions, methods of making and methods of use thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HPLC法测定洋甘菊药材野生和栽培品种中绿原酸的含量;苏钟慧;《新疆中医药》;20150831;第33卷(第4期);第59-61页 *
HPLC结合化学计量学对不同产地菊花中化学成分的比较分析;黄艳梅 等;《药物分析杂志》;20161130;第36卷(第11期);第1941-1951页 *
一测多评法测定菊花中3个指标成分含量;黄渭 等;《医药导报》;20160630;第35卷(第6期);第645-649页 *
洋苷菊正丁醇提取物对哮喘模型小鼠的作用机理;李茜 等;《中成药》;20171231;第39卷(第12期);第2603-2606页 *
维吾尔药材洋甘菊质量标准研究;轩辕欢 等;《药物生物技术》;20170228;第24卷(第1期);第46-49页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112763609A (zh) 2021-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103816296B (zh) 紫珠总苷提取物及其制备方法和用途
CN107607649B (zh) 一种黑骨藤的检测方法
CN102106918A (zh) 一种同时制备枳实挥发油、总黄酮和总生物碱的方法
CN101703599B (zh) 栀子提取物的检测方法
CN110187044B (zh) 一种银翘解毒口服液的质量检测方法
CN110736799A (zh) 一种中药小儿解感颗粒的质量检测方法
CN101856435B (zh) 一种祖师麻总香豆素提取物的制备方法和含量测定方法
CN110297060B (zh) 一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱
CN113791152B (zh) 一种hplc法测定痫愈胶囊中多种有效成分含量的方法
CN112763609B (zh) 一种针对洋甘菊抗哮喘活性成分筛选提取工艺的研究方法
CN100388940C (zh) 一种小儿高热不退的中药制剂质量控制方法
CN110346494B (zh) 一种同时测定灯盏花中4种有效成分含量的方法
CN103940942B (zh) 一种肠炎宁制剂的检测方法
CN113820422B (zh) 一种白芍总苷指纹图谱检测方法
CN113759056B (zh) 一种半边莲及其制剂的特征图谱及其构建方法
CN106290677B (zh) 冯了性风湿跌打药酒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN111487335B (zh) 小儿感冒舒颗粒指纹图谱的检测方法
CN110687219B (zh) 一种苏黄止咳胶囊指纹图谱的检测方法及其应用
CN103923138B (zh) 一种烟花苷的制备方法及其应用
CN110596263B (zh) 一种辣木提取物指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN109917045B (zh) 一种同时测定制狗脊饮片中5种成分含量的hplc方法
CN101176755B (zh) 槲皮素-7-o-葡萄糖甙在柘木或其制剂检测方法中的应用
CN1830472B (zh) 中药材陈皮水提物的指纹图谱测定方法
CN110967416B (zh) 一种养血清脑水提浸膏中细辛脂素的测定方法
CN112345675B (zh) 同时检测小儿麻甘颗粒中8种活性成分的hplc法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant